Identification of the Staphylococcus aureus MSCRAMM clumping factor B (ClfB) binding site in the alphaC-domain of human fibrinogen

doi:10.1099/mic.0.2007/010868-0

.2008年2月；154（第2部分）：550-558。

doi:10.1099/mic.0.2007/010868-0。

人纤维蛋白原αC区金黄色葡萄球菌MSCRAMM聚集因子B（ClfB）结合位点的鉴定

伊芙琳·J·沃尔什¹, 海伦·米亚洛维奇¹, 奥列格·五·戈昆², 蒂莫西·福斯特¹

附属公司

¹爱尔兰都柏林2号三一学院莫恩预防医学研究所微生物系。
²美国北卡罗来纳大学教堂山分校Brinkhous-Bullitt大楼CB#7525病理学和实验医学系，邮编：27599-7525。

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人纤维蛋白原αC结构域中金黄色葡萄球菌MSCRAMM聚集因子B（ClfB）结合位点的鉴定

伊芙琳·J·沃尔什等。微生物学（阅读）. 2008年2月.

.2008年2月；154（第2部分）：550-558。

doi:10.1099/mic.0.2007/010868-0。

作者

伊芙琳·J·沃尔什¹, 海伦·米亚洛维奇¹, 奥列格·五·戈昆², 蒂莫西·福斯特¹

附属公司

¹爱尔兰都柏林2号三一学院莫恩预防医学研究所微生物系。
²美国北卡罗来纳大学教堂山分校Brinkhous-Bullitt大楼CB#7525病理学和实验医学系，邮编：27599-7525。

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摘要

金黄色葡萄球菌的聚集因子B（ClfB）与细胞角蛋白10和纤维蛋白原结合。在这项研究中，人类纤维蛋白原的结合位点定位在Aalpha-chain的C末端的一个短区域。ClfB仅在配体亲和印迹和用纯化的重组纤维蛋白原链的固相测定中与纤维蛋白原的Aalpha链结合。含有野生型Bβ-和γ-链的纤维蛋白原变体，但缺失了252-610个Aalpha-链的C末端残基，不支持表达ClfB的金黄色葡萄球菌的粘附。对重组Aalpha-chain的一系列截短突变体进行测试，以确定其支持金黄色葡萄球菌Newman ClfB（+）粘附的能力，从而使结合位点定位于Aalpha-chain C末端内未折叠的柔性重复序列的短片段。重组Aalpha-chain重复序列5中的两个氨基酸替换证实了这一点，这不支持Newman ClfB（+）的粘附。位于A结构域N2和N3区域之间的假定配体结合沟中的氨基酸替换（N256和Q235）的表达ClfB的乳酸乳球菌突变体在粘附固定化纤维蛋白原和细胞角蛋白10方面存在缺陷，表明这两种配体结合到相同或重叠的区域。

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数字

**图1。**
纤维蛋白原的结构。Fg由两个相同的二硫键亚基组成，每个亚基由三条不相同的多肽链组成，αα，Bβ和γ.Fg可分为四个主要区域，中央E区域、两个相同的末端D区域和αC域。这个αC结构域（残基221-610）包含两个不同的区域，一个紧凑的C末端半区和一个无序NH₂-端子半或连接器区域。

**图2。**
ClfB与Fg A结合α-链条。（a）配体亲和力印迹。人类Fg通过SDS-PAGE分离并用考马斯蓝染色（第1道），或转移到PVDF膜上并用rClfB 45–542（第2道）或rClfA 220–559（第3道）进行探测。用抗Clf多克隆抗血清检测rClf蛋白的结合。（b）遵守*金黄色葡萄球菌*纽曼CIFA⁻固定化重组Aα-（•），Bβ- (▴) 或γ- (▾) Fg.（c）链的粘附*金黄色葡萄球菌*纽曼CIFA⁻(○) 和Newman ClfA⁻ClfB公司⁻（•）固定化重组Aα-Fg链。细胞生长到指数期和悬浮液（1×10⁸c.f.u.）加入到孔中。结晶紫染色法检测粘附菌。实验进行了两次，结果相似，数值代表平均值±标准偏差共有三口井。

