RNA-Seq：转录组学的革命性工具

摘要

转录组是细胞中针对特定发育阶段或生理条件的一整套转录物及其数量。理解转录组对于解释基因组的功能成分、揭示细胞和组织的分子组成以及理解发育和疾病至关重要。转录组学的主要目的是：对所有转录物物种进行分类，包括mRNA、非编码RNA和小RNA；根据基因的起始位点、5′端和3′端、剪接模式和其他转录后修饰来确定基因的转录结构；并量化每个转录物在发育过程中和不同条件下的表达水平变化。

已经开发了各种技术来推断和量化转录组，包括基于杂交或序列的方法。基于杂交的方法通常包括用定制的微阵列或商业高密度寡核苷酸微阵列培育荧光标记的cDNA。还设计了专门的微阵列；例如，带有跨越外显子连接的探针的阵列可用于检测和量化不同的剪接亚型¹已经构建了以高密度表示基因组的基因组平铺微阵列，并允许将转录区域映射到非常高的分辨率，从几个碱基对到~100bp^2–5基于杂交的方法具有高通量且相对便宜，但查询大型基因组的高分辨率平铺阵列除外。然而，这些方法有几个局限性，包括：依赖于现有的基因组序列知识；交叉杂交导致的高背景值^6,7; 由于背景和信号饱和，检测的动态范围有限。此外，比较不同实验中的表达水平通常很困难，可能需要复杂的归一化方法。

与微阵列方法相比，基于序列的方法直接确定cDNA序列。最初，cDNA或EST文库的Sanger测序^8,9虽然使用了，但这种方法的吞吐量相对较低，成本较高，而且通常不定量。基于标签的方法被开发来克服这些局限性，包括基因表达的系列分析（SAGE）^10,11基因表达的cap分析（CAGE）^12–14和大规模并行签名排序（MPSS）^15–17这些基于标记的测序方法具有高通量，可以提供精确的“数字”基因表达水平。然而，大多数都是基于昂贵的桑格测序技术，短标签的很大一部分不能唯一地映射到参考基因组。此外，只分析了部分转录本，亚型之间通常无法区分。这些缺点限制了传统测序技术在转录组结构注释中的应用。

最近，新型高通量DNA测序方法的发展为转录组的定位和量化提供了一种新方法。这种被称为RNA-Seq（RNA测序）的方法与现有方法相比具有明显的优势，有望彻底改变真核转录体的分析方式。它已应用于酿酒酵母,葡萄裂殖酵母,拟南芥、小鼠和人类细胞^18–24在这里，我们解释了RNA-Seq的工作原理，讨论了它的挑战，并概述了使用这种方法的研究，这些研究已经开始改变我们对真核转录体的看法。

RNA-Seq技术及其优点

RNA-Seq使用最近开发的深测序技术。一般来说，一组RNA（总RNA或分馏RNA，如poly（a）+）被转换为cDNA片段库，其一端或两端都有适配器(图1). 每个分子，无论是否扩增，然后以高通量方式测序，以从一端（单端测序）或两端（对端测序）获得短序列。读数通常为30–400 bp，具体取决于所使用的DNA测序技术。原则上，任何高通量测序技术²⁵可用于RNA-Seq和Illumina IG^{18–21,23,24}，Applied Biosystems SOLiD公司²²和罗氏454生命科学^26–28系统已经用于此目的。Helicos Biosciences tSMS系统尚未用于已发表的RNA-Seq研究，但它也是合适的，并且具有避免目标cDNA扩增的额外优势。测序后，结果读取要么与参考基因组或参考转录本对齐，要么组装从头开始没有基因组序列来生成包含每个基因的转录结构和/或表达水平的基因组转录图。

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图1

一个典型的RNA-Seq实验

简言之，长RNA首先通过RNA片段或DNA片段转换为cDNA片段库（见正文）。测序适配器（蓝色）随后添加到每个cDNA片段中，并使用高通量测序技术从每个cDNA中获得短序列。由此产生的序列读数与参考基因组或转录组对齐，并分为三种类型：外显子读数、连接读数和poly（A）末端读数。这三种类型用于为每个基因生成碱基解析表达谱，如底部所示；显示了带有一个内含子的酵母ORF。

尽管RNA-Seq仍然是一项正在积极开发的技术，但与现有技术相比，它具有几个关键优势(表1). 首先，与基于杂交的方法不同，RNA-Seq不仅限于检测与现有基因组序列相对应的转录物。例如，基于454的RNA-Seq已被用于对格兰维尔贝母蝴蝶的转录组进行测序²⁷这使得RNA-Seq对基因组序列尚未确定的非模型生物特别有吸引力。RNA-Seq可以以单碱基分辨率揭示转录边界的精确位置。此外，来自RNA-Seq的30 bp短读给出了两个外显子如何连接的信息，而长读或对端短读应该揭示多个外显基因之间的连接。这些因素使得RNA-Seq对于研究复杂转录体很有用。此外，RNA-Seq还可以揭示转录区的序列变异（例如SNP）^22,24.

