Oncol Lett公司。2017年6月；13(6): 4109–4116.
DNA拓扑异构酶IIα和Ki67是肝细胞癌患者的预后因素
,* ,* , , , , ,和
易曹
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
瑞生可
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
王少虎
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
徐竹
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
陈建伟
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
朝皇
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
易江
中华人民共和国福建省福州市福州总医院肝胆外科350025
吕丽芝
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
中国福建省福州市福州总医院肝胆外科，邮编350025
*平均出资
2016年2月20日收到；2017年2月7日接受。
摘要
本研究旨在确定DNA拓扑异构酶IIa（TopoIIα）和Ki67在肝细胞癌细胞（HCCs）中的意义。本研究包括353例HCC患者。采用χ2测试。对所有变量进行Cox多元比例风险回归分析和Kaplan-Meier分析，以得出与总生存率（OS）/无复发生存率（RFS）相关的风险估计，并控制混杂因素。肿瘤细胞核中检测到TopoIIα和Ki67。TopoIIα组35.7%的细胞高表达，这与肿瘤结节转移分期、肿瘤大小和α-胎蛋白水平有关。Ki67组37.1%的细胞高表达，这与肿瘤结节转移分期、肿瘤大小和α-甲胎蛋白水平有关。肝癌中TopoIIα和Ki67的表达水平之间存在相关性（r=0.444）。多变量分析表明，TopoIIα高表达是RFS[危险比（HR），2.002；95%置信区间（CI），1.429–2.806]和OS（HR，2.749；95%CI，1.919–3.939）的预后指标，Ki67高表达是OS的预后指标（HR为1.816；95%CI为1.273–2.589）。与TopoIIα高组相比，TopoII低组的RFS率（55.6 vs.31.7%）和OS率（66.5 vs.23.8%）显著增加。与Ki67高组相比，Ki67低组的OS发生率增加（67.0 vs.26.5%）。TopoIIα和Ki67的表达是肝癌生存的独立预后因素。TopoIIα与Ki67表达呈正相关。
关键词：肝细胞癌，预后，DNA拓扑异构酶IIα，Ki67
介绍
肝细胞癌（HCC）是全球第三大癌症相关死亡原因，男性比女性更常见(1). 据估计，2012年全球782500例新发肝癌病例中，死亡人数为745500人(2). 目前，手术切除是为肝癌患者提供长期生存结果的最佳治疗策略。然而，肝癌的临床表现可能有所不同。在某些患者中，该病的病程具有侵略性，存活数月，而其他患者的临床演变可能相对较慢，在诊断后存活超过5-10年。对HCC发病机制的进一步了解和新生物标记物的鉴定可能为治疗该病的医生提供额外的治疗选择。虽然有人提出一些分子标记物，包括甲胎蛋白（AFP），可能与肝癌的预后有关，但它们的临床应用有限(三–5). 因此，以往的研究侧重于寻找新的肝癌预后和治疗靶点的生物标志物(6–8).
肿瘤细胞的增殖状态是反映肿瘤生物学特性的重要参数，直接影响肿瘤的预后和治疗效果。DNA拓扑异构酶是DNA复制、转录和重组以及染色体致密化和分离所必需的酶(9). 已经描述了两种类型（I和II）DNA拓扑异构酶的几个家族和亚科(9). 人类拓扑异构酶II有两种亚型，分别编码在染色体17q21-22和3p24上的α和β(10,11). TopoIIα对活跃生长的细胞的存活至关重要。酶浓度在细胞增殖期间显著上调，TopoIIα水平在细胞周期中增加，并在G2/M期达到峰值(9). 考虑到前面提到的TopoIIα在细胞分裂中的作用及其在细胞周期G2/M期的表达增加，TopoII a的免疫组织化学染色可能有助于确定细胞增殖，最终恶性转化(9–11). 以前的研究认为TopoIIα是食管鳞癌、乳腺癌、透明细胞肾癌和鼻咽癌患者的预后因素(12–15).
