关于生物变异的多因素RNA-Seq实验的差异表达分析

广义线性模型

GLM是经典线性模型对非正态分布响应数据的扩展(42,43). GLM根据它们的均值-方差关系指定概率分布，例如上面为读取计数指定的二次均值-方差的关系。假设对_克，因此可以计算以下任意值的方差 μ_吉，GLM理论可用于拟合对数线性模型

对于每个基因(32,41). 在这里x个_我是一个协变量向量，用于指定应用于RNA样本的处理条件我、和β_克是一个回归系数向量，通过该向量为基因介导协变量效应克二次方差函数指定负二项GLM分布族。负二项分布的使用等价于处理π_吉伽马分布。

安装GLM

对数似然对系数β的导数_克是X（X）^T型z_克，其中X（X）是带列的设计矩阵x个_我和z_吉 = (年_吉 − μ_吉)/(1+直径_克μ_吉). 系数的Fisher信息矩阵可以写成_克 = X（X）^T型W公司_克X（X），其中W公司_克是标准GLM理论中工作重量的对角矩阵(43). 求β的最大似然估计的Fisher评分迭代_克因此是带有δ = (X（X）^T型W公司_克X（X）)⁻¹ X（X）^T型z_克此迭代通常会增加似然函数，但似然也会降低，表示与所需解的背离。另一方面，始终存在一个步长修饰符α为0 < α < 1这样增加了可能性。选择α以便在每次迭代时都如此，这称为线搜索策略(44,45).

Fisher的打分迭代可以看作是一种近似的Newton-Raphson算法，Fisher信息矩阵近似于二阶导数矩阵。线搜索策略可以与正定的二阶导数阵的任何近似值一起使用。我们的实现使用了一个计算方便的近似值。在不失一般性的情况下，可以对线性模型进行参数化，以便X（X）^T型X（X） = 我。如果完成此操作，并且如果 μ_吉也恰好是恒定的我对于给定的基因克信息矩阵大大简化为 μ_克/(1+直径_克μ_克)乘以单位矩阵我将其作为信息矩阵的近似值，带线搜索修改的Fisher评分步骤变为简单的δ = αX（X）^T型z_克，其中乘数 μ_克/(1+直径_克μ_克)已被吸收到步长因子α中。在这个公式中，α不再被约束为小于1。在我们的实现中，每个基因都有自己的步长α，随着迭代的进行，步长α会增加或减少。

Cox–Reid调整后的配置文件可能性

的调整剖面可能性（APL）_克是被处罚的原木

哪里年_克是基因计数的载体克,是估计的系数向量，ℓ（）是log-likelihood函数_克是Fisher信息矩阵。Cholesky分解(46)为计算信息矩阵的行列式提供了一种数值稳定且高效的算法。具体来说，logdet_克是Cholesky因子对角线元素的对数之和R（右），其中_克 = R（右）^T型 R（右）和R（右）为上三角形。矩阵R（右）可以作为标准线性模型拟合中使用的QR分解的副产品获得。在我们的实现中，Cholesky计算是以向量化的方式进行的，对所有基因进行并行计算。

多因素实验的线性模型

线性模型用于描述多因素微阵列实验的方法已经很成熟(18,19). 虽然线性模型与正态分布数据相关，但可以使用GLM分析负二项式计数数据，其方法在所有重要方面都与正态线性模型非常类似。我们假设以解释性协变量表示的预期读取计数为对数线性模型，这些协变量捕获了应用于每个RNA样本的处理条件（“材料和方法”部分）。总库大小N个_我充当抵消在线性模型预测器中，捕获计数对序列深度的依赖性。库大小可以定义为映射读取的总数，也可以根据数据进行估计，以实现不同库之间的某种相对标准化(26).

GLM是非线性模型，必须对每个基因的参数进行迭代估计。提出了一种直观的迭代计算算法来拟合GLM(42)，并且几乎所有可用的GLM软件都使用此算法。每个迭代都可以看作是一个最小二乘回归，其中每个计数与总CV成反比²上述定义(43,45). 必须重复模型拟合过程，直到实现收敛。先前GLM对RNA-Seq数据的应用已经对标准单变量GLM软件进行了基因调用。虽然常用的GLM算法对于单变量数据相当可靠，但不能保证它能够成功收敛，特别是对于非常小或拟合不良的数据集。在RNA-Seq环境中，通常的GLM算法经常失败，对于我们的目的来说不够可靠。我们通过用线搜索修改来改进常用算法来解决这个问题(45). 这种修改在每次迭代时检查收敛性，减少步长以避免发散。步长反复减半，直到对数似然增加。这确保了算法的收敛性，除非浮点错误介入。线搜索算法在实践中非常可靠。

