跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2007年5月16日；26(10):2527-39.
doi:10.1038/sj.emboj.7601689。 Epub 2007年4月19日。

Beclin-1中Bcl-X（L）和类BH3结构域之间的功能和物理相互作用

M Chiara Maiuri先生 1, 勒图梅林, 阿尔弗雷多·克里奥洛, Jean-Christophe雨, 法比安·戈蒂埃, 菲利普·朱恩, 埃兹吉·塔斯德米尔, 杰拉德·皮尔龙, 科斯图拉·特鲁利纳基, 内克塔里奥斯·塔维纳拉基斯, 约翰·A·希克曼, 奥利维尔·杰恩斯特, 吉多·克罗默
附属公司

Beclin-1中Bcl-X（L）和类BH3结构域之间的功能和物理相互作用

M Chiara Maiuri先生等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-X（L）结合并抑制Beclin-1，一种重要的自噬介质。在这里，我们证明这种相互作用涉及Beclin-1（残基114-123）中的BH3结构域。当Beclin-1的BH3结构域或Bcl-X（L）的BH3受体结构域发生突变时，Beclin-1和Bcl-X（L）之间的物理相互作用消失。Beclin-1的BH3结构域或Bcl-X（L）的BH3受体结构域的突变消除了Beclin-1触发的Bcl-X（L）介导的自噬抑制。药理学BH3模拟物ABT737竞争性抑制Beclin-1和Bcl-2/Bcl-X（L）之间的相互作用，拮抗Bcl-2/Bcl-X（L）对自噬的抑制，从而刺激自噬。敲除或敲除BH3-only蛋白Bad可减少饥饿诱导的自噬，而Bad过度表达可诱导人类细胞自噬。秀丽隐杆线虫唯一BH3-only蛋白EGL-1的获得性功能突变诱导自噬，而EGL-1缺失则会破坏饥饿诱导的自噬。这些结果揭示了BH3-only蛋白的一种新的自噬刺激功能，超出了其作为凋亡诱导剂的既定作用。BH3-only蛋白质和药理BH3模拟物通过竞争性破坏Beclin-1和Bcl-2或Bcl-X（L）之间的相互作用诱导自噬。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
Bcl-X之间的物理相互作用L（左）/Bcl-2和Beclin-1的BH3-样结构域。(A）选择与Bcl-X相互作用的Beclin-1片段L（左）/酵母双杂交系统中的Bcl-2。黑线表示与Bcl-X相互作用的Beclin-1片段（灰色）L（左）（图的上部）或Bcl-2（下部）。▪, CEMC7库；•，人胸腺细胞文库；·，胎盘文库和★, 人脑库。与Bcl-X交互所需的最小交互域L（左）/Bcl-2位于aa 112和159之间。(B类)Beclin-1类BH3域与已建立的BH3域对齐。L116A Beclin-1和F123A Beclin-1描述了两种Beclin-1突变肽。(C类)荧光偏振分析表明含有Beclin-1 BH3-样结构域的肽与Bcl-X相互作用L（左）.重组Bcl-XL（左）在没有或存在野生型（WT）Beclin-1 BH3或B中描述的两种突变肽中的任何一种的情况下，用羧基荧光素标记的Bak BH3肽孵育ΔTM(D类)重组Bcl-X相互作用的亲和力测定L（左）ΔTM和荧光Beclin-1 BH3，通过荧光偏振。WT Bcl-X的比较L（左）（正方形）和G138A Bcl-XL（左）（三角形）显示（平均值±s.d。，n个=3个单独的实验）。(E类)Bcl-X的共免疫沉淀L（左）和WT或突变型Beclin-1。HeLa细胞转染所示结构，然后免疫沉淀标记的Bcl-XL（左）Beclin-1的免疫化学检测。(如果)Beclin-1与野生型和突变体（G138A）Bcl-X的免疫共沉淀L（左）。结果代表了至少三个产生类似结果的实验。
图2
图2
ABT737抑制Beclin-1和抗凋亡Bcl-2蛋白之间的相互作用。(A类)Beclin-1 BH3和ABT737对Bcl-X的竞争L（左）结合。含有Beclin-1 BH3-样结构域的荧光25肽（图1D）与重组Bcl-X对接L（左）ΔTM蛋白（不含或含有ABT737）。IC50在15 nM肽和100 nM Bcl-X存在下测量的ABT737L（左）ΔTM为1.7μM。(B、 C类)取消Bcl-X之间的相互作用L（左）完整细胞中的Beclin-1和ABT737。如图1E所示，对48小时前转染的HeLa细胞进行协同免疫沉淀分析。免疫沉淀前16小时，细胞暴露于ABT737。对于联合转染的Bcl-X也获得了类似的结果L（左）和Beclin-1（B）以及内源性Beclin-1与Flag标记的Bcl-X相互作用L（左）（C） ●●●●。(D、 E类)ABT737对Bcl-2（D）或Mcl-1（E）与Beclin-1相互作用的差异效应。本实验设计为（B）。所有实验都已进行了至少三次，结果相似。
