生物变异多因子RNA-Seq实验的差异表达分析

生物变异系数

RNA-Seq配置文件由n个RNA样本。设π_吉是所有cDNA片段在我-来自基因的第个样本克.让G公司表示基因总数，所以对于每个样本。让表示π的变异系数（CV）（标准偏差除以平均值）_吉在复制品之间我。我们表示库中映射读取的总数我通过N个_我和映射到克-第th个基因年_吉.然后

假设计数年_吉相同RNA样品重复测序遵循泊松分布，混合分布方差的一个众所周知的公式意味着：

将两边分开给予

第一项1/μ_吉是泊松分布的平方CV，第二个是未观察到的表达式值的平方CV。总CV²因此是技术简历²其中π_吉测量值加上生物CV²真π的_吉。在本文中，我们将其称为_克分散度和严格地说，生物变异系数捕获了复制品之间的系间变异的所有来源，包括可能来自技术原因的贡献，例如文库准备以及样品之间的真正生物变异。

广义线性模型

GLM是经典线性模型对非正态分布响应数据的扩展(42,43)。GLM根据它们的均值-方差关系指定概率分布，例如上面为读取计数指定的二次均值-方差的关系。假设估计值可用于_克，因此可以计算以下任意值的方差 μ_吉，GLM理论可用于拟合对数线性模型

对于每个基因(32,41)。在这里x个_我是一个协变量向量，用于指定应用于RNA样本的处理条件我、和β_克是一个回归系数向量，通过该向量为基因介导协变量效应克二次方差函数指定负二项GLM分布族。负二项分布的使用等价于处理π_吉伽马分布。

装配GLM

对数似然对系数β的导数_克是X（X）^T型z（z）_克，其中X（X）是带列的设计矩阵x个_我和z（z）_吉 = (年_吉 − μ_吉)/(1 + ϕ_克μ_吉)。系数的Fisher信息矩阵可以写成_克 = X（X）^T型W公司_克X（X），其中W公司_克是标准GLM理论中工作重量的对角矩阵(43)。求β的最大似然估计的Fisher评分迭代_克因此是带有δ = (X（X）^T型W公司_克X（X）)⁻¹ X（X）^T型z（z）_克此迭代通常会增加似然函数，但似然也会降低，表示与所需解的背离。另一方面，始终存在一个步长修饰符α为0 < α < 1这样增加了可能性。选择α以便在每次迭代时都是这样，这就是所谓的行搜索策略(44,45).

Fisher的打分迭代可以看作是一种近似的Newton-Raphson算法，Fisher信息矩阵近似于二阶导数矩阵。线搜索策略可以与正定的二阶导数阵的任何近似值一起使用。我们的实现使用了一个计算方便的近似值。在不损失通用性的情况下，线性模型可以参数化，以便X（X）^T型X（X） = 我。如果完成此操作，并且如果 μ_吉也恰好是恒定的我对于给定的基因克，则信息矩阵相当简化为 μ_克/(1 + ϕ_克μ_克)乘以单位矩阵我将其作为信息矩阵的近似值，带线搜索修改的Fisher评分步骤变为简单的δ = αX（X）^T型z（z）_克，其中乘数 μ_克/(1 + ϕ_克μ_克)已被吸收到步长因子α中。在这个公式中，α不再被限制为小于1。在我们的实现中，每个基因都有自己的步长α，随着迭代的进行，步长α会增加或减少。

Cox–Reid调整后的配置文件可能性

的调整剖面可能性（APL）_克是被处罚的原木

哪里年_克是基因计数的载体克,是估计的系数向量，ℓ（）是对数似然函数_克是Fisher信息矩阵。Cholesky分解(46)为计算信息矩阵的行列式提供了一种数值稳定且高效的算法。具体来说，logdet_克是Cholesky因子对角线元素的对数之和R（右），其中_克 = R（右）^T型 R（右）和R（右）为上三角形。矩阵R（右）可以作为标准线性模型拟合中使用的QR分解的副产品获得。在我们的实现中，Cholesky计算是以向量化的方式进行的，对所有基因进行并行计算。

