头颈部鳞状细胞癌转录组的进化：系统综述

数据提取、处理和解析

在每项研究中，报告的基因都是从表格、文本或补遗中提取的。我们将各种基因或序列标识符转换为通用Entrez-GeneID，例如UniGene簇ID、Genbank登录号、基因符号或Affymetrix探针集。GeneID转换由DAVID2007-2008（注释可视化和集成发现数据库，NIH）的网络程序完成[11]然后，对于每一篇文章，我们将PubMed ID、原始标识符、转换后的Entrez GeneID以及折叠更改的值或方向的信息编译为标准格式(文本S1). 开发的程序脚本用于ActivePerl和R统计软件（2.6.1版）的文本处理、解析网络（svg文件）、分析和比较基因列表、链接基因特定信息和染色体坐标，以及将基因-基因相互作用转换为网络拓扑分析的矩阵。Cytoscape软件（2.5.1版）用于网络说明[12].

定量数据合成：有界褶皱变化

为了合成折叠变化的原始信息，开发了一种新的方法来克服多个微阵列平台中的差异。该方法基于这样的假设，即同一目标基因的不同转录测量值，即不同的序列或基因标识符转换为相同的Entrez GeneID，实际上代表了相同的功能实体。对于每项研究，如果折叠发生变化，θ据报告，标准化有界褶皱变化将为|θ′| = θ/（最大值为θ)分别针对上调和下调基因；或者，如果只报告上调或下调的方向，则有界褶皱变化将分别转换为1表示上调和-1表示下调。对于每个之前,TvN（传输网络）或Meta公司如果研究报告了折叠变化值，则基因表达的一致性被计算为有界折叠变化的平均值；否则，如果至少有一项研究只报告了基因调控的方向，则计算中位数。没有此类信息的基因编码为0，因为分析中有界折叠发生了变化。

有效性评估

由于所纳入研究之间的潜在异质性，例如肿瘤起源（口腔、咽喉或喉部）的差异、多个微阵列平台、采用的不同分析方法和不同的终点，我们试图检验HNSCC转录组三阶段分类的有效性。首先，我们系统地计算了在每个比较阶段报告相同Entrez GeneID的频率。如果一个基因被多次报道，则认为该基因已被证实。随后TvN和Meta通过内部一致性比率的比较进行测试，定义为感兴趣组内每项研究的验证基因百分比，即不同亚基的病变研究、使用不同微阵列平台的研究、调查不同终点的研究或建议的分类。C类分类研究TvN或Meta公司如果一致性比率高于感兴趣的子组内的一致性比率，则认为是合理的。例如，易卜拉欣及其同事在121个差异表达基因中，有74个基因（61%）在分类时得到验证TvN（传输网络）; 使用cDNA微阵列在23项研究中验证了38个基因（32%）TvN（传输网络）; 在19项仅检测口腔肿瘤的研究中，有32个基因（27%）得到验证。

基于知识的网络分析和丰富典型路径的识别

完整基因列表和三个比较的验证基因列表的有界折叠变化，之前,TvN、和Meta公司，被导入Ingenuity Pathways Analysis（IPA）软件（Ingenuith Systems，Redwood City，CA，USA），以获得六组网络进行进一步分析。我们使用IPA来确定每个比较阶段的前10个富集标准路径(图2). 通过Fisher精确检验的p值对丰富的典型路径进行排序，这表明输入基因与偶然期望的典型路径中的基因相关的概率。

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图2

丰富的典型路径的排名。

在IPA中共发现八条典型路径，以完整的基因列表（all）或经验证的基因列表作为输入。嵌入式表格显示了不同分析中典型路径的排名。抗原提呈、钙信号和整合素信号通路在三个进展阶段高度富集。对于HNSCC转录组的每个阶段，图形面板显示了按−log（p值）（右y轴）排序的丰富的典型路径，即带有方形数据点的橙色线。彩色条表示每个典型通路中上调或下调基因的百分比（左y轴）。彩色条顶部的数字是典型路径中的总基因数。

IPA生成的网络由来自用户输入的已识别焦点基因和来自知识库的其他相关分子或基因组成[13]网络的得分和排名依据的是拥有比预期更多焦点基因的概率。为了全面了解HNSCC转录组，分析IPA分析产生的三组网络，将完整的基因列表作为输入，并合并为三个阶段的相互作用网络，表示之前,TvN（传输网络）、和Meta公司HNSCC的渐进状态。分析中只包括得分高于10（对数p值）的网络。