已确定的增殖标记之一是Ki67蛋白，它可能在细胞核内检测到。由于Ki67蛋白存在于细胞周期的所有活跃期（G1、S、G2和有丝分裂），但在静止细胞（G0）中不存在，因此它是确定特定细胞群生长分数的有效标记(16). 在一个多种族乳腺癌患者样本中，Ki67被发现是一个重要的独立预后标志物(17).
已对TopoIIα或Ki67分别进行了多项研究，以探讨其作为肝癌患者生存预后标志物的作用。然而，到目前为止，TopoIIα或Ki67是否影响肝癌患者的长期生存还存在争议。本研究调查了TopoIIα和Ki67的表达，并评估了它们在预测HCC患者预后中的作用。
材料和方法
患者和肿瘤样本
从2003年2月至2012年10月在福州总医院（中国福建）接受肝脏手术切除而无术前化疗的患者中获得HCC肿瘤样本（共353份）。使用国际抗癌联盟肿瘤淋巴结转移（TNM）分类系统(18)为了对切除的标本进行分类，确定了251例Ⅰ/Ⅱ期和102例Ⅲa期标本。组织学分级分为高分化/中分化（n=329）和低分化（n=24）。本研究入选的所有患者均符合以下标准：门静脉无肿瘤血栓；只有一个肿瘤病灶；0–1东部合作肿瘤组手术前评分（肝功能等级Child-Pugh A级；无远处转移、腹水或肝性脑病）；术前未接受癌症治疗，术后病理证实为原发性肝癌；提供完整的临床记录和随访信息；无其他肿瘤病史；根治性切除术。根治性切除定义如下：所有病灶均被切除并经术中超声证实；病理检查阴性；两支后的癌栓均能被切除。排除标准为：活检标本上的肝组织不足，无法进行额外分析，或患者预后的临床数据不足；无乙型肝炎病毒感染史。
临床数据分析人员对肝癌样本中TopoIIα和Ki67的表达水平一无所知，实验室和分析人员没有查看临床数据。本研究方案经福州总医院伦理委员会（中国福州）批准，并获得所有患者的知情同意。
后续手术
2003年2月至2012年10月期间接受肝切除术的患者接受了密切的临床观察，包括腹部CT成像、AFP水平和每隔2-4个月进行一次肝功能检测。随访结束日期为2014年10月1日，中位随访时间为34个月（范围为2-122个月）。通过电话或问卷作为补充方法进行随访。
免疫组织化学（IHC）分析
Schmilovitz-Weiss之前描述的IHC方法等(19)，对于Ki67分析，使用抗Ki67抗体（中国福建麦新生物科技有限公司；克隆号，MID-1；稀释度，1:130）替换抗体来分析Ki67的表达。使用相同的方法分析DNA TopoIIα的表达，使用抗DNA TopoIIα抗体（Maixin Biotechnology Co.，Ltd；克隆号，3F6；稀释度，1:150）代替抗体。
IHC染色的评估
两位病理学家分别对353个染色组织切片（厚度为4µm）进行了评估，之前他们对患者信息一无所知。采用半定量IHC检测法以4分制量表测定TopoIIα蛋白水平，结果如下：无阳性细胞，0<25%阳性细胞，1；25–50%阳性细胞，2个；≥50%阳性细胞，3。分级为0或1的HCC组织样本被判定为TopoIIα低表达，而分级为2或3的HCC样本被视为TopoIIIα高表达。
由于Ki67的表达大多是同质的，根据以下标准，以阳性染色细胞的百分比进行评分：（−）未染色或染色的癌细胞<10%（染色≥10%的癌细胞被确定为阳性）；（+），癌细胞染色10–25%；（++），癌细胞染色26–50%；（+++），癌细胞染色51–75%；（++++）癌细胞染色>75%。具有（−）或（+）Ki67表达水平的HCC组织样本被判断为Ki67低表达；具有（++）、（+++）或（++++）Ki67表达的样品被认为具有高Ki67表达。
统计分析
使用SPSS统计软件（版本20.0；IBM SPSS，美国纽约州阿蒙克）进行分析。数据显示为中值和范围。使用χ分析分类数据2测试或费希尔精确测试。采用Spearman秩相关检验分析TopoIIα和Ki67表达之间的相关性。采用Kaplan-Meier方法评估总生存率（OS）和无复发生存率（RFS），并用对数回归检验检验差异。采用Cox比例风险回归模型和肠段选择计算95%置信区间（CI）的单变量风险比。为了评估TopoIIα和Ki67表达的预后价值，对所有变量进行Cox多元比例风险回归分析，通过单变量分析和肠段选择确定其预后意义。P<0.05被认为表明存在统计学上的显著差异。
