自噬。2010年8月16日；6(6): 764–776.
哺乳动物Atg蛋白的分级分析对自噬体形成位点的表征
生理与细胞生物学系；东京医科牙科大学；日本东京文京区
通讯作者。收到日期：2010年3月30日；2010年6月3日修订；2010年6月18日接受。
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补充图表
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摘要
自噬是一种细胞内降解过程，细胞溶质物质通过自噬传递到溶酶体。尽管最近发现了许多自噬相关基因，但自噬体是如何产生的尚不清楚。在这里，我们研究了哺乳动物Atg蛋白之间的等级关系。在饥饿条件下，ULK1、Atg14、WIPI-1、LC3和Atg16L1靶向同一个隔室，而DFCP1定位于这些Atg蛋白附近。就点刺形成而言，包括ULK1和FIP200的蛋白质复合物是最上游的单元，并且是含Atg14的PI3-激酶复合物的点刺形成所必需的。DFCP1和WIPI-1的点状形成需要FIP200和Atg14。Atg12-Atg5-Atg16L1复合体和LC3是这些因素中的下游单元。含有上游Atg蛋白（如ULK1和Atg14）的点状结构与ER紧密相关，其中ER蛋白空泡膜蛋白1（VMP1）也短暂定位。即使用沃特曼素处理细胞以抑制自噬体的形成，这些结构也会形成。这些层次分析表明，ULK1、Atg14和VMP1以PI3-激酶活性独立的方式定位于ER相关的自噬体形成位点。
关键词：自噬体、PI3激酶、分离膜、内质网、ULK
介绍
大自噬（我们简称为自噬）是一种独特的膜介导的运输形式，它将大分子和细胞器从细胞质输送到溶酶体进行降解。在自噬的第一步，包括细胞器在内的细胞质成分被称为隔离膜/吞噬细胞的独特膜池隔离。完全隔离导致自噬体的形成。自噬体与溶酶体融合成为自溶体，其中溶酶体水解酶将内部内容物消化为代谢物，然后释放回胞浆进行再循环。
自噬是从酵母到哺乳动物的进化保守过程。它对许多生理过程都很重要，例如适应饥饿、植入前胚胎发育、预防神经退化、抗衰老机制、肿瘤抑制、入侵微生物的降解和细胞内抗原的呈现。1——6
自噬体的形成主要由自噬相关（Atg）蛋白控制。到目前为止，超过30自动液位计已在酵母中鉴定出基因，这些基因不仅参与饥饿诱导的自噬，还参与细胞质到液泡靶向（Cvt）途径，这是一种组成型生物合成途径，将两种液泡酶，氨基肽酶1（Ape1）和α-甘露糖苷酶（Ams1）输送到自噬体，以及特殊类型的自噬，如细胞自噬和线粒体自噬。其中15个基因(ATG1–10、12–14、16和18)所有类型的自噬都需要。7——9除此之外，饥饿诱导的大自噬还需要ATG17、29和31Atg蛋白在自噬体形成中起重要作用，可分为六个功能复合物/群：（i）Atg1激酶复合物（Atg1-13-17-29-31）；（ii）Atg9；（iii）iii类磷脂酰肌醇（PI）3-激酶复合物（Atg6/Vps30-Atg14-Vps15-Vps34）；（iv）PI（3）P-结合Atg2-Atg18复合物；（v） Atg12共轭体系（Atg12-Atg5）；和（vi）涉及磷脂酰乙醇胺（Atg8-PE）的Atg8结合系统。8,10这些Atg蛋白之间的层次关系也已确定(补充图1).