仿真

使用负二项分布计数生成了固定总数为10的人工数据集 000个基因。根据形状参数为0.5、特别的选择模拟肿瘤数据的大小分布。平均分散度设置为0.16（BCV = 0.4). 在一次模拟中，所有基因都具有相同的真实分散性。在另一个模拟中，根据具有20个自由度的反向chisquare分布，在0.16左右随机生成真实分散度。

技术和生物变异

RNA-Seq实验的起点是一组n个RNA样本，通常与各种治疗条件有关。对每个样本进行测序，将短读映射到适当的基因组，并记录映射到每个感兴趣的基因组特征的读数。为了简化术语，我们将在本文中假设计数是在基因水平上总结的，尽管在实践中基因组特征也可能是转录本、外显子、SAGE标签、外显子连接或非编码RNA。从样本中读取的次数我映射到基因克将被表示年_吉.样本的基因计数集我组成表达式配置文件或图书馆对于该样本。每个计数的预期大小是库大小和该样本中该基因的相对丰度的乘积。

在任何RNA-Seq实验中都可以区分两个水平的变异。首先，每个基因的相对丰度在不同的RNA样本中会有所不同，主要是由于生物原因。其次，存在测量误差，即测序技术估计每个样本中每个基因丰度的不确定性。如果相同RNA样本的等分部分被测序，那么特定基因的读取计数应根据泊松定律变化(30)。如果测序变异为泊松，则可以显示（“材料和方法”部分）生物复制库之间每个计数的平方变异系数（CV）分别是技术变异和生物变异的平方变异的总和，

生物变异系数（BCV）是基因（未知）真实丰度在复制RNA样本之间变化的变异系数。它代表了如果测序深度可以无限增加的话，生物复制之间保持的变异系数。技术CV随着计数大小的增加而减小。而BCV则不然。因此，BCV可能是高计数基因不确定性的主要来源，因此可靠的BCV估计对于RNA-Seq实验中差异表达的实际评估至关重要。如果每个基因的丰度在不同的复制RNA样本之间变化，使得基因标准偏差与基因平均值成比例，这是物理量测量的一种常见特性，那么可以合理地假设BCV在不同基因之间近似恒定。然而，我们考虑到BCV可能在基因之间发生变化，也可能在基因表达或预期计数方面表现出系统性趋势。

BCV的大小比真实基因丰度所遵循的确切概率定律更重要。为了数学上的方便，我们假设真实的基因丰度在复制RNA样本之间遵循伽马分布规律。这意味着读取计数遵循负二项式概率定律。

多因素实验的线性模型

线性模型用于描述多因素微阵列实验的方法已经很成熟(18,19)。虽然线性模型与正态分布数据相关，但可以使用GLM分析负二项式计数数据，其方法在所有重要方面都与正态线性模型非常类似。我们假设以解释性协变量表示的预期读取计数为对数线性模型，这些协变量捕获了应用于每个RNA样本的处理条件（“材料和方法”部分）。总库大小N个_我充当抵消在线性模型预测器中，捕获计数对序列深度的依赖性。库大小可以定义为映射读取的总数，也可以根据数据进行估计，以影响不同库之间的相对规范化(26).

GLM是非线性模型，必须对每个基因的参数进行迭代估计。提出了一种直观的迭代计算算法来拟合GLM(42)，并且几乎所有可用的GLM软件都使用此算法。每个迭代都可以看作是一个最小二乘回归，其中每个计数与总CV成反比²上述定义(43,45)。必须重复模型拟合过程，直到实现收敛。GLM在RNA-Seq数据中的先前应用已经对标准单变量GLM软件进行了基因调用。虽然常用的GLM算法对于单变量数据相当可靠，但不能保证它能够成功收敛，特别是对于非常小或拟合不良的数据集。在RNA-Seq环境中，通常的GLM算法经常失败，对于我们的目的来说不够可靠。我们通过用线搜索修改来改进常用算法来解决这个问题(45)。此修改检查每次迭代的收敛性，减少步长以避免发散。步长反复减半，直到对数似然增加。这确保了算法的收敛性，除非浮点错误介入。线搜索算法在实践中非常可靠。