结果
人口统计学特征和临床病理数据
本研究队列包括309名男性和44名女性，中位年龄为53岁（13-81岁），肿瘤中位尺寸为4cm（1-26cm）。66.0%的患者血清AFP水平≤400µg/l，34.0%的患者>400µg/ml（正常范围，<20.0 ng/ml）。93.2%的患者肿瘤分化良好/中等，6.8%的患者分化较差；26.1%的肿瘤位于左侧，73.9%位于右侧；71.1%的患者肿瘤TNM分期为I/II，28.9%为IIIa。
Ki67的表达和HCC的临床病理参数见和在肝癌组织的肿瘤细胞核中检测到Ki67的表达(). 在353例肝癌组织中，131例（37.1%）高表达，222例（62.9%）低表达。结果显示Ki67的表达与TNM分期（P=0.014）、肿瘤大小（P=0.0114）和高AFP水平（P=0.004）有关。然而，Ki67与年龄、性别、肿瘤位置或组织学分级没有相关性。
1例肝癌细胞核Ki67染色观察。（A） Ki67在肝癌中的高表达（放大倍数，×200）。（B） Ki67在HCC中的高表达（放大倍数，×400）。1例肝癌细胞核TopoIIα染色观察。（C） TopoIIα在肝癌中的高表达（放大倍数，×200）。（D） TopoIIα在肝癌中的高表达（放大倍数，×400）。肝细胞癌；拓扑异构酶IIα。
表一。
TopoIIα/Ki67表达与患者特征之间的关系（n=353）。
| Ki67表达 | | TopoIIα表达 | |
|---|
|
| |
| |
|---|
| 特性 | 低，n（%） | 高，n（%） | P值 | 低，n（%） | 高，n（%） | P值一 |
|---|
| 年龄 | | | 0.427 | | | 0.218 |
| ≤55年 | 126 (56.8) | 80 (61.1) | | 127 (55.9) | 79 (62.7) | |
| >55岁 | 96 (43.2) | 51 (38.9) | | 100 (44.1) | 47 (37.3) | |
| 性别 | | | 0.373 | | | 0.921 |
| 男 | 197 (88.7) | 112 (85.5) | | 199 (87.7) | 110 (87.3) | |
| 女性 | 25 (11.3) | 19 (14.5) | | 28 (12.3) | 16 (12.7) | |
| 组织学分级 | | | 0.176 | | | 0.489 |
| 分化良好/中等 | 210 (94.6) | 119 (90.8) | | 210 (92.5) | 119 (94.4) | |
| 差异化 | 12 (5.4) | 12 (9.2) | | 17 (7.5) | 7 (5.6) | |
| 血清AFP水平（µg/l） | | | 0.004 | | | 0.017 |
| ≤400 | 159（71.6） | 74（56.5） | | 160 (70.5) | 73 (57.9) | |
| >400 | 63 (28.4) | 57 (43.5) | | 67 (29.5) | 53 (42.1) | |
| 肿瘤位置 | | | 0.641 | | | 0.641 |
| 左侧 | 56 (25.2) | 36 (27.5) | | 56 (25.2) | 36 (27.5) | |
| 右侧 | 166 (74.8) | 95 (72.5) | | 166 (74.8) | 95 (72.5) | |
| TNM阶段 | | | 0.014 | | | 0.009 |
| 我/我 | 168 (75.7) | 83 (63.4) | | 172 (75.8) | 79 (62.7) | |
| IIIa公司 | 54 (24.3) | 48 (36.6) | | 55 (24.2) | 47 (37.3) | |
