肝细胞癌中鳞状细胞癌抗原和Ki67的组织表达与预后的关系：一项历史性前瞻性研究

摘要

背景

鳞状细胞癌抗原（SCCA）在肝细胞癌（HCC）组织和HCC患者血清中过度表达。我们的目的是评估一系列HCC中的肝SCCA免疫染色，并将其与细胞增殖、凋亡和临床结果相关联。

方法

纳入61例肝癌患者。通过活检（n=17）或手术（切除27例，移植17例）获得肝脏标本。进行AFP、Ki-67、SCCA和TUNEL免疫染色。

结果

83.6%的标本中检测到短链氯化石蜡染色。SCCA染色阴性与死亡率（p=0.026）和Ki67免疫染色评分较高（p=0.017）之间存在统计学显著相关。SCCA阳性染色与分化良好和中等的肿瘤相关（p=0.022）。通过多元logistic回归分析，Ki67和TUNEL分析被发现是SCCA免疫染色阴性的重要独立预测因子。接收器-操作员特征曲线下的面积为0.87。Kaplan-Meier生存分析显示SCCA免疫染色阳性与阴性患者组之间的生存时间存在显著差异（p=0.0106）。Cox比例风险回归分析表明Ki67免疫染色和肝移植或切除与死亡率独立相关。

结论

SCCA在HCC中过表达。SCCA状态与细胞增殖、凋亡和存活有关。SCCA和Ki67染色可以预测存活率。我们的研究结果支持SCCA表达阴性与HCC预后不良的其他标志物之间的潜在关联。需要更多的研究来阐明SCCA在HCC中的作用，并扩大对HCC患者SCCA抗原的认识。

背景

肝细胞癌（HCC）是一个主要的健康问题[1，2]. 其发病率正在增加[三]它已成为肝硬化患者死亡的主要原因[4]. 主要危险因素是慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎[5]. Llove等人报告称，80%的HCC病例发生在肝硬化。肝硬化是最强的诱发因素[6].

许多血清标志物被提出作为检测HCC的一种方法。然而，甲胎蛋白（AFP）、去甲羧基凝血酶（DGCP）和AFP-L3组分的准确性不足以预测其早期诊断[7].

增殖和细胞死亡之间平衡失调是人类肝癌发生中的促肿瘤原理。Ki-67蛋白与活跃的细胞增殖相关，并在细胞周期的所有阶段表达，G0除外，在G2/M中表达最高。

在一项针对肝癌切除患者的研究中，发现肿瘤组织中Ki-67的高表达水平与较高的肿瘤分级有关[8]和早期疾病复发[9]. HCC中死亡与存活之间的平衡失调，主要是由于抗凋亡通路的过度激活，如Bcl-XL、Mcl-1、c-IAP1、XIAP或survivin，这些通路在HCC细胞中过度表达[10].

鳞状细胞癌抗原（SCCA）是服务器行第页蛋白酶在里面抑制器（蛇）[11]. 据报道，在头颈部组织癌和其他上皮癌中存在高水平[12]. 也有报道称其在肝癌组织和肝癌患者血清中过度表达[13]. 据报道，与瘤周组织相比，SCCA在肿瘤组织中过度表达，这表明SCCA在肝癌组织学检测中具有潜在的作用[14].

本研究的目的是评估一系列不同病因和特征的HCC中SCCA免疫染色，并将其与细胞增殖、凋亡和生存相关。

患者和方法

患者队列

这项研究同时在以色列的两个大型移植医疗中心进行：Beilinson医院、Rabin医疗中心、Petah Tiqwa（隶属于特拉维夫大学萨克勒医学院）和耶路撒冷Hadassah希伯来大学医院。在两家医院的病理科进行了HCC患者的搜索。这些患者于2004年1月至2010年12月在贝林森医院肝脏研究所或哈达萨希伯来大学医院肝脏科进行了随访。排除标准是活检标本上的肝组织不足，无法进行额外分析（9），或者患者结果的临床数据不足（3）。最后这些患者是非以色列公民，要么在获得诊断后回国，要么接受了治疗。生存期从组织诊断开始计算，直到患者死亡或终止随访（2011年4月）（以先到者为准）。死亡率数据通过医院计算机从内政部的计算机系统中检索。