自噬体起源的鉴定一直是一个长期存在的问题。9有人提出，自噬体来源于粗面内质网或某些高尔基体后膜的无核糖体区域，11,12或重新组装。13在酵母中，假定的自噬体形成位点已被确定；几乎所有Atg蛋白都聚集在一个称为前自噬体结构（PAS）的空泡周围隔室。14,15活细胞成像实验表明，自噬体确实是由这种结构产生的。14然而，考绩制度的确切性质仍然未知。
在哺乳动物中，几乎所有的Atg蛋白都是保守的。9,16,17雷帕霉素（mTOR）复合物1的哺乳动物靶点（mTORC1）与由unc-51样激酶1（ULK1，Atg1同源物）、Atg13、200 kD的黏着斑激酶家族相互作用蛋白（FIP200，Atg17的假定功能对等物）和Atg101组成的多聚体复合物相互作用并进行调控。18——24自噬特异性III类PI3-激酶复合物最近也被鉴定为Beclin 1（Atg6/Vps30同源物）-Atg14-Vps34-Vps15复合物。25——28Atg18同源物被称为WIPI（与磷脂相互作用的WD-重复蛋白）家族蛋白（WIPI-1-4）。29两个结合系统——Atg12系统和Atg8/LC3（微管相关蛋白轻链3）系统——在哺乳动物中也很保守。30然而，这些哺乳动物Atg蛋白之间的层级关系尚未完全建立。例如，ULK1复合物和自噬特异性III类PI3-激酶复合物（Beclin 1-Atg14-Vps34-Vps15）的相互依赖性尚不明确。
此外，尚未在哺乳动物细胞中描述PAS等效结构，这限制了我们对哺乳动物细胞自噬体形成的理解。最近，Ktistakis的团队发现，一种新的PI（3）P-结合蛋白，称为双FYVE含蛋白1（DFCP1），其同源物在酵母中不存在，在饥饿期间易位到内质网的一个亚结构域并产生“omegasome”。31LC3阳性结构在DFCP1阳性omegasome处或其附近生成。这一重要发现表明，内质网的某个亚结构域在哺乳动物细胞自噬体的形成中起着关键作用。最近，已证明隔离膜和ER之间存在直接连接。32,33然而，该亚结构域的特征以及DFCP1和其他Atg蛋白之间的关系仍有待确定。
在本研究中，为了表征哺乳动物细胞中的自噬体形成位点，我们首先使用各种Atg缺陷细胞系和PI3-激酶抑制剂沃特曼（wortmannin）的组合确定了哺乳动物Atg蛋白（包括DFCP1）之间的层次关系。最上游的因子是ULK1-FIP200复合物，其次是含有Atg14的PI3-激酶复合物。包括DFCP1在内的其他下游因子的点刺形成依赖于ULK1复合物和PI3-激酶活性。基于这些发现，我们进一步分析了上游因子的定位，发现ULK1和Atg14点状结构与ER膜紧密相关。液泡膜蛋白1（VMP1）也独立于其他Atg蛋白定位于自噬体形成位点。这些位点可能代表哺乳动物细胞中自噬体的形成位点。
结果
在饥饿期间，ULK1、Atg14、WIPI-1、Atg16L1和LC3共同定位于靠近DFCP1点状结构的相同点状结构。
对哺乳动物Atg蛋白的分析已确定至少三种关键蛋白质复合物：ULK1-Atg13-FIP200-Atg101复合物、Beclin 1-Atg14-Vps34-Vps15（III类PI3-激酶）复合物和Atg12-Atg5-Atg16L1复合物。此外，WIPI-1、LC3和DFCP1也参与自噬体的生成。我们首先使用针对内源性蛋白或稳定表达GFP-或HA-标记蛋白的细胞的抗体，在饥饿条件下检查了各组代表性因子（ULK1、Atg14、Atg16L1、WIPI-1、LC3和DFCP1）的定位。
而这些Atg蛋白在正常生长条件下仅显示少量点状结构(补充图2A)在饥饿期间，它们的数量增加了。正如我们之前观察到的，18,25ULK1和Atg14点几乎与Atg16L1完全共存（98.1%±1.2%的ULK1点对Atg16L2呈阳性）(和补充图2B). 因为Atg16L1和Atg5可以作为隔离膜的标记(补充图2C),34这些ULK1和Atg14点主要代表隔离膜。事实上，ULK1点与Atg14共定位良好（92.6%±2.8%的ULK1点状物对Atg14阳性）().
ULK1、Atg14、WIPI-1、Atg16L1和LC3共同定位于同一隔间，该隔间非常靠近DFCP1结构。（A–H）在饥饿培养基中培养1小时，稳定表达GFP-ULK1（A）、GFP-ULK1和HA-Atg14（B）、HA-Atg 14和GFP-WIPI-1（C）、HA-WIPI-1。然后固定、渗透细胞，并使用抗HA（B、C、G和H）、抗Atg16L1（A、D和E）和抗LC3抗体（F）进行免疫荧光显微镜检查。由于低表达，GFP-ULK1和GFP-DFCP1被抗GFP抗体染色。箭头表示几乎完全的共同定位，箭头表示相邻的共同定位。用虚线表示的结构进行了线扫描分析（如J、K和补充图3). 信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。（一） 饥饿1小时后，所示Atg蛋白对之间完整和相邻共定位的量化。数据表示十幅图像的平均值±SE。从具有代表性的点状结构中获得（J–K）线扫描，显示GFP-WIPI-1和Atg16L1（J）之间以及HA-WIPI-1与GFP-DFCP1（K）之间存在共定位。原始结构如（D和H）所示（用虚线表示）。（L） Atg punate结构的三维重建。用激光共聚焦显微镜观察饥饿1小时的细胞，然后重建3D图像。还显示了从Z截面重建的侧面图像。比例尺，1µm。
WIPI-1是一种Atg18同源物，先前显示与LC3共定位。29我们的分析表明，虽然只有部分LC3点与WIPI-1以及Atg14共同定位（43.7%±1.8%的LC3点对WIPI-1阳性）(补充图2D和E)，WIPI-1与Atg14和Atg16L1共定位良好（81.6%±3.6%的Atg14点对WIPI-1阳性，98.5%±0.6%的Atg16L1点对WIPI-1阳性，69.8%±2.8%的WIPI-1点对Atg16L2阳性）(和D)表明WIPI-1主要存在于隔离膜上，而不是完整的自噬体（LC3-阳性）。
接下来我们研究了DFCP1的本地化。DFCP1是一种与内质网相关的含有FYVE结构域的蛋白质，在饥饿时易位到被称为omegasomes的内质网亚结构域，该亚结构域与LC3和Vps34点非常接近。31只有47.8%±2.1%的LC3结构对DFCP1阳性，而83.3%±3.5%的DFCP1结构对LC3阳性，再次表明成熟自噬体上没有DFCP1(). 与之前的报告一致，我们发现大多数GFP-DFCP1突起与Atg16L1、Atg14和WIPI-1（另一个PI（3）P-结合蛋白）突起非常接近，而不是完全共存(、G–I和L).