| 生存 | | | <0.001 | | | <0.001 |
| 已故 | 72 (32.4) | 81 (61.8) | | 71（31.3） | 82（65.1） | |
| 活着 | 150 (67.6) | 50 (38.2) | | 156 (68.7) | 44 (34.9) | |
| 肿瘤大小 | | | 0.014 | | | 0.001 |
| ≤5厘米 | 143 (64.4) | 67 (51.1) | | 150 (66.1) | 60 (47.6) | |
| >5厘米 | 79 (35.6) | 64 (48.9) | | 77 (33.9) | 66 (52.4) | |
肝癌组织中肿瘤细胞核中也检测到TopoIIα的表达(;). 在353个HCC组织中，126个组织（35.7%）表现出高表达，227个组织（64.3%）表现出低表达。与Ki67的表达模式类似，TopoIIα与TNM分期（P=0.009）、肿瘤大小（P=0.001）和AFP水平（P=0.017）相关，而TopoIIβ与年龄、性别、肿瘤位置或组织学分级无相关性。
TopoIIα与肝癌中Ki67的表达相关
IHC结果显示TopoIIα表达率与Ki67呈正相关（Spearman相关系数，r=0.444；P<0.001）。
RFS公司
生存分析结果见和和在本研究中，研究队列中患者的5年RFS率为47.2%。在观察期间，171（48.4%）名患者发生肿瘤复发。正如预测的那样，肿瘤大小（HR，1.933；95%CI，1.429-2.613；P<0.001）、TNM分期（HR为2.843；95%CI为2.088-3.871；P<0.001用单因素分析方法研究肿瘤复发的发展。通过对单变量分析中显著的所有因素进行多变量分析，独立的预后指标为TNM分期（HR，3.757；95%CI，2.033–6.945；P<0.001）和TopoIIα（HR为2.002；95%CI为1.429–2.806；P<0.001）。与TopoIIα高组相比，TopoII低组的RFS率显著增加（55.6%对31.7%；P<0.001）。
Kaplan-Meier生存曲线显示（A）TopoIIα高组的总生存率下降，（B）无复发生存率下降，（C）Ki67高组的总生存率下降。拓扑异构酶IIα。
表二：。
| 特性 | 单变量分析，HR（95%CI） | P值 | 多元分析，HR（95%CI） | P值 |
|---|
| 年龄 | | 0.322 | | |
| ≤55年 | 1 | | | |
| >55岁 | 0.848 (0.612–1.175) | | | |
| 性别 | | 0.183 | | |
| 男 | 1 | | | |
| 女性 | 0.688 (0.397–1.193) | | | |
| 组织学分级 | | 0.157 | | |
| 差异化程度高/中等 | 1 | | | |
| 差异化 | 1.730 (0.810–3.693) | | | |
| 肿瘤位置 | | 0.822 | | |
| 左侧 | 1 | | | |
| 右侧 | 0.959 (0.664–1.384) | | | |
| 血清AFP水平（µg/l） | | 0.284 | | |
| ≤400 | 1 | | | |
| >400 | 1.198 (0.861–1.558) | | | |
| TNM阶段 | | <0.001 | | 0.599 |
| 一/二 | 1 | | 1 | |
| IIIa公司 | 2.265 (1.638–3.131) | | 1.137 (0.704–1.836) | |
| 肿瘤大小 | | <0.001 | | 0.014 |
| ≤5厘米 | 1 | | 1 | |
| >5厘米 | 2.472 (1.794–3.406) | | 1.821（1.129–2.937） | |
| Ki67表达 | | <0.001 | | |
| 低 | 1 | | | |