所有病例均检测血清AFP。肝超声（US）、计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（如有必要）检测到一个>2cm的病灶，从而确认HCC诊断。用于诊断HCC的福尔马林固定和石蜡包埋的肝脏标本是通过US引导的活组织检查或手术切除或移植的患者获得的。

血清AFP水平

免疫分析用于分析血清样本AFP水平（罗氏诊断），使用模块化分析E170。

组织学评价

石蜡切片采用免疫组织化学方法分析SCCA。通过评估每个病例的整个切片和多个恶性结节的每个结节来获得分数。使用了最高分数。对于SCCA检测，使用针对重组SCCA1的新型多克隆兔抗体（Hepa-Ab，Xeptagen，意大利），并在Sepharose-SCCA1柱上纯化亲和力。

利用SCCA1酶消化或化学合成获得的SCCA1片段进行表位定位研究表明，亲和纯化的多克隆抗体识别位于SCCA1 N端、C端和中心部分的几个表位（通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和Western blot测定）。使用的Hepa-Ab浓度水平为4 mg/mL。用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性后，将切片与一级抗体孵育30分钟。将载玻片放入10 mM柠檬酸钠中的微波炉中加热，阻断正常山羊血清中的非特异性蛋白结合。然后加入生物素化的山羊抗兔（Dako，Copenhagen，Denmark）30分钟。

样品用亲和素-生物素过氧化物酶孵育，并用3,30-二氨基联苯胺四氢氯化物（Dako）和过氧化氢的混合物染色。作为阴性对照，培养切片，忽略一级抗体。在每种情况下，用稀释液或适当的非免疫性IgG替代。使用SCCA的人类皮肤样本作为阳性对照，确认抗体特异性。

每个标本中染色细胞的百分比按0-3:0的比例进行评分，表示阴性染色；1-30%的肝细胞呈1-阳性；2-阳性31-50%；3英寸>50%。免疫反应的分布被记录下来，并分为弥散型、簇状或散在型细胞。

在所有病例中，SCCA半定量免疫反应均由该领域的两名病理学家独立评估。观察者之间的差异<5%。两人同时对不一致的病例进行了重新评估。

在所有免疫组化分析中，坏死区域和组织切片边缘不包括在计数中，以避免可能的假阳性。

AFP免疫组织化学染色

使用全自动系统（美国Ventana Benchmark）对带有甲胎蛋白抗体的石蜡包埋切片进行免疫组化。用蛋白酶预处理切片，并用兔抗人α-1-胎蛋白抗体（A008 DAKO DK-2600 Glostrup Denmark）以1:300的浓度孵育40分钟。

Ki-67免疫组织化学染色

主要抗体是一种小鼠单克隆抗人Ki-67抗原（一种脑炸弹同源物1克隆）。使用全自动系统（美国Ventana Benchmark）对Ki-67石蜡包埋切片进行免疫组化。简而言之，60分钟的热回收是标准的。用Ki-67（M7240，Dako）培养切片，并在抗体稀释液（00-3118，Zymed，San Francisco，CA）中稀释1:100。

仅使用癌细胞的不同核染色通过光学显微镜进行评分，半定量测定分别为无（无免疫染色）、低（10%或更少免疫阳性）或高（>10%免疫阳性细胞）。对切片中所示的整个肿瘤进行评估。

末端脱氧核苷酸转移酶dUTP Nick End标记（TUNEL）分析

通过应用ApoTag原位凋亡过氧化物酶检测试剂盒，使用TUNEL分析（Intergen Co.，纽约州纽约市）鉴定凋亡细胞核。本试验旨在通过使用末端脱氧核苷酸转移酶在3'-OH DNA末端催化结合荧光素-12-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸，从而形成聚合尾巴，特异性检测凋亡细胞的片段DNA。荧光素-12-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸标记的DNA随后可以通过荧光显微镜直接观察。在50±5个视野（原始放大倍数×10）中对DNA片段核阳性的肝细胞进行计数。

