mTOR上游的氨基酸信号

摘要

细胞和生物体需要整合来自环境的信息，以确保它们只在有利条件下生长。雷帕霉素（TOR）的高度保守的Ser/Thr蛋白激酶靶点是环境线索的关键整合者，包括营养素和生长因子的可用性以及压力。在营养丰富的条件下，TOR通过刺激生物合成途径（包括蛋白质合成）和抑制细胞分解代谢（例如通过抑制自噬途径）促进细胞生长(方框1). 因此，了解不同刺激是如何被检测到的，以及它们如何向TOR发出信号，对于阐明细胞或生物体是如何生长的至关重要。

方框1

mTORC1与自噬

大型自噬，以下简称自噬是主要的分解代谢细胞降解过程，在营养素缺乏时产生营养物质和能量以维持必要的细胞活动⁴²雷帕霉素复合物1（TORC1）的靶点是所有真核生物自噬的有效阻遏物⁴³哺乳动物TORC1（mTORC1）在饥饿条件下被能量传感器AMP-activated protein kinase（AMPK）和氨基酸信号抑制。在这些条件下，ULK1（unc-51-like kinase 1）发生自磷酸化，磷酸化ATG13L（ATG13-like）和FIP200（FAK家族激酶相互作用蛋白200 kDa），从而形成活性激酶复合体以启动自噬。在营养充足的条件下，mTORC1具有活性，并通过磷酸化ATG13L和ULK1亚基抑制自噬，从而抑制ULK1激酶的活性^44–47（参见图，零件一). ULK1复合物也被AMPK激活，最近发现这种调节被mTORC1介导的Ser757上ULK1的磷酸化所拮抗（REF）。44). mTORC1还通过转录因子EB（TFEB）磷酸化控制溶酶体的生物发生间接调节自噬^48，49，它驱动几个溶酶体和自噬特异性基因的转录。mTORC1和TFEB与溶酶体膜共定位，其中mTORC1介导的磷酸化促进TFEB细胞质固存⁴⁸.

与哺乳动物mTORC1一样，酵母TORC1通过调节Atg1激酶复合物抑制自噬（见图b条). Atg1（哺乳动物ULK1的同源物）与Atg13和Atg17形成活性复合物。氨基酸的存在诱导TORC1介导的Atg13磷酸化。这种磷酸化事件阻止了其与Atg17的结合，从而阻断了自噬。氨基酸饥饿或雷帕霉素治疗对TORC1活性的抑制导致Atg13的抑制和活性三聚体Atg1–Atg13–Atg17复合物的促进。酵母和哺乳动物之间的另一个区别是，TORC1抑制AMPK的酵母同源物，称为Snf1。然而，尚不清楚Snf1是否调节TORC1（参考。50). 在酵母中，Atg1被提议作用于Snf1的下游，但其潜在机制尚待阐明⁵¹.

代谢稳态由mTORC1通过促进生物合成途径和抑制分解代谢自噬来调节，以响应能量和氨基酸的充足。总之，这些过程的调节严格取决于细胞内的能量和氨基酸感应途径。除ULK1复合物外，还需要进一步研究，尤其是哺乳动物，以确定mTORC1是否调节自噬机制的任何方面。尽管自噬产生的氨基酸似乎在mTORC1激活中起作用，但详细说明机制作用的额外研究将非常重要。

哺乳动物TOR（mTOR）是mTORC1复合物的一部分，包含：mTOR的调节相关蛋白（RAPTOR），有助于底物识别；40kDa前富AKT底物（PRAS40；也称为AKT1S1）和含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白（DEPTOR），两者都是mTORC1的负调控因子；SEC13蛋白8（mLST8；也被称为GβL）对哺乳动物具有致死作用，该蛋白对mTORC1具有正向调节作用。一些mTORC1激活刺激物，如生长因子，通过结节性硬化复合体（TSC；包括TSC1和TSC2）发出信号(图1). TSC是小GTPase RHEB（大脑中富集的RAS同源物）的GTPase激活蛋白（GAP），通过促进RHEB·GTP水解来负调控mTORC1，将RHEB转化为其无活性的GDP结合状态。因此，生长因子对TSC的抑制产生了GTP-结合的RHEB，它是mTORC1激酶活性的有效激活剂（在REFS中综述^1，2). mTORC1通过AMP-activated protein kinase（AMPK）介导的RAPTOR和TSC2磷酸化直接和间接受到抑制，以响应低能^三，4.