这些蛋白质的共放大在线条扫描图中以图形方式显示(和K，以及补充图3). 这些结果表明，在自噬诱导后，ULK1、Atg14、WIPI-1、LC3和Atg16L1靶向同一隔室，这很可能是一个隔离膜，DFCP1定位于这些Atg蛋白附近。
LC3和Atg12系统在FIP200和PI3-激酶下游发挥作用。
接下来，我们确定了哺乳动物Atg蛋白在酵母细胞中的等级关系(补充图1).10为此，我们使用缺乏Atg3（LC3-PE结合所需的E2酶）、Atg5和FIP200的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）克隆分别抑制LC3和Atg12结合系统以及ULK1复合物的功能。我们用HA-WIPI-1、GFP-DFCP1、GFP-Atg14、GFP-ULK1和GFP-LC3转染野生型、Atg3 KO、Atg5 KO和FIP200 KO MEF克隆，并生成稳定表达每个结构的转化子。我们检测了这些标记蛋白在常规或饥饿培养基中的定位，包括或不包括PI3-激酶抑制剂沃特曼。
首先，作为这一综合层次分析的一部分，我们分析了饥饿诱导的LC3和Atg16L1突起形成，其中大多数已经在先前的研究中报道过。在Atg3 KO、Atg5 KO和FIP200 KO MEF中LC3点状结构被抑制().18,34,35内源性Atg16L1点状结构的形成在Atg5敲除（KO）细胞中也受到抑制，34FIP200 KO细胞和沃特曼处理细胞()，但在Atg3 KO细胞中增强，即使在常规培养基中培养().35这些结果证实了Atg12-Atg5-Atg16L1复合物在LC3系统上游和ULK1和PI3-激酶复合物下游发挥作用。
GFP-LC3和内源性Atg16L1在Atg3 KO、Atg5 KO和FIP200 KO MEF中的定位。在Atg3 KO、Atg5 KO和FIP200 KO MEF以及沃特曼处理的细胞中评估GFP-LC3（A）和内源性Atg16L1（B）的点状形成。野生型MEF和缺乏稳定表达GFP-LC3的Atg3、Atg5和FIP200的MEF在常规或饥饿培养基中培养2小时，添加或不添加0.2µM沃特曼。然后固定细胞并用荧光显微镜检查。为了检测Atg16L1，用抗Atg16L抗体对细胞进行染色。比例尺，10µm。图显示了点阳性细胞的量化结果（每个细胞超过20点（A）和5点（B））。所示结果表示含有100个以上细胞的一式三份样品的平均值±SE。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。
WIPI-1和DFCP1结构的形成受ULK1-FIP200和Atg14-PI3激酶复合物的调节。
WIPI-1是一种PI（3）P-结合蛋白，如前所述，在野生型细胞中其点状结构被沃特曼抑制().29在FIP200 KO细胞中其点状结构也被抑制(). 然而，在Atg3 KO和Atg5 KO细胞中，即使在营养丰富的条件下，也会产生更多的WIPI-1点，并且在饥饿后数量会进一步增加(). 这些WIPI-1点的积累被沃特曼抑制(). 因此，WIPI-1应在ULK1和PI3-激酶复合物的下游发挥作用，并可能在Atg12-Atg5-Atg16L1复合物和LC3的上游发挥作用。
PI（3）P-结合蛋白WIPI-1和DFCP1的Puncta形成在FIP200-KO-MEFs和wortmannin处理的细胞中是有缺陷的。将缺乏Atg3、Atg5和FIP200的MEFs及其相应的用HA-WIPI-1（A）或GFP-DFP1（B）稳定转化的野生型对照MEFs在常规或饥饿培养基中培养1小时，加入或不加入0.2µM wortmannin。然后固定、渗透细胞，并使用抗HA（A）或抗GFP抗体（B）进行免疫荧光显微镜检查。图表显示了点阳性细胞的量化结果。Y轴表示%的单元格显示超过10个点。所示结果代表含有100个以上细胞的三份样品的平均值±SE。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。比例尺，10µm。
据报道，DFCP1在饥饿期间定位于欧米伽马体，这种易位依赖于DFCP1的FYVE结构域。31与本报告一致，DFCP1在营养丰富的条件下主要表现为网状和高尔基样结构，而DFCP1点状结构在饥饿后变得明显，这一过程对沃特曼蛋白很敏感(). 相反，即使在富含营养的条件下，Atg3 KO和Atg5 KO细胞中也已经存在相当数量的DFCP1点(). 沃特曼抑制了这些点的形成，排除了这些可能是非生理聚集的可能性。最后，即使在饥饿期间，FIP200 KO细胞中的DFCP1点形成也被完全抑制(). 这些数据表明，与WIPI-1一样，DFCP1在Atg12-Atg5-Atg16L1复合物和LC3的上游以及ULK1和PI3-激酶复合物的下游发挥作用。