所有做法都符合保护人类受试者的制度准则。

统计分析

描述性统计以连续变量的中位数、平均值和标准差（SD）以及类别变量的频率分布给出。由于数据的偏态分布，对血清AFP变量进行对数转换。分类变量采用卡方检验或Fisher精确检验；连续变量的双样本t检验。应用多元logistic回归模型评估与SCCA独立相关的参数。绘制了接收算子特征（ROC）曲线，并使用曲线下面积（C参数）量化最终回归模型的预测能力。采用Kaplan-Meier方法评估生存率。采用对数秩检验分析各组间生存率的差异。还应用了Cox比例风险回归模型。结果以危害比（HR）及其95%置信区间表示。使用SAS for Windows 9.2进行统计分析。

结果

纳入研究的61名患者的平均年龄为63.18±10.60岁；70.49%为男性。30名患者（49.18%）抗-HCV阳性，17名患者（27.87%）HBsAg阳性，4名患者（6.55%）承认酗酒，其余9名患者（16.4%）未发现危险因素。55.9%的患者发现一个肿瘤病变，44.1%的患者发现>1个肿瘤病变。平均肿瘤大小为5.25±3.93cm。36.0%的患者肿瘤分化良好，47.5%的患者肿瘤呈中度分化，8.2%的患者肿瘤的分化较差。治疗方案包括切除术（n=27）、肝移植（n=17）和化学栓塞（n=37）。

SCCA免疫染色

SCCA在肝癌中的表达如图所示151例（83.6%）标本中检出SCCA；移植标本17例（27.87%）；手术切除27例（44.26%），细针超声引导活检17例（27.87%）；6例手术获得的正常人肝脏未检出。在50%的病例中可以清楚地检测到阳性信号，得分为1分，19.7%得分为2分，20.3%得分为3分，表1.

图1

肝癌肝SCCA免疫染色模式.

表1患者的基线特征（n=61）

SCCA在细胞浆中检测到，呈弥漫型。在低分化肿瘤中，观察到典型的簇状粗糙模式（图1). 短链氯化石蜡染色与以下因素之间存在统计学显著相关性：1）死亡率：短链氯化石蜡染色阴性与100%死亡率相关，而短链氯化石蜡染色阳性与64.71%死亡率相关（p=0.026）；2） 肿瘤分化：在95.85%的标本中，SCCA阳性染色与良、中度分化肿瘤相关（p=0.022）；3） Ki67免疫染色：SCCA染色阴性与Ki67评分较高有关（p=0.017）。然而，在年龄、性别、慢性肝病病因学、肿瘤直径和数量、血清AFP、AFP和TUNEL染色（临界）、SCCA染色的类型或水平（表2).

表2两组肝癌患者SCCA免疫染色阳性与阴性的比较

AFP免疫染色

70.7%的标本AFP染色阴性。AFP染色与SCCA染色或任何临床参数之间均未检测到相关性。

Ki67免疫染色

SCCA染色阴性组Ki67平均得分为0.3190，而SCCA染色阳性组为0.1086（p=0.017）。

TUNEL分析

SCCA染色阴性的TUNEL平均得分为0.411±0.30，而SCCA染色阳性的TUNEL平均得分为0.249±0.25（p=0.08）。

SCCA免疫染色阴性的独立预测因子

Ki67和TUNEL染色是SCCA染色阴性的重要独立预测因子。表三表示这些变量的多元logistic回归分析。

表3 SCCA染色阴性的独立预测因子

ROC曲线分析（图2)显示Ki67和TUNEL染色是SCCA染色的良好预测因子。C参数为0.87。

图2

Ki67和TUNEL免疫染色的ROC曲线分析预测SCCA免疫染色阳性或阴性.