**图3。**
抑制*金黄色葡萄球菌*纽曼CIFA⁻对重组A的粘附α-链由rClfB 197–542。涂有Fg rA的ELISA板α-链1–625与rClfB 197–542的浓度增加一起孵育1 在室温下放置h。纽曼CIFA⁻细胞生长到指数期（1×10⁸ 将c.f.u.）添加到微孔中，用结晶紫染色检测粘附细菌。这些值表示三口井的平均值。

**图4。**
结合天然和突变Fg。（a）粘附*金黄色葡萄球菌*纽曼CIFA⁻细胞固定化天然Fg（•）或突变Fg Aα251 (○). 指数相电池（1×10⁸ 将c.f.u.）添加到微孔中，用结晶紫染色检测粘附细菌。（b） rClfB 45–542与天然Fg（•）或突变Fg A的结合α251 (○). 实验进行了两次，结果相似，数值代表平均值±标准偏差共有三口井。

**图5。**
利用重组A定位Fg中ClfB结合位点α-链截断。（a）遵守*金黄色葡萄球菌*Newman ClfA公司⁻固定化重组Fg Aα-链截断，rAα232–625（⧫）和rAα1–283 (□). （b） Newman ClfA的遵守⁻至rAα367–574 (□), 注册会计师α367–625 (▴) 和rAα315–574 (▾). 增加重组体浓度α-链结构固定在ELISA板和指数期细胞（1×10）上⁸ c.f.u.）加入到井中。结晶紫染色法检测粘附菌。这些值代表平均值±标准偏差共有三口井。

**图6。**
显示组织结构的示意图α人类Fg的C结构域（a）无序NH₂-末端半部分（残基221-391）由43个氨基酸片段和10个13残基串联重复序列组成。重组Aα-本研究中使用的链蛋白用线条表示，与截断或删除的变体相对应。（b）的N-末端部分的氨基酸序列αC域。十个串联重复从T264开始，以正常和粗体交替显示。

**图7。**
ClfB-结合位点在细胞的串联重复区的定位α使用重组A的Fg的C结构域α-链缺失。增加重组体浓度α-链结构固定在ELISA板上。指数相Newman ClfA⁻电池（1×10⁸ 将c.f.u.）添加到微孔中，用结晶紫染色检测粘附细菌。误差条表示三个重复的标准偏差。实验进行了两次，结果相似。

**图8。**
遵守*金黄色葡萄球菌*纽曼CIFA⁻细胞固定化重组Fg Aα-（•），AαS317P-(○) 和Aα-T322P-(▴) 链。增加重组体浓度α-链结构固定在ELISA板上。指数相Newman ClfA⁻电池（1×10⁸ 将c.f.u.）添加到微孔中，用结晶紫染色检测粘附细菌。条形代表三个重复的标准偏差。实验进行了两次，结果相似。

**图9。**
Fg绑定*乳杆菌*ClfB公司⁺和*乳杆菌*ClfB突变体。*乳杆菌*ClfB公司⁺(▴),*乳杆菌*氯氟化硼Q235A(○),*乳杆菌*ClfB N526A（•）和*乳杆菌*pNZ8037（新西兰8037）(▿) 用nisin诱导后生长到固定相。洗涤培养物与涂有Fg（10）的ELISA板的粘附性微克毫升⁻¹)结晶紫染色评价；这些值代表平均值±标准偏差共有三口井。

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1. Burton，R.A.，Tsurupa，G.，Medved，L.&Tjandra，N.（2006年）。通过NMR鉴定重组牛纤维蛋白原αC结构域片段内的有序致密结构。《生物化学》45，2257–2266。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Cierniewski，C.S.&Budzynski，A.Z.（1992）。α-干扰素参与纤维蛋白凝块形成。单克隆抗体的影响。生物化学31，4248–4253。-公共医学
1. 科尔，A.M.、塔克，S.、奥伦，A.、吉冈，D.、金，Y.H.、帕克，A.和甘兹，T.（2001）。金黄色葡萄球菌鼻携带的决定因素。临床诊断实验室免疫学8，1064–1069。-项目管理咨询公司-公共医学
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