| 高 | 2.892 (2.093–3.995) | | | |
| TopoIIα表达 | | <0.001 | | |
| 低 | 1 | | | |
| 高 | 3.804 (2.741–5.278) | | | |
| TopoIIα-Ki67表达 | | <0.001 | | <0.001 |
| TopoIIα（低）或Ki67（低） | 1 | | 1 | |
| TopoIIα（高）和Ki67（高） | 4.264 (3.030–6.000) | | 3.569 (2.518–5.059) | |
表三。
| 特性 | 案例，n（n=353） | 5年操作系统，% | P值 |
|---|
| 年龄 | | | 0.319 |
| ≤55年 | 206 | 51 | |
| >55岁 | 147 | 54.1 | |
| 性别 | | | 0.178 |
| 男 | 309 | 51.4 | |
| 女性 | 44 | 59.1 | |
| TNM阶段 | | | <0.001 |
| 一/二 | 251 | 61.7 | |
| IIIa公司 | 102 | 29.3 | |
| 肿瘤位置 | | | 0.821 |
| 左侧 | 92 | 59 | |
| 右侧 | 261 | 50.9 | |
| 组织学分级 | | | 0.150 |
| 良好/中等分化 | 329 | 51.5 | |
| 差异化 | 24 | 63.1 | |
| 血清AFP水平（µg/l） | | | 0.281 |
| ≤400 | 233 | 53.7 | |
| >400 | 120 | 49.8 | |
| 肿瘤大小 | | | <0.001 |
| ≤5厘米 | 210 | 65.7 | |
| >5厘米 | 143 | 33.5 | |
| TopoIIα表达 | | | <0.001 |
| 低 | 227 | 66.5 | |
| 高 | 126 | 23.8 | |
| Ki67表达 | | | <0.001 |
| 低 | 222 | 67 | |
| 高 | 131 | 26.5 | |
| TopoIIα-Ki67表达 | | | <0.001 |
| TopoIIα（低）或Ki67（低） | 270 | 61.9 | |
| TopoIIα（高）和Ki67（高） | 83 | 18.2 | |
操作系统
在本研究中，研究队列中患者的5年OS率为52.3%。单变量分析显示，肿瘤大小（HR，2.472；95%CI，1.794-3.406）、TNM分期（HR为2.625；95%CI为1.638-3.131）、TopoIIα（HR 3.804；95%CI 2.741-5.278）和Ki67（HR 2.829；95%CI 2.093-3.995）是OS的不良预测因素，而年龄、性别、组织学分级、，肿瘤位置和血清AFP水平对OS无预后意义。多因素分析表明，TNM分期（HR，3.757；95%CI，2.033–6.945）、TopoIIα（HR为2.749；95%CI为1.919–3.939）、肿瘤大小（HR值为1.938；95%CI值为1.203–3.124）和Ki67（HR的1.816；95%CI的1.273–2.589）是独立的预后指标。与TopoIIα高组相比，TopoII低α组的OS率显著增加（66.5%对23.8%；P<0.001）。与Ki67高组相比，Ki67低组的OS发生率也显著增加（67.0%对26.5%；P<0.001）。
讨论
肝癌是人类常见的恶性肿瘤，死亡率很高(20,21). 由于肝癌患者的巨大异质性，手术后的预后可能不同，目前的临床病理因素，包括AFP、TNM分期和肿瘤大小，无法准确预测所有肝癌患者的预后(22). 因此，迫切需要寻找新的肝癌预后和治疗靶点的生物标记物。
肿瘤细胞的增殖状态是反映肿瘤生物学特性的重要参数，直接影响肿瘤的预后和治疗效果(16). TopoIIα和Ki67是正常组织和肿瘤组织中细胞增殖的标志物；它们的表达水平可用作预测参数(9,16).