哺乳动物细胞中至少存在两种III类PI3-激酶复合物。Beclin 1-Atg14-Vps34-Vps15复合物对自噬很重要，而Beclin 1-UVRAG（Vps38）-Vps34-Vps15复合物，偶尔包括Rubicon，对调节内吞作用很重要。25——28因此，我们确定WIPI-1和DFCP1的定位是否确实依赖于自噬特异性PI3-激酶复合物。用抗Vps34和Atg14的siRNAs处理细胞可抑制WIPI-1的穿孔形成()和DFCP1(). 这些结果表明，WIPI-1和DFCP1都是自噬相关PI3-激酶的真正效应器，尽管它们不是共同定位的().
WIPI-1和DFCP1的点状结构取决于Atg14和Vps34。如图所示，用Atg14、Vps34或对照siRNA寡核苷酸处理稳定表达GFP-WIPI-1（A）的HepG2细胞和稳定表达GFP-DFCP1（B）的HeLa细胞。细胞在饥饿培养基中培养2小时，然后使用抗GFP抗体进行免疫荧光显微镜检查。图形显示GFP点阳性细胞的量化结果（每个细胞超过5个点）。所示结果代表含有100个以上细胞的三份样品的平均值±SE*p<0.05，**p<0.01，学生t检验。常规培养基；St.M.，饥饿培养基。比例尺，10µm。
Atg14泪点的形成依赖于ULK1-FIP200复合体。
我们之前发现，Atg14点状形成对沃特曼治疗具有耐药性。25Atg3 KO和Atg5 KO细胞中的Atg14点形成也不受影响，即使存在沃特曼(). 然而，在FIP200 KO细胞中未观察到这些点状结构，这表明含有Atg14的PI3-激酶复合物在ULK1复合物下游以及Atg12-Atg5-Atg16L1复合物和LC3上游发挥作用。
抗Wortmann-resistant ULK1和Atg14 punta在Atg3 KO和Atg 5 KO细胞中生成，但在FIP200 KO细胞内不生成。（A和B）缺乏Atg3、Atg5和FIP200的MRF及其相应的野生型对照MEF，稳定表达GFP-Atg14（A）或GFP-ULK1（B），在含有0.2µM沃特曼的常规或饥饿培养基中培养1小时。然后使用抗GFP抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。图形显示GFP点阳性细胞的量化结果（每个细胞超过10点）。所示结果表示含有100个以上细胞的一式三份样品的平均值±SE。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM，沃特曼；WT，野生型。比例尺，10µm。（C） 哺乳动物Atg蛋白在点状结构方面的层次分析概述。“+”和“−”分别表示是否形成了punta。
ULK1点状结构的形成显示出与Atg14点状结构相似的模式。ULK1点状结构对沃特曼蛋白具有耐药性，并且在沃特曼存在的情况下不受Atg3和Atg5缺失的影响(). 然而，正如我们之前报告的那样，如果不添加沃特曼，则在Atg5 KO MEF中未观察到ULK1斑点。18在Atg5 KO细胞中，ULK1可能会迅速从自噬体中间结构中分离出来，但当沃特曼治疗在早期阻断自噬体形成时，ULK1可能会留在中间结构上。我们目前的数据表明，Atg5对ULK1点的产生不是必需的，但对于保持ULK1在膜上的存在可能很重要。如前所述，ULK1穿孔形成需要FIP200作为结合伙伴。18
综上所述，哺乳动物Atg蛋白的层次分析结果总结于ULK1-FIP200复合物似乎是最上游的因子，其次是含有Atg14的PI3-激酶复合物及其假定效应物（DFCP1和WIPI-1）、Atg12-Atg5-Atg16L1复合物和LC3。
早期自噬结构与内质网膜紧密相关。
而沃特曼抑制隔离膜的形成36和欧米伽索姆，31它不会影响ULK1和Atg14的定位(). 在沃特曼存在下，ULK1仍然与Atg14共定位，这表明这些点可以代表功能性中间结构(). 我们之前报道过Atg14点与Vps34在饥饿细胞中共同定位，25在沃特曼处理的细胞中也保持了这种共定位(). 这些数据表明，在沃特曼蛋白存在下观察到的ULK1和Atg14点状结构可能代表位于自噬体形成部位的早期自噬结构。