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图1

mTORC1信号通路

通过多步骤过程，生长因子刺激AKT，AKT反过来磷酸化并抑制结节性硬化复合物（TSC；包括TSC1和TSC2）。TSC作为脑中富含的小GTPase RAS同源物（RHEB）的GTPase激活蛋白（GAP），促进其结合GTP的水解，从而抑制RHEB。抑制TSC后，GTP结合的RHEB水平增加，并可以有效激活哺乳动物雷帕霉素复合物靶点1（mTORC1），可能是在溶酶体。除生长因子外，mTORC1还可受应激、能量状态和氨基酸的调节。压力和能量状态通过TSC调节mTORC1。此外，AMPK（AMP-activated protein kinase）被激活以响应低能状态，并磷酸化RAPTOR（mTOR的调节相关蛋白）和TSC2。这导致mTORC1受到抑制。氨基酸通过TSC非依赖性途径调节mTORC1。多重刺激共同调节mTORC1以控制细胞生长和自噬。DEPTOR，含DEP结构域的mTOR相互作用蛋白；mLST8，SEC13蛋白8对哺乳动物致命；PRAS40，40 kDa Pro-rich AKT基底。

与其他刺激物不同，氨基酸不通过TSC–RHEB发出信号，目前尚不清楚如何感知氨基酸的充足性或限制来调节mTORC1活性。氨基酸似乎是mTORC1激活的最关键信号，因为当氨基酸限制时，生长因子不能有效激活mTOR^5–7.尽管Leu^5，6、谷氨酰胺和精氨酸^6，8–12与mTORC1激活有关，目前尚不确定感测到哪些特定氨基酸激活mTORC1。此外，首次检测到氨基酸的地方仍然很难说，但最近发表的多项研究表明，存在于溶酶体表面的成分。

在这篇进展文章中，我们总结了目前对感知氨基酸并导致溶酶体mTORC1激活，最终导致细胞生长或自噬抑制的蛋白质级联的理解。此外，我们强调还有哪些悬而未决的问题有待解决。

溶酶体上的氨基酸感应

RAG GT酶

RHEB是所有刺激物（包括氨基酸）激活mTORC1所必需的。然而，Tsc2型-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）对氨基酸饥饿仍然敏感，这表明不属于TSC-RHEB通路的其他成分可能参与了这一过程^13，14(图1). 通过筛选发现小RAG GTPases黑腹果蝇在哺乳动物细胞中，是理解mTORC1（REFS）氨基酸信号的重要突破^5，15). RAG GTPases属于RAS超家族；然而，它们具有与其他小GT酶不同的独特特征，例如长羧基末端结构域、缺乏膜靶向序列和形成异二聚体的能力^16，17在哺乳动物中，有四种RAG蛋白：RAGA和RAGB（酵母中的Gtr1⁵²)具有较高的序列相似性和功能冗余；以及酵母中的RAGC和RAGD（Gtr2⁵³)，它们在顺序上也高度相关，并且在功能上是等价的。RAGA或RAGB与RAGC或RAGD形成异二聚体，可能形成四种不同的复合排列¹⁷最近解决了酵母Gtr1–Gtr2异二聚体的晶体结构。该结构揭示了每个蛋白质上发生GTP结合和水解的氨基末端GTPase结构域，以及每个蛋白质上具有Gtr1·GTP–Gtr2·GDP二聚体所需的多重接触的羧基末端结构域^18，19RAG GTPases的二聚体化对mTORC1激活和RAG蛋白稳定性很重要^5，15.

与其他小GTPase一样，RAG GTPase的激活状态由其鸟嘌呤核苷酸状态反映，这由氨基酸调节。具体而言，氨基酸的存在促进了活性复合物构型的形成，其中RAGA和RAGB与GTP结合，RAGC和RAGD与GDP结合（为了简单起见，RAGA/B·GTP–RAGC/D·GDP表示活性复合物，RAGA/B·GDP–RAGC/D·GTP表示非活性复合物）。同样，当氨基酸可用时，GTP-结合Gtr1与GDP-结合的Gtr2的复合物是酵母中的活性形式(图2).

