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.2009年10月；19(10):1825-35.
doi:10.1101/gr.094482.109。 Epub 2009年6月18日。

用于癌症基因表达谱分析的下一代标签测序

索拉娜·莫里西 1, 瑞安·德·莫林, 阿伦·德莱尼, 托马斯·曾, 海伦·麦克唐纳, 史蒂文·琼斯, 赵永军, 马丁·赫斯特, 马可·阿马拉
附属公司

用于癌症基因表达谱分析的下一代标签测序

索拉娜·莫里西等。 基因组研究. 2009年10月.

摘要

我们描述了一种新的方法Tag-seq，它利用21个碱基对cDNA标签的超高通量测序来进行敏感和经济高效的基因表达谱分析。我们将Tag-seq数据与LongSAGE数据进行了比较，并观察到几类罕见转录物的表现有所改善，包括转录因子、反义转录物和内含子序列，后者可能代表新的外显子或基因。我们观察到这种罕见转录物的多样性、丰度和动态范围增加，并利用更大的动态表达范围来确定癌症和正常文库中替代转录物亚型的表达比例改变。Tag-seq读码的特异性信息进一步使我们能够检测到癌症和正常文库之间正反义（S-AS）转录物的表达比率的改变。S-AS转录物在已知癌症基因中富集，而转录亚型在miRNA靶向位点中富集。我们发现，LongSAGE中的转录物丰度比Tag-seq中的GC-bias更强，因此在LongSAGE中，富含AT-rich的标签的丰度低于富含GC-rich标签的标签。Tag-seq在基因发现方面也表现得更好，识别了LongSAGE检测到的>98%的基因，并分析了以富含AT-基因为特征的转录组的一个独特子集，该转录组的表达水平低于LongSAGE检测到的水平。总的来说，Tag-seq对罕见转录物敏感，相对于LongSAGE，其序列组成偏差较小，并允许对更大范围的转录物进行差异表达分析，包括编码重要调控分子的转录物。

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数字

图1。
图1。
Tag-seq库生成概述。每个mRNA（棕色）都使用寡核苷酸（dT）珠进行了双链cDNA合成，以捕获聚腺苷化RNA。cDNA（金）用NlaIII锚定限制酶（垂直红色箭头）消化，留下4 bp悬垂（GTAC）。仅保留固定在寡核苷酸（dT）珠上的cDNA片段。适配器A（绿色）连接到突出部分，并为类型IIS标记酶MmeI添加识别位点。MmeI消化后（红色垂直箭头），将第二个适配器（适配器B，蓝色）连接到产生的2-bp外悬。PCR引物（水平红色箭头）退火到适配器A和B用于丰富标签。在Illumina集群站和分析仪上进行集群生成和排序（棕色水平箭头）。处理产生的图像文件以提取读取序列，并从读取中进一步提取21-bp SAGE标记。标签由4-bp的NlaIII识别位点和17bp的独特序列组成，共构成21个碱基，可映射回原始mRNA（棕色）。
图2。
图2。
平均数量(A类)和比例(B类)作为采样深度的函数，在Tag-seq和LongSAGE库中明确确定的集合基因。误差条表示77个LongSAGE库和35个Tag-seq库中已识别基因的平均数SD。最大的LongSAGE库有约300000个标签，而最大的Tag-seq库有约1000万个标签。
图3。
图3。
Tag-seq和LongSAGE库的GC-bias以观察到的偏差与预期偏差不同的SD数量为单位进行计算（见正文）。正单位表示具有比预期更多AT-丰富标签序列的库（AT-bias），而负单位表示具有超过预期的GC-丰富标签顺序的库（GC-bia）。在标签表达阈值增加时，显示所有质量过滤标签序列和所有LongSAGE标签序列的计算偏差(x个-轴）。
图4。
图4。
Tag-seq和LongSAGE技术复制库中的GC内容偏差。(A类)比较常见或每个tag-seq和LongSAGE复制库发现的标记序列的GC含量和平均计数。(B类)根据GC含量计算标签的Pearson相关性。箱子上贴上标签，注明观察到的GC含量范围和装箱标签的数量(x个-轴）。(C类)计算tag-seq和LongSAGE在每个GC含量料仓中标签序列的平均表达，并绘制每个平均值的对数。星号（*）表示标签序列表达显著不同的箱子（使用t吨-测试，对< 0.01).
图5。
图5。
LongSAGE和Tag-seq库中标签检测到的平均基因数的比例显示为一系列表达阈值（每百万个标签）。条形图表示带有内含子标签的平均基因数的比例(A类)，反义标签(B类)和DNA结合域（转录因子）(C类)在Tag-seq和LongSAGE库中。
图6。
图6。
检测Tag-seq和LongSAGE hESC复制品中的外显子、内含子和反义标签。来自Tag-seq技术复制、电子衍生sub_Tag-seq和LongSAGE复制的Tag序列被映射到Ensembl基因的内含子、外显子和反义链。不同标签序列的比例(A类)和标签丰度(B类)相对于所有映射的质量筛选标签进行报告。报告三个库中常见的所有标签序列的平均标签计数（±SD）(C类).
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