迭代模型拟合的第二个问题是计算时间。通常的GLM算法需要在每个基因的每次迭代时形成矩阵分解，这是一个巨大的计算负担。为了解决这个问题，我们实现了一种新的、简化的伪纽顿算法，与其他算法相比，它可以更容易地跨基因并行化。在我们的伪纽顿算法中，对模型系数的二阶导数矩阵使用固定近似。首先对线性模型参数化进行变换，使设计矩阵的列正交。然后，二阶导数矩阵由期望信息矩阵近似，如果每个基因的拟合值相等，则会出现期望信息矩阵。这只是单位矩阵的倍数，完全消除了矩阵分解的计算开销。虽然伪纽顿算法平均需要的迭代次数比真纽顿-拉夫森算法或GLM的传统费希尔评分算法略多，但伪纽顿方法与我们的线性搜索策略相结合仍然具有竞争力，并且简化带来的计算收益是巨大的。该算法在R中以这样一种方式实现，即并行地对所有基因进行迭代，而不是一次对一个基因进行迭代。我们的纯R实现在几秒钟内就可以将glm应用于大多数RNA-Seq数据集，而在R中对glm（）函数的基因调用通常至少需要几分钟，实际上可能完全由于一个或多个基因的迭代发散而失败。

假设检验

我们的软件允许用户测试线性模型中任何系数的重要性，或线性模型中系数的任何对比度或线性组合的重要性。基因测试是通过计算似然比统计来进行的，以比较系数或对比度等于零的无效假设与不同于零的双边替代假设。在系数或对比度为零的零假设下，对数似然比统计量是渐近卡方分布的。模拟结果表明，似然比检验能够较好地保持其大小，通常能很好地近似于精确检验(23)当后者可用时（未显示数据）。可以使用R中p.adjust函数提供的任何多重测试调整方法。默认情况下，对-通过Benjamini和Hochberg方法调整值以控制错误发现率(47).

生物CV估算

剩下的问题是获得每个基因的BCV的可靠估计值。需要一个近似无偏且在小样本中表现良好的估计量。BCV的最大似然估计会低估BCV，因为需要从相同的数据估计对数线性模型中的系数。我们早期的工作使用精确的条件似然来估计BCV(22,23)。这种方法具有出色的性能，但不容易推广到GLM。相反，我们使用一种近似的条件似然方法，称为APL(48)。APL是惩罚可能性的一种形式。再次，我们以矢量化和计算效率的方式实现了APL计算，而不是逐个基因计算数量。

估算常见分散度

除非有大量生物复制品可用，否则不应考虑单独估计每个基因的BCV。当复制较少时，基因之间的信息共享对于可靠推断至关重要。无论复制的数量如何，适当的信息共享方法都应该带来一些好处。

让_克表示基因的平方BCV克，我们称之为分散，分散这个基因的基因。离散度是方差函数中二次项的系数。在基因之间共享信息的最简单方法是假设所有基因共享相同的离散度，因此_克 = ϕ (23)。可通过最大化共享似然函数来估计公共离散度

其中APL_克是基因的调整配置文件可能性克（“材料和方法”部分）。这种最大化可以通过多种方式在数值上实现，例如通过无导数近似牛顿算法(49).

估计趋势分散

对常见色散的概括是对色散进行建模_克作为每个基因的平均读取计数的平滑函数(25)。我们的软件提供了许多方法来实现这一点。一种简单的非参数方法是通过平均读取数将基因划分为各个基因库，估计每个基因库中的常见离散度，然后通过这些二进制离散度拟合黄土或样条曲线。一种更复杂的方法是局部加权APL。在这种方法中_克通过进行局部共享对数似然来估计，该似然是基因的APL的加权平均值克以及其相邻基因的平均读计数。

估算基因离散度

在实际科学应用中，单个基因更有可能根据其基因组序列、基因组长度、表达水平或生物功能而具有单个BCV。我们寻求在完全个别的基因分散之间的折衷_克通过扩展Robinson和Smyth提出的加权似然经验贝叶斯方法，完全共享值(22)。在这种方法中，_克通过最大化估计