ULK1穿孔与ER膜紧密结合。稳定表达GFP-ULK1（A）或Vps34-GFP（B）的（A和B）NIH3T3细胞与HA-Atg14一起在含有0.2µM沃特曼的饥饿培养基中培养1小时。然后固定、渗透细胞，并使用抗HA和抗GFP（针对GFP-ULK1）抗体进行免疫荧光显微镜检查。信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基；WM、沃特曼。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。（C） 稳定表达GFP-ER（含大鼠细胞色素b5跨膜区）和HA-ULK1的MEF在饥饿培养基中培养1小时，加入或不加入0.2µM沃特曼，然后使用抗GFP和抗HA抗体进行免疫荧光显微镜检查。显示了从在饥饿介质中稳定表达GFP-ULK1和mRFP-ER的MEF的延时电影中选择的（D和E）帧，包括（E）或不包括（D）0.2µM沃特曼。饥饿处理开始后30分钟（D）或90分钟（E）开始对细胞进行成像。GFP-ULK1的定位用箭头表示。请参阅视频1和2以获取完整图像。信号颜色由字体的颜色表示。St.M.，饥饿培养基；WM、沃特曼。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。
越来越多的证据表明内质网参与自噬体的形成：内质网来源于内质网，31隔离膜和ER之间有直接的连接。32,33因此，我们检测了ULK1点与内质网的关系。在用HA-ULK1稳定转化的细胞中，ULK1点状物经常与内质网膜相关(). 在活细胞成像实验中，GFP-ULK1点位于内质网或其附近，并与内质网网状结构一起移动(和补充视频1). 在沃特曼处理的细胞中也观察到这种关联(和补充视频2). GM130（一种顺式高尔基体标记物）和Lamp1（一种晚期内体/溶酶体标记物）均未与ULK1-Atg14点共同定位(补充图4A–C). 此外，大多数ULK1点与TOM70（线粒体标记物）没有共同定位(补充图4D). 这些数据表明，在需要PI3-激酶活性的步骤之前，ULK1和Atg14靶向内质网上或附近的早期自噬结构。
VMP1定位于早期自噬结构，但在自噬体形成的后期发挥作用。
ULK1 puncta可能定位于ER的某些子域。我们测试了这些位点是否代表ER上或附近的已知结构，但是，ULK1没有与Sec23A（ER-exit位点标记）或ERGIC-53（ER-Golgi中间区，ERGIC，标记）共定位(补充图4E和F).
众所周知，VMP1是一种与ER相关的跨膜蛋白，参与自噬体的形成并与Beclin 1相互作用。37VMP1最初被鉴定为一种胰酶诱导蛋白，在酵母中不存在。38网柄菌VMP1是自噬体形成以及各种其他细胞器的完整性/生物发生所必需的。39,40我们推测VMP1也可以靶向自噬体形成位点。为了确定VMP1的精确亚细胞定位，我们构建了稳定表达VMP1-GFP的MEF。VMP1位于核周高尔基样结构和细胞质中的网状结构(). 我们还证实VMP1主要与蛋白质二硫键异构酶（一种ER标记）和syntaxin 6（一种高尔基标记）在OptiPrep密度梯度上进行共分馏(). 另一方面，Beclin 1的大部分未与VMP1共分离。
VMP1定位于早期自噬结构。稳定表达VMP1-GFP和RFP-ER或HA-ULK1的（A和C–E）MEF在常规或饥饿培养基中培养1小时，添加或不添加0.2µM沃特曼。使用抗HA抗体对细胞进行免疫荧光显微镜检查。VMP1和ULK1之间的彩色化用箭头表示。（B） 稳定表达VMP1-GFP的MEF在常规培养基中培养，并按照材料和方法中的描述进行亚细胞分离。免疫印迹分析显示VMP1-GFP、Beclin 1、蛋白二硫键异构酶（PDI，ER标记）、突触蛋白6（高尔基标记）和HSP90（细胞质蛋白标记）的分布。（F） 图中显示了VMP1和ULK1之间共定位的量化结果。Y轴表示ULK1点的VMP1-正性（%）。所示结果代表10个细胞的平均±SE*p<0.01，学生t检验。（G） 在营养丰富的条件下，观察到野生型和FIP200 KO MEF稳定表达VMP1-GFP。（H） 用VMP1或对照siRNA寡核苷酸处理稳定表达HA-ULK1、GFP-WIPI-1和GFP-DFP1的HeLa细胞。细胞在饥饿培养基中培养1小时，然后使用抗HA、抗GFP和抗Atg16L1抗体进行免疫荧光显微镜检查。信号颜色（A和C–E）由字体颜色表示。常规培养基；St.M.，饥饿培养基；WM、沃特曼。比例尺，10微米（白色）和1微米（黄色）。（一） 如图所示，用VMP1或对照siRNA寡核苷酸处理HeLa细胞。细胞在饥饿培养基中培养2小时，加入或不加入20 mM氯喹啉，然后通过免疫斑点分析测定饥饿诱导的p62降解和溶酶体依赖的LC3周转。