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图2

哺乳动物和酵母中氨基酸诱导的mTORC1激活

氨基酸促进哺乳动物溶酶体（左）RAG GTPase复合体和酵母液泡（右）Gtr1–Gtr2活性构型的形成。在哺乳动物的氨基酸饥饿条件下，雷帕霉素复合物1（mTORC1）的非活性哺乳动物靶点扩散到整个细胞液中。RAG GTPase复合体不活动，RAGA或RAGB加载GDP（RAGA/B·GDP），RAGC或RAGD加载GTP（RAGC/D·GTP）（左上）。在酵母氨基酸缺乏期间，活性TORC1和Gtr1–Gtr2仍局限于液泡膜，但不发生物理相互作用。与氨基酸缺乏条件下哺乳动物的RAG GTPases类似，Gtr1与GDP相结合，Gtr2与GTP相结合，从而产生一种不活跃的复合物（右上图）。液泡H的氨基酸刺激信号⁺-ATP酶（v-ATP酶），这是诱导Raulator的鸟嘌呤交换因子（GEF）活性所必需的（右，底部）。Ragulator作为RAGA/B的全球环境基金，促进RAGA/B.GDP向RAGA/B.GTP的转化。氨基酸还促进RAGC/D·GDP的形成，产生活性RAG复合物RAGA/B·GTP–RAGC/D.GDP。RAGC/D鸟嘌呤核苷酸状态转换的机制尚不清楚。mTORC1与RAG复合物结合，并通过未知机制被招募到溶酶体，在那里被激活。Leucyl-tRNA合成酶（LeuRS）可能作为细胞质中氨基酸Leu的直接传感器，并可能参与mTORC1的激活。在氨基酸充足的酵母中，当Gtr1装载GTP，Gtr2装载GDP时，已经与液泡结合的TORC1被激活（左下图）。据报道，LeuRS也在酵母中的TORC1激活中发挥作用。

在氨基酸充足的条件下，活性RAGA/B·GTP–RAGC/D·GDP复合物被证明直接与mTORC1组分RAPTOR结合，并将mTORC2重新分配到溶酶体。有趣的是，在氨基酸饥饿条件下，mTORC1分散在整个细胞中，但在氨基酸刺激下，重新分布到含有溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）和RAB7（分别是溶酶体和晚期内体的标记）的囊泡中^5，20这表明RAG GTPases在将氨基酸信号转导到mTORC1中发挥作用。与此一致的是，RAG GTPases的敲除消融了mTORC1在氨基酸刺激下对溶酶体的重新定位⁵这种重定位被认为是为了促进mTORC1与RHEB的相互作用，RHEB本身被认为是通过其C末端CAAX（其中C是Cys，A是脂肪族残基，X是末端氨基酸）基序靶向并锚定到溶酶体^5，20通过未知机制导致mTORC1激活。虽然在使用过表达荧光标记RHEB的荧光显微镜研究中已证明RHEB溶酶体定位，但由于缺乏高质量的RHEB抗体，内源性RHEB尚未得到证实。芽殖酵母中的RHEB同源物似乎不是TORC1的上游激活物，这表明TORC1调控的进化存在差异²¹。因为RHEB对生长因子信号作出反应(图1)RHEB对mTORC1的调节可能是在生长因子信号发生的生物体中进化而来的。

与哺乳动物相反，在饥饿和正常条件下，酵母TORC1仍处于液泡中，即酵母的溶酶体等效物。这表明氨基酸诱导的穿梭机制是在高等真核生物中进化而来的²²(图2). 然而，与哺乳动物中的活性RAG复合体一样，Gtr1·GTP–Gtr2·GDP以依赖于核苷酸负载量和氨基酸可用性的方式物理结合活化的TORC1²².