相对于DNA微阵列，RNA-Seq的第二个优点是，RNA-Seq的背景信号非常低（如果有的话），因为DNA序列可以明确地映射到基因组的独特区域。RNA-Seq没有量化上限，这与获得的序列数相关。因此，它有一个很大的表达水平动态范围，在这个范围内可以检测到转录物：在一项分析了1600万个映射阅读的研究中，估计超过9000倍的范围酿酒酵母¹⁸，估计4000万只老鼠的序列读取量跨越五个数量级²⁰相比之下，DNA微阵列对低水平或非常高水平表达的基因缺乏敏感性，因此动态范围小得多（一百倍到几倍）(图2). 正如使用定量PCR（qPCR）测定的那样，RNA-Seq在定量表达水平方面也被证明是高度准确的¹⁸和已知浓度的RNA对照中的刺突²⁰RNA-Seq的结果也显示了技术复制和生物复制的高度重复性^18,22最后，由于没有克隆步骤，并且Helicos技术没有扩增步骤，RNA-Seq需要较少的RNA样本。

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图2

定量表达水平：RNA-Seq和微阵列比较

通过RNA-Seq和平铺阵列测量，显示了酿酒酵母细胞生长在营养丰富的培养基中。这两种方法对于中等表达水平（中等）的基因非常一致，但对于低表达水平或高表达水平的基因，相关性很低。此图中使用的平铺数组数据来自REF。2，RNA-Seq数据取自REF。18.

考虑到所有这些优点，RNA-Seq是第一种基于序列分析的方法，它允许以非常高通量和定量的方式调查整个转录组。该方法在基因组尺度上提供注释的单碱基分辨率和“数字”基因表达水平，通常比平铺阵列或大规模Sanger EST测序成本低得多。

RNA-Seq面临的挑战

图书馆建设

转录组学的理想方法应该能够直接识别和量化所有RNA，无论大小(图1)在cDNA文库的生产过程中，它确实涉及几个操作阶段，这可能会使它在分析所有类型的转录物时的使用变得复杂。

与小RNA（microRNAs（miRNAs）、Piwi-interacting RNA（piRNA）、short interference RNA（siRNA）和其他许多小RNA不同，小RNA可以在连接接合器后直接测序，大RNA分子必须分割成较小的片段（200-500 bp）才能与大多数深测序技术兼容。常见的片段化方法包括RNA片段化（RNA水解或雾化）和cDNA片段化（DNA酶I处理或超声）。每种方法都会在结果中产生不同的偏差。例如，RNA片段对转录体几乎没有偏见²⁰，但与其他方法相比，在成绩单结束时会耗尽(图3). 相反，cDNA片段化通常强烈倾向于识别转录物3′端的序列，从而提供关于这些端的精确身份的有价值信息¹⁸(图4).

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图3

DNA文库制备：RNA片段化与DNA片段化的比较

一|寡脱氧核糖核酸启动的cDNA片段（蓝线）更偏向于转录物的3′端。RNA片段（红线）沿基因体提供了更均匀的覆盖，但5′端和3′端的覆盖相对较少。请注意，微阵列的最大和最小表达水平（或动态范围）之比为44，RNA-Seq为9560。标签计数是5000个酵母ORF的平均测序覆盖率¹⁸.b条|一种特殊的酵母基因，赛斯1（seryl-tRNA合成酶），如图所示。

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图4

来自RNA-Seq的Poly（A）标签

包含两个重叠转录本的区域(行动1，来自肌动蛋白基因，YFL040W，一种无特征的ORF）来自酿酒酵母显示基因组。箭头指向转录方向。来自RNA-Seq实验的poly（A）标签显示在这些转录物下方，箭头指示转录方向。由poly（A）标签识别的每个位点的精确位置揭示了poly（A）位点的异质性，例如，行动1有两个大的集群，都有一些局部异质性的基础。poly（A）标签揭示的转录方向也有助于解析3′端重叠转录区¹⁸.

在文库构建过程中的一些操作也使RNA-Seq结果的分析复杂化。例如，可以从已扩增的cDNA库中获得许多彼此相同的短阅读。这些可能是丰富RNA物种的真实反映，也可能是PCR人工制品。区分这些可能性的一种方法是确定是否在不同的生物复制中观察到相同的序列。

关于图书馆建设的另一个关键考虑因素是是否像两项研究中所做的那样，准备专门的图书馆^21,22这些文库的优点是可以生成有关转录本方向的信息，这对于转录组注释很有价值，特别是对于转录方向相反的重叠区域^2,19,29; 然而，特定于strand的库目前很难生成，因为它们需要许多步骤²²或直接RNA-RNA连接²¹，效率低下。此外，必须确保反义转录物不是逆转录的人工制品³⁰由于这些并发症，到目前为止，大多数研究都分析了没有链信息的cDNA。