迭代模型拟合的第二个问题是计算时间。通常的GLM算法需要在每个基因的每次迭代时形成矩阵分解，这是一个巨大的计算负担。为了解决这个问题，我们实现了一种新的、简化的伪纽顿算法，与其他算法相比，它可以更容易地跨基因并行化。在我们的伪纽顿算法中，对模型系数的二阶导数矩阵使用固定近似。首先对线性模型参数化进行变换，使设计矩阵的列正交。然后，二阶导数矩阵由期望信息矩阵近似，如果每个基因的拟合值相等，则会出现期望信息矩阵。这只是单位矩阵的倍数，完全消除了矩阵分解的计算开销。虽然伪纽顿算法平均需要的迭代次数比真纽顿-拉夫森算法或GLM的传统费希尔评分算法略多，但伪纽顿方法与我们的线性搜索策略相结合仍然具有竞争力，并且简化带来的计算收益是巨大的。该算法在R中的实现方式是，对所有基因进行并行迭代，而不是一次只对一个基因进行迭代。我们的纯R实现在几秒钟内就可以将glm应用于大多数RNA-Seq数据集，而在R中对glm（）函数的基因调用通常至少需要几分钟，实际上可能完全由于一个或多个基因的迭代发散而失败。

假设检验

我们的软件允许用户测试线性模型中任何系数的重要性，或线性模型中系数的任何对比度或线性组合的重要性。基因测试是通过计算似然比统计来进行的，以比较系数或对比度等于零的无效假设与不同于零的双边替代假设。在系数或对比度为零的零假设下，对数似然比统计量是渐近卡方分布的。模拟结果表明，似然比检验能够较好地保持其大小，通常能很好地近似于精确检验(23)当后者可用时（未显示数据）。可以使用R中p.adjust函数提供的任何多重测试调整方法。默认情况下，对-通过Benjamini和Hochberg方法调整值以控制错误发现率(47).

生物CV估算

剩下的问题是获得每个基因的BCV的可靠估计值。需要一个近似无偏且在小样本中表现良好的估计量。BCV的最大似然估计会低估BCV，因为需要从相同的数据估计对数线性模型中的系数。我们早期的工作使用精确的条件似然来估计BCV(22,23). 这种方法具有出色的性能，但不容易推广到GLM。相反，我们使用一种近似的条件似然方法，称为APL(48). APL是惩罚可能性的一种形式。再次，我们以矢量化和计算效率的方式实现了APL计算，而不是逐个基因计算数量。

估算常见分散度

除非有大量生物复制品可用，否则不应考虑单独估计每个基因的BCV。当可获得的复制较少时，基因之间的信息共享对于可靠的推断至关重要。无论复制量如何，适当的信息共享方法都会带来一些好处。

让_克表示基因的平方BCV克，我们称之为分散，分散这个基因。离散度是方差函数中二次项的系数。在基因之间共享信息的最简单方法是假设所有基因共享相同的离散度，因此_克 = ϕ (23). 可通过最大化共享似然函数来估计公共离散度

其中APL_克是基因的调整配置文件可能性克（“材料和方法”部分）。这种最大化可以通过多种方式在数值上实现，例如通过无导数近似牛顿算法(49).

估计趋势分散

对常见色散的概括是对色散进行建模_克作为每个基因的平均读取计数的平滑函数(25). 我们的软件提供了许多方法来实现这一点。一种简单的非参数方法是通过平均读取数将基因划分为各个基因库，估计每个基因库中的常见离散度，然后通过这些二进制离散度拟合黄土或样条曲线。一种更复杂的方法是局部加权APL。在这种方法中_克通过建立局部共享对数似然估计，该对数似然是基因APL的加权平均值克以及其相邻基因的平均读计数。

估算基因离散度

在实际科学应用中，单个基因更有可能根据其基因组序列、基因组长度、表达水平或生物功能而具有单个BCV。我们寻求在完全个别的基因分散之间的折衷_克通过扩展Robinson和Smyth提出的加权似然经验贝叶斯方法，完全共享值(22). 在这种方法中，_克通过最大化估计