RAG异二聚体的核苷酸结合状态对mTORC1激活至关重要。在饥饿条件下，仅RAGA/B·GTP的过度表达就足以激活mTORC1，这表明是RAGA/B的核苷酸结合状态，而不是RAGC/D的核苷酸连接状态，主要调节mTORCl的激活^22，23然而，RAGC/D的共同表达增强了这一作用，部分原因是RAGC/D稳定了RAGA/B。此外，即使在氨基酸充足的情况下，对氨基酸无反应的非活性突变体RAGA/B.GDP–RAGC/D.GTP复合物也抑制了mTORC1的活性^5，15这些发现表明，氨基酸的存在决定了RAG GTPases的鸟嘌呤核苷酸状态，从而控制了mTORC1向溶酶体的募集及其激活。该模型表明了mTORC1在溶酶体感知多种刺激的机制，例如通过RAG GTP酶感知氨基酸，通过RHEB感知生长因子；氨基酸和生长因子似乎聚集在溶酶体上，以便有效激活mTORC1。

剃须刀

RAG GTPases定位于溶酶体表面，但缺乏脂质锚定基序，这表明RAG结合蛋白可能将其束缚在溶酶体上。事实上，使用RAG-GTPases作为“诱饵”的质谱分析确定了一种称为Ragulator的复合物，该复合物充当溶酶体中异二聚体活性RAG复合物的支架。最初，Ragulator被定义为由p18（编码为灯具1（晚期内体/溶酶体适配器，MAPK和mTOR激活剂1），p14（由编码灯具2)和MP1（MEK-binding partner 1；由编码灯3)²⁰最近，两个额外的成分，C7orf59和HBXIP（乙型肝炎病毒X相互作用蛋白；由灯4和λ5，分别），与p18、p14和MP1一起形成五聚体Ragulator复合物²⁴.

但是Ragulator是如何将RAG GTPases和mTORC1连接到溶酶体的？Ragulator和RAG GTPase通过p18连接在溶酶体上，p18通过其肉豆蔻酰化和棕榈酰化残基与膜结合^20，24Ragulator组分的耗尽破坏了RAG GTPase和mTORC1溶酶体定位，从而使mTORC2活化，这证实了这种复合物在将RAG和mTORC 1连接到溶酶体中的重要性^20，24.

在酵母中还没有发现促性腺激素同源物；然而，TORC1是位于液泡膜上的自我复合体（EGOC）的组成部分(图2). EGOC由Ego1、Ego3、Gtr1和Gtr2组成。虽然Ego3的确切功能尚未明确，但研究表明，与p18一样，Ego1是一种棕榈酰化和肉豆蔻酰化蛋白，在液泡膜上维持Gtr1–Gtr2和TORC1^25，26需要记住的一点是，氨基酸调节TORC1与EGOC的结合，类似于哺乳动物中的mTORC1–RAG–Ragulator结合。然而，与哺乳动物不同的是，在缺乏氨基酸的情况下，mTORC1分散在细胞中，在酵母中，即使在饥饿条件下，TORC1仍保持在液泡中。无论不同的锚定机制如何，似乎哺乳动物溶酶体上的mTORC1定位或酵母液泡上的TORC1对促进其功能和激活至关重要^1，27.

尽管EGOC和Ragulator之间缺乏序列相似性，但整体结构保持明显，因为Ego3在结构上与MP1和p14（REFS）相似^26，28). MP1、p14、HBXIP和Gtr1–Gtr2的高分辨率晶体结构也确定了每个蛋白质中存在障碍域^29–31结构预测表明，RAG GTPases和C7orf59（REFS）的C末端结构域中存在障碍域^18，24). 因此，RAG–Ragulator复合物的每个成分都包含一个路障结构域，总共六个，锚定蛋白p18除外，它是路障结构区蛋白的支架。此域的功能目前未知；然而，在向mTORC1发送氨基酸信号的过程中，它可能为蛋白质-蛋白质相互作用提供特定的结构元素。确定可能参与mTORC1氨基酸信号传导的其他蛋白质是否包含该结构域将是令人感兴趣的。