哪里G公司₀是共享可能性和APL的权重_Sg公司(ϕ_克)是本地共享的log-likelihood。这种加权似然方法可以用经验贝叶斯术语来解释，共享似然是的先验分布_克加权似然作为后验。先验分布可以认为是由对一组G公司₀基因。先前基因的数量G公司₀因此，表示相对于基因的实际观测数据分配给先验的权重克.最佳选择G公司₀取决于基因间BCV的变异性。当基因之间的BCV恒定时，较大的值是最好的。当BCV在基因之间差异很大时，较小的值是最佳的。我们已经发现G公司₀ = 20/df在广泛的实际数据集上给出了良好的结果，其中df是估计BCV的剩余自由度。对于多组实验，df是库的数量减去不同治疗组的数量。默认设置意味着，无论库的实际数量如何，优先权都有20个自由度的权重来估计BCVn个或实验设计的复杂性。

经验贝叶斯方法的一个理想结果是，基因分散或多或少地向先验值挤压，这取决于个体基因分散估计的可靠性。计数非常低的基因为估计其自身的离散度提供的统计信息相对较少，因此，在这些情况下，先验值占主导地位，基因离散度严重挤压到总体趋势。

为了计算方便，在可能的色散值网格上评估遗传和共享APL函数。使用三次样条曲线在网格上插值每个基因的APL值，并将样条曲线的最大值作为基因离散估计。计算数万个基因的共同和基因离散度大约需要20 在笔记本电脑上。

口腔鳞状细胞癌

最近的一项研究调查了口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的差异基因表达(50)。该研究使用应用生物系统SOLiD系统构建了三名口腔鳞癌患者肿瘤和匹配正常组织的RNA-Seq图谱。最初的分析使用了一种直观但特殊的程序来识别差异表达的基因。基因首先根据肿瘤和正常患者的折叠变化进行排序。在三名患者中，按中位数排序，前300个上调基因和前300个下调基因被选为差异表达基因(50)。这个简单的分析要求一个基因在两个患者中排名较高，然后忽略第三个患者的fold-change。这足以获得有趣的生物学结果，但不允许进行任何统计显著性评估。它还将所有折叠变化视为同等可靠，而不管计数的大小。

在这里，我们描述了一种更为正式的分析，评估与生物变异相关的统计显著性。首先，我们从下载了读取计数数据补充表S1图什的等。(50)。该表给出了由RefSeq转录本汇总的读取计数，并进行筛选，以仅包括所有三名患者中至少一个组织（肿瘤或正常组织）的至少50个对齐读取的转录本。研究的全序列数据可从GEO数据库中获得(网址：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo，加入编号GSE20116标准)，但根据汇总的计数进行工作可以确保我们的分析基于与原始分析相同的计数。我们使用Bioconductor注释包org.Hs.eg.db（版本2.5.0）将RefSeq标识符映射到最新的官方基因符号，丢弃数据库中不再存在的任何RefSeq标识。选择外显子数量最多的RefSeq转录本来代表每个独特的基因，并删除多余的RefSeg转录本。这只剩下10只 464个转录本，每个转录本代表一个独特的基因。然后使用M值尺度归一化的加权修剪平均值来估计有效库大小(26).

三种正常组织轮廓之间的总（常见）BCV估计为40%(图1)。三种肿瘤组织之间的BCV明显高于52%，表明肿瘤比正常组织更异质。因此，检测至少两类差异表达的基因是有意义的：第一，那些在所有肿瘤中与匹配的正常组织中一致不同的基因，第二，那些表现出特定于三个肿瘤中一个或两个肿瘤的表达变化的基因。

研究设计有两个解释因素，一个是患者ID，分为三个级别，另一个是组织类型，分为两个级别（正常或肿瘤）。通过将三个连续的对数线性模型拟合到每个基因的读取计数来分析数据(表1)。第一个模型代表了三名患者之间的基线表达差异。第二种是加性模型，允许肿瘤组织与正常组织中一致的相对表达变化。第三种是交互模型，考虑到患者特定的肿瘤效应。

我们的第一个分析是寻找癌症中与正常组织相比持续差异表达的基因。对于此分析，色散估计基于具有两个剩余自由度的可加模型。所有基因的共同BCV被发现过于简单，39个基因显示出比共同BCV更大的变异性证据(图2)家庭错误率为0.05(51)。允许BCV的丰度趋势并没有减少BCV被拒绝的异常基因的数量(图2)。另一方面，允许基因型BCV，使用先验贝叶斯调节G公司₀ = 10，表示没有剩余的不适(图2)。这为在以下分析中使用基因型BCV提供了统计依据。还有一个生物学理由，即三名患者中肿瘤与正常差异不一致的基因将获得更高的BCV估计值，因此在差异表达基因列表中被降级。因此，使用基因型BCV可以让我们关注肿瘤与正常差异一致的基因。