哪里G公司₀是共享可能性和APL的权重_Sg公司(ϕ_克)是本地共享的log-likelihood。这种加权似然方法可以用经验贝叶斯术语来解释，共享似然是的先验分布_克加权似然作为后验。先验分布可以被认为是由对一组G公司₀基因。先前基因的数量G公司₀因此表示相对于基因的实际观测数据分配给先验值的权重克.最佳选择G公司₀这取决于BCV在基因之间的变异性。当基因之间的BCV恒定时，较大的值是最好的。当BCV在基因之间差异很大时，较小的值是最佳的。我们已经发现G公司₀ = 20/df在广泛的实际数据集上给出了良好的结果，其中df是估计BCV的剩余自由度。对于多组实验，df是库的数量减去不同治疗组的数量。默认设置意味着，无论库的实际数量如何，优先权都有20个自由度的权重来估计BCVn个或实验设计的复杂性。

经验贝叶斯方法的一个理想结果是，基因分散或多或少地向先验值挤压，这取决于个体基因分散估计的可靠性。计数非常低的基因为估计其自身的离散度提供的统计信息相对较少，因此，在这些情况下，先验值占主导地位，基因离散度严重挤压到总体趋势。

为了计算方便，在可能的色散值网格上评估遗传和共享APL函数。使用三次样条曲线在网格上插值每个基因的APL值，并将样条曲线的最大值作为基因离散估计。计算数万个基因的共同和基因离散度大约需要20 在笔记本电脑上。

口腔鳞状细胞癌

最近的一项研究调查了口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的差异基因表达(50). 该研究使用应用生物系统SOLiD系统构建了三名口腔鳞癌患者肿瘤和匹配正常组织的RNA-Seq图谱。最初的分析使用了一种直观但特殊的程序来识别差异表达的基因。基因首先根据肿瘤和正常患者的折叠变化进行排序。在三名患者中，按中位数排列的前300个上调和前300个下调基因被选为差异表达基因(50). 这个简单的分析要求一个基因在两个患者中排名较高，然后忽略第三个患者的fold-change。这足以获得有趣的生物学结果，但不允许进行任何统计显著性评估。它还将所有折叠变化视为同等可靠，而不管计数的大小。

在这里，我们描述了一种更为正式的分析，评估与生物变异相关的统计显著性。首先，我们从下载了读取计数数据补充表S1图什的等。(50). 该表给出了由RefSeq转录本汇总的读取计数，并进行筛选，以仅包括所有三名患者中至少一个组织（肿瘤或正常组织）的至少50个对齐读取的转录本。该研究的完整序列数据可从GEO数据库中获得(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，加入编号{“类型”：“entrez-geo”，“属性”：{“文本”：“GSE20116”，“term_id”：“20116”}}GSE20116标准)，但根据汇总的计数进行工作可以确保我们的分析基于与原始分析相同的计数。我们使用Bioconductor注释包org.Hs.eg.db（2.5.0版）将RefSeq标识符映射到最新的官方基因符号，丢弃数据库中不再存在的任何RefSeq标识符。选择外显子数量最多的RefSeq转录本来代表每个独特的基因，并删除多余的RefSeg转录本。这只剩下10只 464个转录本，每个转录本代表一个独特的基因。然后使用M值的加权修剪平均值尺度规范化方法估计有效库大小(26).

三种正常组织轮廓之间的总体（常见）BCV估计为40%(图1). 三种肿瘤组织之间的BCV明显高于52%，表明肿瘤比正常组织更异质。因此，检测至少两类差异表达的基因是有意义的：第一，那些在所有肿瘤中与匹配的正常组织中一致不同的基因，第二，那些表现出特定于三个肿瘤中一个或两个肿瘤的表达变化的基因。

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图1。

鳞状细胞癌轮廓的多维标度图，其中距离对应于成对样本之间的BCV。根据500个最异质的基因计算成对BCV。样本标有患者编号，肿瘤标记为“T”，正常标记为“N”。第一个绘图维度大致对应于组织来源（正常或肿瘤），第二个绘图维度对应于患者差异。肿瘤样本比正常样本更具异质性。

研究设计有两个解释因素，一个是患者ID，分为三个级别，另一个是组织类型，分为两个级别（正常或肿瘤）。通过将三个连续的对数线性模型拟合到每个基因的读取计数来分析数据(表1). 第一个模型代表了三名患者之间的基线表达差异。第二种是加性模型，允许肿瘤组织与正常组织中一致的相对表达变化。第三种是交互模型，考虑到患者特定的肿瘤效应。

