Molecular characterization of the interaction of staphylococcal microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules (MSCRAMM) ClfA and Fbl with fibrinogen

doi:10.1074/jbc.M109.062208

.2010年2月26日；285(9):6208-16.

doi:10.1074/jbc。M109.062208。 Epub 2009年12月10日。

识别粘附基质分子（MSCRAMM）ClfA和Fbl的葡萄球菌微生物表面成分与纤维蛋白原相互作用的分子表征

琼·A·盖根¹, Vannakambadi K Ganesh公司, 伊曼纽尔·斯梅兹, 梁晓文, 马格努斯·霍克, 蒂莫西·福斯特

附属公司

采购管理信息： 20007717
预防性维修识别码：项目经理2825416
内政部： 10.1074/jbc。M109.062208

识别粘附基质分子（MSCRAMM）ClfA和Fbl的葡萄球菌微生物表面成分与纤维蛋白原相互作用的分子特征

琼·A·盖根等。生物化学杂志. 2010.

.2010年2月26日；285(9):6208-16.

doi:10.1074/jbc。M109.062208。 Epub 2009年12月10日。

作者

琼·A·盖根¹, Vannakambadi K Ganesh公司, 伊曼纽尔·斯梅兹, 梁晓文, 马格努斯·霍克, 蒂莫西·福斯特

附属

¹爱尔兰都柏林2号三一学院莫恩预防医学研究所微生物系。

采购管理信息： 20007717
预防性维修识别码：项目经理2825416
内政部： 10.1074/jbc。2009年6月208日

摘要

Fbl（来自卢氏葡萄球菌的纤维蛋白原结合蛋白）的配体结合域与金黄色葡萄球菌的ClfA（聚集因子A）具有60%的序列一致性。与最小纤维蛋白原结合区（亚结构域N2N3）相对应的重组Fbl与ClfA结合纤维蛋白原进行比较。Fbl和ClfA通过表面等离子体共振对纤维蛋白原具有非常相似的亲和力。纤维蛋白原中Fbl的结合位点定位于ClfA识别的同一位点的纤维蛋白原γ链的C末端。等温滴定量热法表明，Fbl和ClfA对模拟纤维蛋白原γ链C末端片段的肽具有非常相似的亲和力。该肽还抑制Fbl和ClfA与纤维蛋白原的结合。当用于抑制ClfA和Fbl与固定化纤维蛋白原的结合时，一系列取代的γ-链变异体肽表现得非常相似。与人纤维蛋白原相比，ClfA和Fbl与牛纤维蛋白原结合的亲和力较低，与羊纤维蛋白原的结合不可检测。基于ClfA-γ-肽复合物N2N3亚结构域的晶体结构，对Fbl与纤维蛋白原γ-肽复合体中N2N3子结构域的结构进行了建模。确定了可能参与纤维蛋白原结合的推测结合沟中的残留物。在关键残基中具有丙氨酸取代的Fbl变体蛋白对纤维蛋白原的亲和力降低。因此，Fbl和ClfA通过相似的机制结合纤维蛋白原中的相同位点。

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数字

**图1。**
**纤维蛋白原结合重组蛋白的表面等离子体共振分析。**ClfA或Fbl的重组截断(A类)比较了与固定在CM5传感器芯片表面的纤维蛋白原的结合。通过增加rFbl40–533（15.625–4000 n米) (B类)，rFbl206–533（25–6400 n米) (C类)，rClfA40–559（10–5120 n米) (D类)或rClfA221–559（5–5120 n米) (E类)在表面上。注射开始于0秒，结束于180秒。显示的结果代表了在至少两个不同的纤维蛋白原涂层传感器芯片上进行的三个独立实验。

**图2。**
**rFbl206–533和rClfA221–559与纤维蛋白原γ链肽结合的等温滴定量热分析。**这个*上部面板*显示在将肽滴定到含有rFbl206–533的细胞期间，30°C下每秒释放的焓热(A类)或rClfA221–559(B类). 这个*下部面板*显示了滴定的综合结合等温线，并且最适合于单位点模型。最佳拟合得到的参数如下：对于Fbl，解离常数*K（K）_D类*= 15.0 × 10⁻⁶ 米，焓Δ*H（H）*=−7.7 kcal/mol，摩尔结合化学计量比n个= 1.26; 对于ClfA，解离常数*K（K）_D类*= 9.1 × 10⁻⁶ 米，焓ΔH=−3.7 kcal/mol，摩尔结合化学计量n个= 1.2.