Kaplan-Meier生存分析

两个患者组（SCCA染色阳性和阴性）的生存时间存在显著差异（p=0.0106）（图三). SCCA染色阴性患者的平均生存时间为19.13个月，而染色阳性患者的平均存活时间为39.78个月。

图3

Kaplan-Meier分析：阳性和阴性SCCA免疫染色组生存时间的显著差异.

与死亡率无关的变量

发现以下变量与死亡率独立相关：Ki67染色、HBV、肝移植和切除。表4给出了每个参数的Cox比例风险回归分析。

表4与死亡率相关的独立变量

讨论

一些研究报告了SCCA在肝癌组织中的高表达[13，14]. Giannelli等人[13]测量了120名HCC患者、90名肝硬化患者和41名健康受试者的血清SCCA。与肝硬化或正常人相比，肝癌患者的SCCA水平显著升高。SCCA诊断肝癌的敏感性和特异性分别为84%和46%。Guido等人[15]证实了SCCA在HCC中的异常表达，并提供了SCCA过度表达是肝细胞癌转化的早期事件的证据。

尽管肝细胞具有共同的胚胎起源，但肝细胞并不具有鳞状上皮细胞，因此肝癌组织中SCCA的高表达似乎很显著。此外，蛇毒蛋白在肿瘤细胞中的作用表明，SCCA的表达通过抑制凋亡使癌细胞对几种杀伤机制产生耐药性[16]. SCCA抗原代表更晚期器官肿瘤的标志物，如宫颈、肺和口咽[17]. SCCA过度表达与组织学2/3级HCC之间也存在显著相关性，提示SCCA是肿瘤侵袭性的标志物[15].

然而，在我们的HCC患者队列中，SCCA染色阳性与生存率提高相关。我们发现SCCA染色阴性与Ki67评分较高有关。在多元logistic回归分析中，Ki67和TUNEL评分是SCCA染色阴性的显著独立预测因子。先前的一项研究证实，肝癌病变的Ki-67免疫染色与较高的有丝分裂活性相关[18]. D'Errico等人[9]结果表明，肝癌组织中Ki-67表达水平越高，肿瘤分级越高。Nakanishi等人[8]注意到Ki-67表达水平较高与早期疾病复发相关。

细胞凋亡不足与肝脏肿瘤的发展和进展有关。[10]在肝癌中，死亡和存活之间的平衡主要由于抗凋亡信号的过度激活而被破坏。因此，肝癌细胞可能对这些细胞内途径表达更强的生存需求。

我们的研究结果与Trerotoli等人[19]他发现，较强的染色与较小的HCC相关。他们推测，较小而非较大的肝结节中SCCA的比例较高，这表明SCCA在不同的时间产生和释放，可能发生在HCC进展的早期事件中。

我们的研究有几个局限性。这是一项历史研究。由于我们研究的回顾性，我们纳入了肝癌的各种治疗方式。患者队列仅由61名患者组成。当SCCA阳性和阴性染色分开时，组的大小变得更小。尽管如此，应用多元逻辑回归模型评估与SCCA独立相关的参数。绘制ROC曲线，并使用C参数量化最终回归模型的预测能力。

高达40%的HCC不产生AFP[5]. 在我们的研究中，70.7%的标本没有AFP染色。血清AFP、AFP染色与SCCA染色无显著相关性。

我们的研究结果支持对疑似肝脏恶性病变的侵袭性诊断方法，因为病变中SCCA的表达可能提供有关患者预后的重要信息。我们认为，如果仅对可疑肝脏病变的肝硬化患者进行影像学研究，可能会丢失有价值的预后信息。

结论

SCCA在肝癌中过度表达。SCCA的表达与肿瘤分化、细胞增殖和凋亡有关。我们的研究结果证实了SCCA阴性表达与HCC预后不良的其他标志物之间的潜在关联。

需要更多的研究来阐明这种分子的作用，并进一步扩大对肝癌患者SCCA抗原的认识。