图3abcd
图3abcd
ABT737刺激的Beclin-1依赖性自噬。(A、 B类)LC3-GFP检测自噬空泡，ABT737和Beclin-1特异性siRNAs对其进行调节。用对照或Beclin-1特异性siRNAs转染HeLa细胞，24小时后用LC3-GFP再次转染，在完全培养基（CM）中培养24小时，最后在CM或无营养（NF）条件下，在有或无1μM ABT737的情况下保存12小时。NF培养基中培养的细胞的代表性显微照片如（A）所示，百分比（平均值±s.d。，n个=3个单独的实验），对细胞质中含有LC3-GFP聚集体（LC3-GFPvac）的LC3-GFP-转染细胞进行定量（B）。（B）中的插入物证明了通过免疫印迹定量的Beclin-1特异性siRNAs的效率。(C、 D类)使用二醋酸氯甲基荧光素（CMFDA）检测细胞质空泡。用对照或Beclin-1特异性siRNAs转染细胞，在CM中培养48小时，洗涤，在CM（D）或NF（C，D）中培养12小时，用CMFDA染色，并拍照（C）或对含有至少一个可辨别细胞质空泡（箭头）的细胞进行量化（平均值±s.D。，n个=3个单独的实验）。
图3ef
图3ef
(E类)ABT737诱导的自噬空泡的超微结构。显示了透射电子显微照片。(如果)检测培养物中的死亡和死亡细胞。按（A）处理的细胞用ΔΨ染色米-敏感染料DiOC6（3） 和活性染料碘化丙啶（PI）。列的黑色部分表示DiOC6（3） 低PI+人口（死亡）和列的剩余部分对应于DiOC6（3） 低PI−（垂死的）人口。结果是三个独立实验的平均值±标准差。
图4
图4
ABT737诱导的自噬液泡的定量。用LC3-GFP重新转染转染有指示siRNAs（0 h时对Emerin或Beclin-1特异）的HeLa细胞，最后在无营养（NF）条件下（60-72 h），在有或无1μM ABT737的情况下培养，然后对未成熟（AV1）或成熟（AV2）自噬空泡进行电子显微镜检测。代表性图片如所示(A类). 测定至少50个细胞的AV1和AV2数量（平均值±标准偏差）(B类).
图5
图5
BH3-样结构域对Beclin-1诱导的自噬的影响。(A–D)BH3突变体和ABT737对Beclin-1诱导的自噬的调节。将GFP-LC3与空白对照载体或Beclin-1（WT，L116A，F123A）一起转染细胞并培养48 h，然后在CM（B）或NF（A，B）中在不存在或存在1μM ABT737的情况下过夜培养。代表性显微照片如（A）所示，每个细胞的LC3-GFP阳性空泡数量如（B）所示（平均值±s.d。；n个=3个单独的实验）。或者，不转染细胞并用CMFDA染色以检测空泡，如（C）和（D）所示，产生与LC3-GFP方法类似的结果。(E类)抗凋亡Bcl-2蛋白对Beclin-1诱导的自噬的BH3依赖性调节。细胞同时转染Beclin-1（或对照载体）和编码WT Bcl-X的等量质粒L（左），Bcl-XL（左）G138A、Bcl-2或Mcl-1（或对照载体），以及GFP-LC3。在60 h长的实验的最后12 h内，在CM或NF中进行无或有ABT737的培养。液泡中显示LC3-GFP积聚的细胞百分比真空)量化为平均值±标准差(n个=3个单独的实验）。
图6
图6
饥饿和添加ABT737后内源性和空间限制性Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用。(A类)内源性Bcl-2和Beclin-1的免疫沉淀。未转染的HeLa或MV4.11细胞在无营养的EBSS或ABT737（1μM）中培养。(B类)用Beclin-1免疫沉淀野生型和ER靶向Bcl-2。对稳定转染野生型、ER和线粒体靶向Bcl-2的细胞进行饥饿处理或ABT737处理，然后进行Bcl-2免疫沉淀和Beclin-1免疫检测。(C、 D类)Bcl-2和Beclin-1在亚细胞组分中的免疫沉淀。将处理为（B）的细胞进行裂解，并进行亚细胞分离，以富集内质网小泡（微粒体，（C））或线粒体（重膜部分，（D）），然后进行Bcl-2免疫沉淀和Beclin-1免疫检测。钙网蛋白和Hsp60被用作内部对照。结果代表了三个独立的测定结果。
图7
图7