使用基因BCV值，我们通过比较加法模型和基线模型来测试肿瘤和正常组织之间的差异表达。该分析根据患者之间的基线差异进行调整，其方式类似于计算配对t吨-对每个基因进行测试，但要适应计数数据。以错误发现率（FDR）获得1276个基因 < 0.05 (表1,补充表S1)。在头颈部鳞状细胞癌研究中，这些基因中最显著的是那些先前被确定为肿瘤和正常组织之间差异表达的基因。Yu报道的25个基因中等。(52)，18人被列入罗斯福民主共和国的名单 < 0.05 (补充表S2)。另外两个（TNC和FN1）显示折叠变化大于两倍，FDR约为0.4。其余五个基因表现出微小的折叠变化，没有差异表达的证据(补充表S3)。图什等。(50)讨论了9个具有特殊生物学意义的基因。在我们的FDR分析中，确认了其中六个基因（CASQ1、INHBA、MMP1、HMGA2、SHANK2和WIF1）的强差异表达 < 0.001 (补充表S4和S5)。这包括一个通过RT-qPCR验证的基因（HMGA2）。注意，原始研究(50)通过PCR验证了16个基因，但仅鉴定出HMGA2。

为了进一步证明检测到的基因的生物学相关性，我们测试了从MSigDB数据库中富集的精选基因集(53)使用mean-rank基因集富集试验(54)。在FDR < 0.05，这产生了417个富含上调基因的基因集和268个富含下调基因的基因组。显著富集的数据集绝大多数与癌症相关且一致，表明肿瘤中WNT1通路增强，表达特征与其他癌症类似，如基底样乳腺癌(补充表S7和S8)。基因本体分析(55)发现146个GO术语富含上调基因，264个术语富含下调基因。表达上调基因的GO术语往往与细胞发育、增殖和分化以及与肿瘤发展相一致的相关过程有关(补充表S9和S10).

接下来，我们寻找肿瘤异质性与正常差异的基因。理想情况下，该分析应在同一患者的独立组织提取物之间相对于BCV进行。然而，交互模型完全符合可用数据，没有剩余自由度，因此不能用于估计BCV。相反，我们使用根据三名正常患者之间的差异估计的基因BCV进行此分析。这些BCV代表患者间的差异，而非患者内的差异，因此应该高估期望的BCV。因此，我们的分析在一定程度上是保守的对-值和FDR。正常患者之间的BCV在大小上通常与加性模型中的BCV相似，因此保守性可能相对较小。使用这些保守的BCV，对相互作用和加性模型进行比较，得出202个FDR差异表达基因 < 0.05. 在这项分析中排名第一的基因是CDKN2B，它是由Tuch鉴定的等。(50)根据患者8中表达水平与拷贝数变化的相关性，确定其生物学意义。其他两个基因（CCND1，CTTN）同样由Tuch鉴定等。(50)在我们的交互分析中，FDR约为0.1(补充表S6).

模拟研究

通过仿真研究了我们的色散估计器的性能。模拟的第一个场景是最简单的设计，使用一组三个复制库，所有基因的真实BCV恒定值为0.4，以匹配癌症数据。在这个简单的场景中，条件似然提供了偏差最小和最准确的离散估计，Cox–Reid具有很好的可比性(图3a） ●●●●。通常用于基于皮尔逊或偏差残差的广义线性模型的其他估计量表现不佳。这些结果与之前的模拟结果一致(23).

第二种情况与癌症病例研究相匹配，有六个文库和一个2 × 3个加性对数线性模型拟合到每个基因。在这种情况下，条件可能性不适用，考克斯-里德APL是其余可能性中表现最好的(图3b） ●●●●。

接下来，我们生成了随机真分散度（BCV²)根据逆chi平方分布，使用相同的2 × 3如前所述的设计。在这种情况下，经验贝叶斯提供了基因离散度的最精确估计。当先前的重量G公司₀在10–12范围内，对应于20–24先前自由度(图4)。都不是单独的基因估计(G公司₀ = 0）也不常见分散(G公司₀ = ∞) 表现也不错。