与之前的报告相比，VMP1点出现在饥饿之后，37即使在营养丰富的条件下，我们也检测到点状VMP1结构。这并不是由于VMP1-GFP过度表达导致自噬的结构性激活，因为ULK1点状细胞仅在饥饿后诱导(和D). 这些VMP1点与内质网有关(). 在饥饿条件下，VMP1点的数量没有增加，并且与ULK1几乎没有共同定位（大约5%的ULK1点对VMP1呈阳性）(和F). 然而，在沃特曼治疗后，约50%的ULK1点刺与VMP1共定位(和F). 这些结果表明VMP1暂时与早期自噬结构相关，并以PI3-激酶依赖的方式与它们分离。
接下来，我们检查了ULK1和VMP1之间的层次关系。与野生型细胞相比，FIP200 KO细胞产生VMP1点并变得更大()尽管FIP200 KO细胞中ER结构保持完整(补充图5A). 这表明VMP1可能是ULK1复合体的上游因子。然而，VMP1沉默并没有阻止ULK1突起的形成；相反，它诱导了ULK1、WIPI-1、DFCP1和Atg16L1异常大的阳性结构(,补充图5B). p62是一种选择性自噬底物，41VMP1-siRNA-处理的细胞中积累并对饥饿诱导的降解和溶酶体依赖的LC3转换产生抵抗，这证实了这些细胞中的自噬降解确实被阻断(). 这些数据表明，补充ULK1、WIPI-1、DFCP1和Atg16L并不需要VMP1，但似乎在后期自噬结构的成熟/转换中发挥了重要作用。
讨论
在本研究中，我们检测了ULK1、Atg14、DFCP1、WIPI-1、Atg16L和LC3的细胞内定位。结合我们之前对Atg13、FIP200、Atg101、Vps34、Atg12和Atg5的研究，这些数据表明，除DFCP1外，几乎所有哺乳动物的Atg蛋白在诱导自噬时都聚集在同一个隔间。尽管DFCP1 punta显示出独特的图案，但它们始终与这些Atg结构非常接近。这与之前的一份报告一致，该报告证明DFCP1标记的omegasomes与LC3、Atg5和Vps34点相邻。31
然后，我们分析了这些哺乳动物自噬蛋白在点刺形成方面的层次关系，并证明ULK1复合体似乎是最上游的单位，其次是含有Atg14的PI3-激酶复合体、DFCP1/WIPI-1、Atg12系统和LC3系统(). 基本层次与酵母Atg蛋白相似，10但我们定义了高等真核生物特异性FIP200和DFCP1的功能步骤。我们进一步揭示，这些自噬因子聚集在与内质网紧密相关的位点，在那里VMP1暂时定位(). ULK1和Atg14以一种对饥饿作出反应的方式定位于这些位点，即使存在沃特曼蛋白。因此，我们假设这些位点代表哺乳动物的自噬体形成位点，可能相当于酵母PAS。
哺乳动物自噬体形成模型和自噬蛋白之间的等级关系。在初始阶段，ULK1和Atg14复合物定位于内质网上或附近的自噬体形成位点。VMP1也暂时与该结构相关。Wortmann处理导致ULK1-Atg14-VMP1结构的积累，这表明该结构的解离而非形成取决于PI3-激酶的活性。在这一步骤的下游，两个PI（3）P结合蛋白WIPI-1和DFCP1、Atg12-Atg5-Atg16L1复合物和LC3-PE起到适当延长隔离膜的作用。箭头表示哺乳动物Atg蛋白之间对点刺形成的相互依赖性。
这一层次分析的一个显著发现是，在FIP200 KO细胞中没有生成Atg14点状结构(). 由于已经证明Beclin 1可以通过Bcl-2以营养依赖的方式直接结合来调节，42——44含有Beclin-1-Atg14的PI3激酶复合物似乎受到来自mTOR-ULK1和Bcl-2的两种主要营养信号通路的调节。另一个有趣的观察结果是，尽管两种PI（3）P-相互作用蛋白DFCP1和WIPI-1的定位不同，但它们都受到ULK1和Atg14复合物的控制。然而，目前尚不清楚Atg14如何影响DFCP1的易位，DFCP1似乎发生在一个单独的结构上，可能发生在内质网膜上。31我们和其他人之前已经观察到，除了点状结构外，一些Atg14还以网状模式出现25这些结构可能代表ER。26这两种不同的Atg14复合物群体（弥散ER和点状模式）可能在不同的膜上产生PI（3）P，DFCP1和WIPI-1靶向于此。