我们的第一个分析是寻找癌症中与正常组织相比持续差异表达的基因。对于此分析，色散估计基于具有两个剩余自由度的可加模型。所有基因的共同BCV被发现过于简单，39个基因显示出比共同BCV更大的变异性证据(图2)家庭错误率为0.05(51). 允许BCV的丰度趋势并没有减少BCV被拒绝的异常基因的数量(图2). 另一方面，允许按基因进行BCV，并使用先验的经验贝叶斯调节G公司₀ = 10，表示没有剩余的不适(图2). 这为在以下分析中使用基因型BCV提供了统计依据。还有一个生物学理由，即三名患者中肿瘤与正常差异不一致的基因将获得更高的BCV估计值，因此在差异表达基因列表中被降级。因此，使用基因型BCV可以让我们关注肿瘤与正常差异一致的基因。

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图2。

使用常见的、趋势的或经验的贝叶斯基因（标签）离散度的拟合优度统计的QQ图。将基因偏差统计转换为正态，并根据理论正态分位数绘制。蓝色的点是那些非常不适合的基因（Holm-adjusted对-值<0.05）。当使用基因分散时，没有基因显示出明显的不匹配。

使用基因BCV值，我们通过将添加剂与基线模型进行比较来测试肿瘤和正常组织之间的差异表达。该分析调整了患者之间的基线差异，类似于计算配对t吨-对每个基因进行测试，但要适应计数数据。以错误发现率（FDR）获得1276个基因 < 0.05 (表1,补充表S1). 在头颈部鳞状细胞癌研究中，这些基因中最显著的是那些先前被确定为肿瘤和正常组织之间差异表达的基因。Yu报道的25个基因中等。(52)，18人被列入罗斯福民主共和国的名单 < 0.05 (补充表S2). 另外两个（TNC和FN1）显示折叠变化大于两倍，FDR约为0.4。其余五个基因表现出微小的折叠变化，没有差异表达的证据(补充表S3). 图什等。(50)讨论了9个具有特殊生物学意义的基因。在我们的FDR分析中，确认了其中六个基因（CASQ1、INHBA、MMP1、HMGA2、SHANK2和WIF1）的强差异表达 < 0.001 (补充表S4和S5). 这包括一个通过RT-qPCR验证的基因（HMGA2）。注意，原始研究(50)通过PCR验证了16个基因，但仅鉴定出HMGA2。

为了进一步证明检测到的基因的生物学相关性，我们测试了从MSigDB数据库中富集的精选基因集(53)使用mean-rank基因集富集试验(54). 在FDR < 0.05，这产生了417个富含上调基因的基因集和268个富含下调基因的基因组。显著富集的数据集绝大多数与癌症相关且一致，表明肿瘤中WNT1通路增强，表达特征与其他癌症类似，如基底样乳腺癌(补充表S7和S8). 基因本体分析(55)发现146个GO术语富含上调基因，264个术语富含下调基因。上调基因的GO术语往往与细胞发育、增殖和分化以及与肿瘤发展一致的相关过程有关(补充表S9和S10).

接下来，我们寻找肿瘤异质性与正常差异的基因。理想情况下，该分析应在同一患者的独立组织提取物之间相对于BCV进行。然而，交互模型完全符合可用数据，没有剩余自由度，因此不能用于估计BCV。相反，我们使用根据三名正常患者之间的差异估计的基因BCV进行此分析。这些BCV代表患者之间的差异，而不是患者内部的差异，因此应该在一定程度上高估所需的BCV。因此，我们的分析在一定程度上是保守的对-值和FDR。正常患者之间的BCV在大小上通常与加性模型中的BCV相似，因此保守性可能相对较小。使用这些保守的BCV，对相互作用和加性模型进行比较，得出202个FDR差异表达基因 < 0.05. 在这项分析中排名第一的基因是CDKN2B，它是由Tuch鉴定的等。(50)根据患者8中表达水平与拷贝数变化的相关性，确定其生物学意义。其他两个基因（CCND1，CTTN）同样由Tuch鉴定等。(50)在我们的交互分析中，FDR约为0.1(补充表S6).

感谢马克·罗宾逊（Mark Robinson）的许多有益讨论，以及布莱恩·图什（Brian Tuch）对鳞癌研究数据的建议。