网络拓扑分析

基于模型生物的研究结果，表明动态模块化等网络结构[14]和拓扑制图[15]确定了调控和功能的关键方面，我们开发了一个新的网络拓扑分析框架，以估计HNSCC转录组中每个基因的隐含病理效应。这个想法是基于连接性的概念来评估基因的功能意义。在图中指定为切割节点的模块间毂将导致原始组件在自身移除后分解为不同的块，从而导致信号串扰被阻断。如果是模块间集线器我被干扰，即在相互作用的网络中被移除，我们通过信息评分来估计病理生理学扰动的可能性（f）_我)，通过阻塞路径的数量除以分解组件的数量来计算。信息得分(（f）_我)计算公式（1），其中米表示删除节点后中断组件的数量我，N个_{内容提供商}表示此组件中的节点总数，其中节点我位于，S公司是每个中断组件的大小，以及m.lg（百万磅）是每个元素的迭代计数器部分S公司以计算被阻塞的路径。

(1)

其余基因被归为外围基因或模块内枢纽，其相互作用等于或大于两个，并且其去除不会导致网络崩溃。我们没有根据拓扑特性考虑这两组基因的病理生理效应。

从HNSCC转录组的三个进展阶段中的每个阶段提取丰富的典型路径的子网络，用于独立的拓扑分析(图3a-i). 通过HNSCC转录组的拓扑特征、转录谱的变化或不同阶段之间的参与，确定了显著的连接中心。

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图3

HNSCC转录组各阶段比较中丰富的抗原提呈和整合素信号通路。

基因以节点表示，功能关联以边缘表示。节点着色按有界折叠变化缩放–红色：上调；绿色：下调。节点大小与HNSCC转录组中报告该基因的论文数量成正比。边缘根据HNSCC转录组的阶段着色–红色：Meta公司; 蓝色：TvN（传输网络）; 和绿色：之前.a–c。抗原提呈通路的合并网络，节点根据有界折叠变化着色之前,TvN（传输网络）、和Meta公司分别是。d–f。整合素信号网络的合并网络，节点根据有界折叠变化着色之前,TvN（传输网络）、和元，分别是。g–i。整合素信号通路的亚网络之前,TvN（传输网络）和Meta公司HNSCC转录组的阶段。（有关详细信息，请参阅图S1,S2系列,第3章,S4系列和第5章).

的有效性TvN（传输网络）和Meta公司HNSCC转录组的进展阶段

我们发现，在TvN（传输网络）（平均比率 = 71%），其次为Meta公司（31%），最后为之前(26%) (表2). 在TvN、，我们进一步研究了不同解剖亚群（p，咽部；L，喉部；o，口腔）肿瘤或未指定位置肿瘤（混合）研究亚组的一致性比率。19篇论文采集了仅位于口腔内的标本。出乎意料的是，我们发现这个亚组的内部一致性显著下降（平均比率 = 37%). 详细检查了不同解剖亚基的基因列表(文本S1). 报告的大多数基因来自不同的口腔肿瘤（63%）、咽喉肿瘤（74%），与未指定位置的肿瘤重叠。不同组和混合组共有94个基因；58个咽或喉特异基因；376个口腔特异基因。特别是98个基因，其中9.6%来自口腔，41%来自咽喉，重叠，表明不同组之间存在一些相似性。我们还注意到，在使用类似微阵列平台的研究亚组中，内部一致性降低。总的来说，使用Affymetrix基因芯片的研究显示了更高的内部一致性。使用Affymetrix HG-U95A的三项研究和使用Affmetrix HG-U133的四项研究的结果有更多重叠；然而，另四项使用Affymetrix HG-U95Av.2的研究却没有。将cDNA微阵列作为一个单独的类别，四项研究保持相同的一致性水平，而其余的研究则显示出相当大的下降（数据未显示）。需要提醒的是，所报告的基因列表的大小肯定会影响一致性比率。获取的肿瘤样本的数量和解剖亚基的详细信息、使用的微阵列平台、进行的分析方法、报告的原始标识符、有关折叠变化的信息以及数据集的可用性，请参见表S1.