BH3-only蛋白Bad对自噬的影响。(A、 B类)Bcl-XL、Beclin-1和Bad在自噬诱导条件下的相互作用。通过营养耗竭（A）或添加1μM雷帕霉素、1 mM氯化锂、100μM L-690330或50μM卡马西平（B）处理细胞，然后免疫沉淀Bcl-XL（左）（如图2C所示）并通过Bcl-X特异性抗体揭示免疫印迹L（左）Beclin-1或Bad。(C类)内源性Bad与Bcl-2的相互作用。用ABT737（1μM）或去营养剂处理HeLa细胞，然后免疫沉淀Bcl-2和免疫检测Bad。(D、 E类)不良耗竭对自噬的影响。用LC3-GFP和Bad特异性siRNA、emerin特异性siRNAs或Beclin-1相关PI3激酶Vps34转染细胞。48小时后，当siRNAs下调感兴趣的蛋白（D）时，细胞受到营养物质耗竭（NF）或添加雷帕霉素（E）的影响，并在18小时后评估细胞表现出LC3-GFP聚集作为自噬标记的频率（平均值±标准差。，*P（P）<0.05,n个=3个单独的实验）。(如果)坏基因敲除对自噬的影响。野生型（WT）或不良−/−MEF转染LC3-GFP，然后进行营养耗竭（NF）和/或ABT737处理（18小时；平均值±s.d。，n个=3). 星号表示(P（P）<0.05）不良缺陷的影响。(G公司)Bad基因敲除对Beclin-1/Bcl-2相互作用的影响。WT或坏−/−MEF接受指定的治疗，然后进行Bcl-2免疫沉淀和Beclin-1免疫印迹。(小时)Bad触发器自噬的过度表达。细胞仅转染LC3-GFP（对照组），连同载体或编码Bad的载体，并在48小时后进行营养耗竭（NF）。细胞在连续存在或不存在泛酶抑制剂Z-VAD-fmk（50μM）的情况下培养16小时，然后按照（E）中的自噬评估（平均值±标准差。，n个=3个单独的实验，*P（P）<0.01). 免疫印迹是至少三个独立实验的代表。
图8
图8
BH3域蛋白EGL-1调节饥饿诱导的自噬C.秀丽。L4幼虫表达LGG-1｜DsRED报告子（其表达水平提供自噬迹象）以及egl-1（n487）或缺失等位基因egl-1（ok1418）保存在富培养基中或饥饿过夜。(A类)wt和egl-1型突变胚胎，携带p液化天然气−1DsREDLGG-1报告基因在正常生长和饥饿条件下表达。比例尺表示约50μm。(B类)（A）中测定的LGG-1｜DsRED荧光定量。每个点代表一个单独胚胎的测量值。水平条表示平均值，灰色区域表示标准误差。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

中的注释

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Boya P、Gonzalez-Polo R-A、Casares N、Perfettini J-L、Dessen P、Larochette N、Metivier D、Meley D、Souquere S、Pierron G、Ohsumi Y、Codogno P、Kroemer G（2005）抑制宏观自噬触发凋亡。分子细胞生物学25:1025–1040-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Brenner S（1974）《秀丽隐杆线虫的遗传学》。遗传学77:71–94-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Byfield MP、Murray JT、Backer JM（2005）hVps34是激活p70 S6激酶所需的一种营养调节型脂质激酶。生物化学杂志280:33076–33082-公共医学
    1. Chen R、Valencia I、Zhong F、McColl KS、Roderick HL、Bootman MD、Berridge MJ、Conway SJ、Holmes AB、Mignery GA、Velez P、Distelhorst CW（2004）Bcl-2与肌醇1,4,5-三磷酸受体相互作用，调节内质网对1,4,5-trisphosphate肌醇的钙释放。细胞生物学杂志166:193–203-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Conradt B，Horvitz HR（1998）秀丽线虫蛋白EGL-1是程序性细胞死亡所必需的，并与Bcl-2样蛋白CED-9相互作用。手机93:519–529-公共医学

出版物类型

MeSH术语