**图3。**
**γ链肽抑制rFbl206-533和rClfA221-559与固定化纤维蛋白原的结合。**重组Fbl206–533（100 n米) (○) 和rClfA221–559（100 n米) (●) 在添加到涂有Fg的微量滴定板的微孔中之前，与浓度增加的Fgγ链肽孵育1小时(A类). 或者，rFbl206–533（60 n米) (B类,*上部面板*)或rClfA221-559（100 n米) (B类,*下部面板*)与γ链肽变体P1–P17（表2）孵育1小时，然后添加到Fg涂层板中。使用抗-His检测结合蛋白₆-过氧化物酶抗体。这些值表示为缺乏抑制剂肽的对照孔的百分比。这个*填充的框*(B类)代表与野生型相比抑制性增强的肽(重量)肽。所示结果为三份样品的平均值。这些实验进行了三次，结果相似。

**图4。**
**rClfA221–559和rFbl206–533与不同物种的纤维蛋白原的结合。**微量板上涂有人(●），牛(○), 小鼠(■), 犬科动物(○), 猫科动物(▴), 猪(▵), 或绵羊(▾) 纤维蛋白原。rFbl206–533浓度增加(A类)或rClfA221–559(B类)已添加。使用抗-His检测结合蛋白₆-过氧化物酶抗体。所示结果为一式三份样品的平均值。这个*误差线*显示标准偏差。结果代表了三个独立的实验。C类，Fbl-N2N3同源模型的带状表示(*粉红色*)覆盖在ClfA的晶体结构上(青色)-γ链肽(洋红)复杂。谷氨酰胺侧链原子(*黄色的*)来自人类序列（晶体结构）和赖氨酸(蓝色)根据绵羊序列（模型），位置407处显示为球和棍子对象。瑟³⁸³和Ile的主链原子³⁸⁴这可能与赖氨酸发生严重的空间位阻，如图所示红色.Thr对应的残渣数³⁸³和Ile³⁸⁴Fbl的*圆括号*.

**图5。**
**γ链肽复合物中Fbl-N2N3亚结构域的结构模型。**纤维蛋白原衍生肽显示为一个由原子类型（碳、，灰色; 氮气，蓝色; 氧气，红色). 残留物Asn²⁷⁰，泰尔³²²，色氨酸⁵⁰⁷和Glu⁵¹⁰在中显示为棒状物体青色和ClfA一样，保守残基Tyr³²²和Trp⁵⁰⁷可以通过堆叠相互作用帮助Fbl锚定肽。Lys的侧链原子⁴⁰⁶和Gln⁴⁰⁷图的特写视图中未显示(*右侧面板*)为了清晰起见。Asn的主链原子²⁷⁰和Glu⁵¹⁰Fbl通过氢键相互作用相互作用，如虚线.

**图6。**
**与纤维蛋白原结合的rFbl206-533突变体的表面等离子体共振。**通过增加rFbl N270A（0.1–25.6μ米) (A类)，rFbl E510A 206–533（0.1–25.6μ米) (B类)，rFbl W507A（0.03125–16μ米) (C类)或rFbl Y322A（0.25–16μ米) (D类)在表面上。注射在0s开始，在180s结束。所示结果代表了在两种不同的纤维蛋白原涂层传感器芯片上进行的两个独立实验。

**图7。**
**抗Fbl区域A和抗ClfA区域A抗体的交叉反应性。**微滴度孔涂有rClfA221–559（250 n米) (●) 或rFbl206–533（250 n米) (○). 增加多克隆兔抗Fbl区域A抗体的稀释度(A类)或多克隆兔抗ClfA区域A(B类)将抗体添加到微孔中。用过氧化物酶偶联山羊抗兔IgG抗体检测结合抗体。所示结果为三份样品的平均值。这个*误差线*显示标准偏差。为了对与鼠单克隆抗体12-9结合的rClfA221–559和rFbl206–533进行表面等离子共振分析，抗体被兔抗鼠Fc抗体捕获在CM5传感器芯片表面。相同浓度（100 n米)rClfA221–559和rFbl206–533的(C类). 注射开始于130秒，结束于430秒。

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