已经确定Ki67蛋白是一种传统的增殖标志物，各种研究已经探索了Ki67标记指数的预测价值(17,23–27). Ki-67与多种癌症类型（包括乳腺癌、垂体腺瘤、喉癌、肾上腺皮质癌、卵巢癌和淋巴瘤）的临床病理特征及其预后意义之间的关系已被研究，结果相似(17,23–27). 这些先前的研究表明，Ki67蛋白的表达与更高的肿瘤分期相关，强调了Ki-67作为预后参数的重要性。
对总共4996名患者的54项研究进行的荟萃分析检查了高Ki67对肝癌临床病理特征和患者DFS、RFS和OS的影响(28). 结果表明，高Ki67水平与晚期HCC分期显著相关，包括分化不良、肿瘤大、肿瘤结节增多、转移、肝硬化和静脉浸润，本研究表明Ki67的表达与TNM分期、肿瘤大小和AFP水平有关。通过多变量分析，Ki-67是OS的独立因素，但与RFS无关。此外，与Ki67高组相比，Ki67低组的OS率增加，这可能表明Ki67高表达水平与HCC患者预后不良有关。
与Ki67类似，TopoIIα是另一种增殖标记，因其能够打破DNA双螺旋，被认为在生长依赖性过程中发挥作用，包括DNA复制和染色体分离。TopoIIα参与DNA复制过程和染色体分离，这对细胞生长和发育至关重要(11,9)并可能促进肿瘤细胞生长(29,30). 酶浓度在细胞增殖期间显著上调，并且与细胞增殖有关(31,32). 不同的研究人员已经指出TopoIIα对不同类型癌症的预后价值(33).
在研究肝癌患者时，Wong等(34)确定TopoIIα表达与晚期组织学分级、微血管浸润和早期恶性肿瘤发病相关，TopoII蛋白评分高（3级）与化疗无反应性和早期疾病相关死亡率相关。与他们的研究类似，本研究揭示TopoIIα可能在肝癌组织的肿瘤细胞核中检测到。在本研究的353例肝癌组织中，126例（35.7%）表现出高表达。此外，TopoIIα与TNM分期、肿瘤大小和高AFP水平有关。通过多元分析，TopoIIα仍然是OS和RFS的独立因素。此外，与高TopoIIα组相比，低TopoII a组的OS和RFS率增加。
2001年，Watanuki等(35)据报道，在70例肝癌切除标本中，TopoIIα指数和Ki-67指数之间存在相关性，TopoIIIα较低的患者DFS和OS时间延长。最近，Panvichian进一步阐明了TopoIIα在肝癌中的预后意义等(36)，研究了肿瘤和相应非肿瘤组织中TopoIIα的基因畸变和TopoII a和Ki-67的蛋白表达水平。TopoIIα仅在肿瘤组织中过度表达；在肿瘤或非肿瘤组织中未检测到TopoIIα基因扩增，TopoIIα的过度表达与Ki-67有关。基于先前的研究，本研究调查了肝癌中TopoIIα的表达是否与其他更成熟的增殖标记物（如Ki67）的表达相关。值得注意的是，本研究表明TopoIIα的表达率与Ki67呈正相关，TopoII的存在预示着RFS降低，这与Watanuki早期的工作一致等(35).
本研究因其回顾性而受到限制，本队列中的所有患者均受纳入标准的限制。由于本研究中低分化肿瘤的数量较少，因此对来自不同中心的HCC患者进行更多样本的额外研究可能具有重要价值。
总之，TopoIIα和Ki67可能是肝癌患者接受根治性肿瘤切除术的不利预后因素。TopoIIα和Ki67的检测可能有助于对患者亚组进行分层，并建立靶向治疗。因此，手术后早期对Ki67（高）或TopoIIα（高）患者进行辅助治疗可能会延长生存期。然而，潜在的机制需要进一步研究。
致谢
作者感谢余英浩教授在实验中的技术支持。本研究由福建省自然科学基金重点项目（2014Y0034）和福州总医院创新团队基金（2015Y0026）共同资助。
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