覆盖率与成本

另一个重要问题是序列覆盖率，即被调查成绩单的百分比，这对成本有影响。更大的覆盖范围需要更多的测序深度。要检测罕见的转录本或变体，需要相当深入的研究。在简单转录组中，例如酵母（S.pombe公司和酿酒酵母)没有证据表明存在选择性剪接，从poly（A）mRNA文库中读取3000万个35-核苷酸足以观察在单一条件下（即在富含营养的培养基中）生长的细胞的大多数（>90%）基因的转录¹⁸。对于大多数目的来说，这个深度可能已经足够了，因为在400万个唯一定位读取时，RNA-Seq检测到的表达基因数量达到了80%的覆盖率，之后将深度加倍仅会增加10%的覆盖率(图5). 其余的基因可能在这种情况下不表达（例如，产孢基因¹⁸)或者没有poly（A）尾巴。分析许多不同的条件可以进一步增加覆盖范围；在里面S.pombe公司六种不同生长条件下的1.22亿次读取检测到99%以上注释基因的转录¹⁹.

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图5

覆盖范围与深度

一|在400万个唯一定位的RNA-Seq读取中检测到80%的酵母基因，尽管测序深度不断增加，但覆盖率随后达到一个稳定水平。表达基因定义为在3′端50-bp的窗口中至少有四个独立的读取。数据取自REF。18.b条|当测序深度在两个小鼠转录组中达到8000万时，检测到的唯一起始位点的数量开始趋于稳定。ES，胚胎干细胞；EB，胚胎体。经过许可，图从REF修改。22©（2008）Macmillan Publishers Ltd.保留所有权利。

总的来说，基因组越大，转录组越复杂，就需要更多的测序深度才能获得足够的覆盖率。与基因组测序覆盖率不同，计算转录组的覆盖率不那么简单；这是因为不同转录亚型的真实数量和水平通常不知道，而且转录活性在基因组中差异很大。一项研究使用独特转录起始位点的数量作为衡量小鼠胚胎细胞覆盖率的指标，并证明在8000万读时，起始位点的数目达到了一个稳定值²²(图5b). 然而，这种方法并没有解决选择性剪接和转录终止位点的转录组复杂性；进一步测序可能会发现其他变体。

新的转录组学见解

尽管存在上述挑战，但RNA-Seq的优势使我们能够对许多物种和细胞类型的转录组及其组织形成前所未有的全局视图。在RNA-Seq出现之前，已知酵母的比例远高于预期，黑腹果蝇人类基因组被转录^2,4,36对酵母和人类来说，已经发现许多基因有许多不同的亚型^2,4然而，大多数转录本和外显子的开始和结束都没有得到精确的解析，而且对剪接异质性的程度仍知之甚少。RNA-Seq以其高分辨率和高灵敏度揭示了已知基因的许多新转录区和剪接亚型，并为许多基因绘制了5′和3′边界。

定义转录水平

由于RNA-Seq是定量的，因此可以比微阵列更准确地确定RNA表达水平。原则上，可以确定细胞群中每个分子的绝对数量，并直接比较实验结果。已经使用了几种方法进行量化。对于RNA片段化后再进行cDNA合成，使每个外显子的覆盖更加均匀，基因表达水平可以从基因外显子中的总读取次数中推断出来，并通过可唯一映射的外显子长度进行标准化²⁴; 对于3′偏置方法，使用3′端附近窗口的读取计数¹⁸这些方法测定的基因表达水平与对照组的qPCR和RNA峰值密切相关。

RNA-Seq的一个特别强大的优点是，它可以捕获跨不同组织或条件的转录组动力学，而无需复杂的数据集标准化^19,20,22RNA-Seq已用于准确监测酵母营养生长期间的基因表达¹⁸，酵母减数分裂¹⁹和小鼠胚胎干细胞分化²²，以跟踪发育过程中的基因表达变化，并提供不同组织之间基因表达差异的“数字测量”²⁰由于这些优点，RNA-Seq无疑将对理解发育和正常生理变化期间的转录组动力学以及生物医学样品的分析具有重要价值，在生物医学样品分析中，它将使疾病组织和正常组织之间的可靠比较以及疾病状态的亚类化成为可能。

未来的方向

尽管RNA-Seq仍处于使用的早期阶段，但与之前开发的转录组学方法相比，它具有明显的优势。RNA-Seq的下一大挑战是以更复杂的转录体为靶点，以识别和跟踪所有基因中罕见RNA亚型的表达变化。促进实现这一目标的技术包括对端测序、特定于股的测序以及使用更长的读取时间来增加覆盖范围和深度。随着测序成本持续下降，RNA-Seq有望在许多涉及确定转录组结构和动力学的应用中取代微阵列。

致谢

词汇表

脚注

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