最近，五聚体Ragulator被确定为RAGA/B的鸟嘌呤交换因子（GEF），促进了GTP与GDP的交换，并随后激活了RAG复合体，这对mTORC1溶酶体定位和激活至关重要²⁴将Ragulator确定为RAG GTPases的全球环境基金提供了氨基酸传感和RAG鸟嘌呤核苷酸负载之间的关键联系(图3). 整个五聚体Ragulator复合体对于全球环境基金针对RAGA/B的活动是必要的；最初确定的三聚体Ragulator或每个单独的Ragulattor组分本身对RAGA/B没有显示出GEF活性。令人惊讶的是，Ragulater不包含与任何已知GEF催化结构域同源的结构域。无核苷酸而非结合核苷酸的RAGA/B优先与Ragulator相互作用，这是在其他GEF–GTPase相互作用中发现的一个共同特征²⁴与对RAGA/B的影响不同，Raulator对RAGC/D没有表现出任何GEF活性，这可能是由于GTP酶之间的开关I和开关II区域的差异，已知它们作为GEF-GTP酶相互作用的识别基序。GDP与RAGC/D的快速内在分离也得到了证明，可能表明不需要全球环境基金²⁴.

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图3

溶酶体处的mTORC1激活

氨基酸被认为积聚在溶酶体腔内，并向液泡H发出信号⁺-ATP酶（v-ATP酶）通过“内-外”机制。v-ATP酶控制RAG-GTPase–Ragulator结合，因此控制Ragulator-guanine exchange factor（GEF）活性以及RAGA和RAGB鸟嘌呤核苷酸负荷（RAGA/B·GTP）。活性RAG复合物（RAGA/B·GTP–RAGC/D·GDP）与雷帕霉素复合物1（mTORC1）的哺乳动物靶点结合，并通过未知机制将其招募到溶酶体中，可能与RHEB（脑中富集的RAS同源物）非常接近。生长因子信号的下游，GTP结合的RHEB有效激活mTORC1。

如前所述，酵母中的Ragulator成分没有明确的同源性。相反，在酵母中，Vam6（哺乳动物液泡蛋白分选39（VPS39）的同源物，促进晚期内体到溶酶体的融合）被鉴定为Gtr1的GEF（参考^22，32). 然而，VPS39似乎不与哺乳动物RAGA/B的全球环境基金相结合，也不起全球环境基金的作用²⁴。酵母中Gtr1和高等真核生物中RAGA的全球环境基金可能存在分歧，尽管考虑到RAGA/B和Gtr1之间的高度序列相似性，这令人惊讶。哺乳动物细胞表达VPS39的同源物，如TGFβ受体相关蛋白1（TGFβRAP1），尚未被评估为潜在的GEF³³因此，读者应该对VPS39作为哺乳动物RAGA/B的全球环境基金的拟议模型持谨慎态度，直到其得到确认。

亮氨酸-tRNA合成酶激活

两个独立的研究小组在哺乳动物和酵母中表明，亮氨酸tRNA合成酶（LeuRS）是氨基酸Leu的直接传感器，并参与mTORC1的激活，尽管这两项研究的机制细节有很大差异^38，39(图2). LeuRS是一种细胞质酶，催化l-Leu依赖ATP连接到其相应的tRNA，是蛋白质合成所必需的。据报道，LeuRS是mTOR上游的关键氨基酸传感器⁴⁰在哺乳动物中，作为对Leu的反应，发现LeuRS易位到溶酶体膜，在那里它与RAGD结合并充当GAP。LeuRS通过其C末端与RAGD的C末端相互作用，这可能对基于Gtr1–Gtr2（REF。38)（见上文）。令人惊讶的是，所提出的GAP活性所需的人LeuRS中的Arg残基在D.黑腹果蝇LeuRS同源，这是意料之外的，因为氨基酸诱导的mTORC1激活在所有真核生物中高度保守。

在酵母中，LeuRS被证明通过阻断GTP水解而不是促进其来调节Gtr1（RAGA/B同源物）的激活。具体而言，LeuRS-编辑结构域（水解错充tRNA Leu）与GTP-结合的Gtr1相互作用并阻断GTP的水解，而这种相互作用是由Leu结合引起的LeuRS构象变化促进的。LeuRS中与Gtr1·GTP相互作用的结构域与哺乳动物中与RAGD相互作用的区域不同。有人提出，LeuRS和Gtr1·GTP之间的结合阻止了未知GAP的进入，从而抑制了GTP水解³⁹.