尽管最近在阐明自噬体形成的分子机制方面取得了进展，但隔离膜的起源仍然没有答案。尽管如此，已有多条证据表明内质网参与了自噬体的形成。建议将隔离膜与ER区分开来，11事实上，正在形成的隔离膜通常与粗略的内质网相关并直接相连。32,33,45,46对酵母的研究表明，酵母自噬体的形成需要早期分泌途径蛋白。47——49此外，靶向ER但非靶向线粒体的Bcl-2通过隔离Beclin 1抑制自噬。42,50最后，DFCP1从ER易位到LC3-相关的omegasome。31
在本研究中，我们发现早期自噬结构与内质网相关，支持内质网在自噬体形成中起关键作用的观点。然而，目前尚不清楚这些ULK1-Atg14结构是否代表内质网膜本身的某些特殊位点，或与内质网紧密相关的某些未知的独特结构。该位点似乎由至少两种不同的成分组成，因为DFCP1和其他Atg蛋白的定位是不同的，虽然他们经常很接近().
我们的进一步分析显示VMP1与早期自噬结构短暂相关(). 然而，VMP1的功能步骤似乎不是Atg蛋白的上游，因为VMP1沉默会导致包含ULK1、WIPI-1、DFCP1和Atg16L1的异常自噬膜的积累(). 尽管有报道称VMP1与Beclin 1相互作用，但VMP1 siRNA的表型与沃特曼抑制PI3-激酶的表型不同。此外，大多数Beclin 1未与VMP1共分馏(). 这些结果表明VMP1在自噬途径中的主要功能不是通过调节PI3-激酶活性。VMP1可能提供后期自噬体形成所需的基本成分。需要进一步分析来阐明VMP1在自噬体形成中的作用。
材料和方法
细胞培养和转染。
将MEFs（小鼠胚胎成纤维细胞）、HeLa和HepG2细胞培养在添加了10%FBS、50µg/ml青霉素和链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）中，在5%的CO中培养2培养箱（常规培养基）。NIH3T3细胞保存在含有10%小牛血清和抗生素（常规培养基）的DMEM中。在5 KO，51fip200ko，52和Atg3 KO35MEF是以前生成的。饥饿时，用PBS清洗细胞，并在无血清的无氨基酸DMEM中培养（饥饿培养基）。使用FuGENE 6试剂（Roche Applied Science，1814443）进行转染。从Sigma（P8833）购买Wortmanin和puromycin。
逆转录病毒感染和稳定细胞系的产生。
如前所述，使用逆转录病毒表达系统生成稳定的细胞系。18简而言之，使用FuGENE 6试剂用pMXs载体瞬时转染Plat E细胞（由北村T.Kitamura提供）。培养72小时后，收集含有逆转录病毒的生长培养基。将MEF和NIH3T3细胞与收集到的含有8µg/ml聚乙烯的病毒培养基培养24小时。通过嘌呤霉素筛选去除未感染细胞。
抗体。
小鼠单克隆抗HA（16B12）抗体购自Covance Research Products（MMS-101R）。大鼠单克隆抗GFP抗体（GF090R）购自Nacalai Tesque（04404-84）。抗Beclin 1的兔多克隆抗体，25LC3（SK2-6）54和Atg16L155如前所述。小鼠单克隆抗GM130和抗HSP90抗体购自BD bioscience({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“G65120”，“term_id”：“14626829”}}G65120型, 610419). 兔多克隆抗Lamp1抗体由Y.Tanaka（日本福冈九州大学）提供。56K.Mihara（日本福冈九州大学）提供了兔抗TOM70的多克隆抗体和ibodies。57小鼠单克隆抗Syntaxin 6抗体购自Abcam（ab12370）。兔多克隆抗PDI抗体先前已有描述。58豚鼠多克隆抗p62抗体购自Progen（GP62-C）。
免疫细胞化学。
用PBS清洗盖玻片上生长的细胞，并在4°C下将其固定在PBS中4%多聚甲醛中10分钟。用50µg/ml洋地黄素在PBS中渗透固定细胞5分钟，用3%的BSA在PBS内封闭30分钟，并与一级抗体孵育1小时。清洗后，用AlexaFluor 488-共轭山羊抗鼠、抗兔或抗鼠IgG或AlexaFlu 564-共轭山羊抗兔或小鼠IgG二级抗体（Invitrogen）培养细胞30分钟，并在配备CCD相机（ORCA ER，Hamamatsu Photonics）的荧光显微镜（IX81；Olympus）下检查。使用MetaMorph图像分析软件7.0版（分子器件）进行行扫描分析。每个通道中的像素强度都是沿着穿过双图像的直线相对于位置绘制的。基于一系列共焦图像（FV1000，奥林巴斯）的3D重建，这些共焦图像以0.1µm的间隔拍摄，并通过FV10-ASW软件（Olympus）进行分析。