关于研究中预后结果的差异Meta公司，我们将研究分为4个亚组(第N页，阳性淋巴结；重现，复发；数据管理，远处转移；和监视，生存）。与中的结果类似TvN（传输网络），每个亚组的内部一致性比率显著下降，尤其是在数据管理和监视组（平均比率 = 23%、5%、5%pN,数据管理、和监视子组）。总的来说，我们认为三个进展阶段的分类，之前,TvN（传输网络）和Meta公司HNSCC转录组的，足以用于此荟萃分析。

Pre、TvN和Meta中的全球HNSCC转录组

由于HNSCC转录组中固有的噪音，我们开发了一种策略，通过关注丰富的信号通路以及相互作用网络的拓扑特性来捕获基本主题。在已验证的基因列表中，HNSCC中的发现更稳定，但范围可能太有限。相比之下，使用完整的基因列表可能有助于发现重要的模块，而当数据稀缺时，这些模块可能会模糊不清。因此，完整基因列表和经验证的基因列表的有界折叠变化之前,TvN（传输网络）、和Meta公司首次导入IPA以获得六套网络。我们比较了这两个层次的分析，得出了丰富信号通路的共识。HNSCC转录组的相互作用网络最终建立在完整基因列表生成的网络上。得分高于10（对数p值）的网络被解析并合并为三个阶段的交互网络，表示之前,TvN（传输网络）、和Meta公司HNSCC的渐进状态。

表3描述了三阶段相互作用网络的统计。共有65、100和64个网络被合并到之前,TvN（传输网络）和Meta公司交互网络。网络的密度（平均度）在每个阶段都是相似的，并且所有网络都包含一个大约2000个基因大小的主要成分（连接子集）。我们进行了网络拓扑分析，并确定了信息得分最高的重要模块间集线器。同样，每个比较阶段连通性最高的模块内集线器也列在表3.

丰富的典型信号通路共识

使用经验证的基因列表进行IPA分析得出的前10个富集的典型路径与使用完整基因列表得出的路径有很大不同。使用验证基因列表分析的典型路径的−log（p值）比使用完整基因列表的更显著。图2结果表明，上调和下调基因在每条通路中所占的百分比，每条通路的−log（p值）按降序绘制。中的嵌入表图2显示了跨越三个进展阶段的八条标准路径。抗原提呈、钙信号和整合素信号通路被列为最重要的途径。

丰富的抗原提呈和整合素信号通路

我们试图通过研究富集的抗原提呈和整合素信号通路来探索全球HNSCC转录组(图3). 癌症作为适应性免疫的平衡状态这一新兴观点证实了免疫编辑在肿瘤发生和转移中长期以来的模糊作用[20]在抗原提呈途径的子网络中，我们确定了三种成分，代表三种主要复合物——蛋白酶体、MHC I类和MHC II类。转录谱的显著抑制Meta公司特别是人类白细胞抗原-MHC I中的G和HLA-DRB1在MHC II中。CALR（校准），内质网伴侣钙网蛋白在之前和Meta公司; 作为连接MHC I、补充系统和泰铢1.

研究人员已经找到了一种基于网络的方法来解决整合素粘附的复杂机制[21]在HNSCC转录组的整合素信号网络中，我们发现了几个被抑制的模块间枢纽：ACTN2，盖3和TTN公司在里面之前和TvN（传输网络）; 和ILK公司,γ-γ和VCL公司在里面Meta公司.GRB2级,ITGA5公司,ITGB6标准,ITGB7标准和地图8在TvN互动网络。表S2提供了富集抗原提呈和整合素信号网络中拓扑重要基因的详细信息。

整合素信号通路的破坏暗示HNSCC的侵袭性

Gaggioli及其同事[1]建立了一种新的模型，用于观察共同培养的基质成纤维细胞和口腔癌细胞（SCC12）的集体侵袭。ITGA3公司,ITGA5公司RhoGTPases在力介导的基质重塑中是必需的，主要基质成纤维细胞通过其产生支持SCC侵袭的轨迹。为了利用富集途径中相互作用网络的生物学意义，我们将整合素家族的拓扑信息评分与基质成纤维细胞中siRNA敲低整合素导致的基质收缩百分比进行了比较(表4). 关于八种整合素，ITGA1、ITGA2、ITGA3,ITGA5、ITGAV、ITGA6、ITGB1和ITGB4标准，拓扑信息得分之间的相关性TvN（传输网络）击倒后的基质收缩为-0.867（皮尔逊相关检验，p值 = 0.005). 从相互作用网络的拓扑结构中得出的信息分数用于估计扰动的病理效应，即阻塞的信号信息。并非所有整合素在三个阶段都有差异表达；因此，我们无法将估计的病理效应与TvN（传输网络）网络。尽管如此，基于估计的生物学意义和实验结果之间的强烈关联，我们确信，对进化中的HNSCC转录组进行基于网络的荟萃分析确实可以重述疾病进展的潜在本质。