需要进一步的工作来验证LeuRS在这种情况下的确切作用机制，并确认它确实在mTORC1激活中起作用。此外，与氨基酸内外感应模型相反，LeuRS检测细胞质中Leu的可用性。进一步研究这两种机制（涉及v-ATP酶的溶酶体内外氨基酸感应机制和涉及LeuRS的细胞质氨基酸感应机制）是如何整合的，这一点很重要。添加后10分钟内，放射性标记的氨基酸在溶酶体中积累，而据报道，mTORC1仅在3分钟后被激活^5，34目前尚不清楚在mTORC1被招募到溶酶体之前，是否需要氨基酸在溶酶体中积累，或者是否也存在类似的信号，例如由LeuRS介导的信号，以帮助mTORCl激活。

结论和观点

最近鉴定新溶酶体成分的工作提供了一个模型，即溶酶体中积累的氨基酸通过由内而外的机制向mTORC1发出信号。此外，涉及LeuRS的新研究表明，mTORC1也可能被细胞质中的氨基酸激活^38，39虽然溶酶体上精确的氨基酸传感器尚不清楚，但迄今为止发现的第一个下游靶点是v-ATP酶³⁴.v-ATPase促进Ragulator的GEF活性，导致RAG-GTPase核苷酸交换和激活²⁴激活的RAGA/B·GTP–RAGC/D·GDP复合物结合并将mTORC1从未定义的细胞位置招募到溶酶体，可能与强效的mTORC1-激活剂RHEB非常接近^5，20氨基酸被认为可以将信息传递给RAG GTPases，RAG GTPases直接结合mTORC1并将其重新分配到溶酶体。被TSC下游的生长因子激活的RHEB也被认为位于溶酶体上。这些刺激共同协调激活mTORC1，从而促进细胞生长并抑制自噬。该模型证明了多种刺激如何协同激活溶酶体上的mTORC1。

将Ragulator确定为RAGA/B全球环境基金是一项重要进展，尽管尚未找到GAP。现在需要进一步的工作来确定该途径的其他组成部分。mTORC1负调控因子的进一步表征，如SH3结构域结合蛋白4（SH3BP4）、PAT1和小GTPases ARF和RAB5，将提供重要的信息^23，34，41精确的氨基酸传感器及其位置尚未确定。如果传感器位于溶酶体腔中，是否需要溶酶体酸化才能激活？事实上，许多管腔蛋白的功能依赖于酸性pH值。此外，V₁v-ATP酶亚单位通过未定义的机制促进溶酶体酸化和mTORC1活化。其他报告显示，细胞质酸度增加抑制mTORC1（REFS^36，37). 尽管这与v-ATP酶在mTORC1激活中的作用是一致的，但是溶酶体酸化还是细胞质的pH值调节了mTORC 1？未来的工作无疑将侧重于了解这些机制以及v-ATP酶是如何调节的。例如，调节v-ATP酶的信号可能会潜在地调节mTORC1活性和细胞生长。了解这一途径如何与细胞质中被LeuRS激活的途径整合也很重要。

如果内-外机制成立，氨基酸在溶酶体内积累以向mTORC1发出信号，那么氨基酸从哪里来？溶酶体的内腔是细胞内还是细胞外的氨基酸池？氨基酸是如何进入溶酶体的？溶酶体氨基酸转运体的鉴定将是一项重大进展。

此外，mTORC1易位到溶酶体的确切细节或未知中间产物需要进一步研究。RAG GTPases是否会与溶酶体分离，可能是对氨基酸的反应，并将mTORC1穿梭到溶酶体？或者是否有额外的、未经鉴定的中间体将mTORC1转运到溶酶体的RAG GTP酶，以响应氨基酸？

氨基酸是生命的基础，对促进mTORC1活化至关重要。因此，确定mTORC1激活的分子机制将有助于更好地理解细胞生长和自噬，增强我们对生物学的基本理解，并阐明该途径在疾病中的作用。例如，尽管在涉及TSC的mTORC1激活途径中已鉴定出许多致癌基因和肿瘤抑制因子，但此类蛋白质尚未在氨基酸级联中表征出来。识别额外的调节因子可以阐明这种信号通路在人类发病机制中的作用，特别是在癌症中。

致谢

脚注

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