荧光显微镜和延时成像。
使用配备CCD相机（ORCA ER，哈马松光电公司）的显微镜（IX81）进行荧光显微镜检查。使用Olympus 60x PlanAPO油浸透镜（数值孔径1.42）。对于延时分析，细胞被镀在玻璃底盘上，并安装在一个用于实时记录的室内，条件保持在5%CO237°C时。使用MetaMorph图像分析软件7.0版（分子器件）分析数据。
RNA干扰。
如前所述，针对人类Atg14和Vps34的隐形RNAi寡核苷酸（Invitrogen）用于siRNA实验。25用于VMP1 siRNA的序列如下：人VMP1siRNA反义序列，5′-UAU ACG UUG CAC AUA CUG UUG-AUG C-3′，sense，5′-GCA UCA ACA GUA UGU GCA ACG UAU A-3′。对于阴性对照，使用隐形RNAi阴性对照双链（Invitrogen，12935-300）的中型GC双链。根据制造商的协议，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen，13778-150）将隐形RNAi寡核苷酸转染到细胞中。2天后，除非另有规定，否则再次用相同的siRNA转染细胞，并在分析前再培养3天。
亚细胞分离。
用0.5%胰蛋白酶-EDTA培养和收获MEF。将细胞重新悬浮在常规培养基中并制成颗粒。将细胞颗粒重新悬浮在均质缓冲液中（20 mM HEPES（pH 7.4）、0.22 M甘露醇、0.07 M蔗糖、0.5 mM EDTA、0.5 mM PMSF、10µg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂和完全蛋白酶抑制剂混合物（罗氏应用科学，11873580001）），并通过27号针头传代20次。核后上清液（PNS）是在500×克将PNS置于11 ml线性5–30%OptiPrep梯度液（Sigma，D1556）中，该梯度液在4℃均质缓冲液中制备。使用贝克曼SW41转子在4°C下以38000 rpm的转速离心梯度12小时。从梯度顶部仔细收集14个组分（每个0.75 ml）。如图所示，使用针对单个细胞器标记的抗体进行免疫印迹分析。
定量PCR。
如前所述进行实时PCR。25使用的引物组合如下：人类VMP1正向、5′-TGG GCA CAC CAC AGG GAG AA-3′和反向、5′-CCG CTG GAT TCG TTT GG-3′和人类β-actin正向、5’-ATT GCC GAC AGG ATG CAG AA-3’和逆向、5′-ACA TCT GCT GGA AGG TGG ACA G-3′。
致谢
我们感谢Masaaki Komatsu博士（东京都医学院）提供Atg3 KO MEF，Roger Y.Tsien博士（圣地亚哥加州大学）提供mRFP cDNA，Katsuyoshi Mihara博士（九州大学）提供大鼠细胞色素b5 cDNA，Toshio Kitamura博士（东京大学）提供逆转录病毒载体和Plat-E细胞，Dr。Yoshitaka Tanaka（九州大学）检测抗Lamp1抗体，Jun-Lin Guan博士（密歇根大学）检测FIP200 KO细胞。我们还感谢石原直田博士的有益讨论。这项工作得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部的科学研究补助金（给N.M.）以及日本青年科学家科学促进会的研究奖学金（给E.I.）的部分支持，东丽科学基金会和武田科学基金会（致新墨西哥州）。
缩写
| PI3-激酶 | 磷脂酰肌醇3-激酶 |
| PAS公司 | 自噬体前结构 |
| 连续可变电压 | 细胞质-空泡靶向 |
| DFCP1型 | 双FYVE结构域蛋白1 |
| FIP200型 | 200 kD黏着斑激酶家族相互作用蛋白 |
| 科 | 淘汰赛 |
| 生命周期3 | 微管相关蛋白1轻链3 |
| MEF公司 | 小鼠胚胎成纤维细胞 |
| mRFP公司 | 单体红色荧光蛋白 |
| ULK1系列 | unc-51样激酶1 |
| VMP1（VMP1） | 液泡膜蛋白1 |
| 世界知识产权组织 | WD-重复蛋白与磷脂相互作用 |
工具书类
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