扁桃体间充质干细胞向运动神经元样细胞的分化及其在神经肌肉接头形成中的应用

摘要

人扁桃体来源的间充质干细胞（T-MSCs）是新近发现的MSCs，具有MSCs的典型特征，包括向三个胚层分化的能力和良好的增殖能力。它们来源简单，可用于各种疾病状态下的干细胞治疗。我们之前报道过T-MSCs可以分化为骨骼肌细胞和雪旺样细胞；因此，它们是神经肌肉疾病细胞治疗的一个很有希望的候选药物。调节自发行为的运动神经元（MN）受到广泛的MN疾病（MND）的影响，目前尚无有效的治疗方法。我们研究了来源于T-MSCs的MN样细胞（T-MSC-MNCs）的分化潜能，以应用于MNDs的治疗。MN分化后，MN相关标记物的表达，包括胰岛1、HB9/HLXB9（HB9）和胆碱乙酰转移酶（ChAT），与未分化的T-MSCs相比增加。MN分化后，条件培养液中乙酰胆碱的分泌显著增加。我们共培养了T-MSC-MNC和人类骨骼肌细胞，并证实了乙酰胆碱受体簇的存在，这表明神经肌肉接头的形成。这些T-MSC-MNC提供的潜在功能改善可能有助于治疗由基因突变、病毒感染或环境问题引起的MND。

1.简介

人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）具有MSCs的典型特征，可分化为脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞，并可介导免疫调节[1,2,三]。T-MSCs是细胞治疗的有用来源，因为它们可以从手术后丢弃的人类扁桃体组织中分离出来。它们受供体年龄的影响，可以长期培养（15代）和冷冻保存，同时保持其形态、细胞表面标记和分化潜能[4,5]。据报道，T-MSCs分化为三个初级胚层，即中胚层谱系（包括脂肪、软骨、骨和肌肉细胞）、内胚层谱统（包括肝脏和胰岛素分泌细胞以及甲状旁腺激素分泌细胞）和外胚层谱层（包括施万细胞和神经细胞）[4,6,7,8,9,10,11,12].

运动神经元（MN）从大脑向肌肉和骨骼发送信号，使肌肉运动。MN有两种类型：上MN和下MN。低MN起源于脊髓，直接或间接支配效应器靶点。低MN的一种类型是躯体MN，它将轴突投射到骨骼肌。MN疾病（MNDs）是一组破坏MN的渐进性神经疾病，包括调节基本自发肌肉活动的细胞，如说话、行走、呼吸和吞咽。一些MND是遗传性的，非遗传性或散发性MND与环境、毒性、病毒或遗传因素有关[13,14].

已有几项研究使用干细胞治疗MND，包括肌萎缩侧索硬化（ALS）、原发性侧索硬化、进行性肌萎缩和进行性延髓麻痹[15]。已进行了诱导多能干细胞（iPSC）衍生MN（iPS-MN）分化的研究，并报告了验证试验，如移植到患病动物体内。一些研究报道了胚胎干细胞（ESCs）或iPSC分化为MNs用于治疗MND[16,17,18,19]。尽管ESCs/iPSCs具有作为MND治疗药物的潜力，但它们也有局限性，包括组织相容性和肿瘤形成，其来源引起了伦理关注。因此，成体干细胞，如MSCs，是干细胞治疗的合适细胞来源，可用于促进MND患者的神经肌肉再生。几项研究报告称，脐带、骨髓、沃顿果冻和牙髓中的间充质干细胞可以分化为MN[20,21,22,23]。然而，没有确切的证据表明MSC衍生的MNs具有功能活性。

在本研究中，我们评估了一种简单快速的生成T-MSC-derived MN细胞（T-MSC-MNCs）的方案，作为MND的细胞治疗来源。通过定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）、western blot分析和免疫细胞化学对T-MSC-MNC进行评估。为了证实T-MSC-MNC的功能分化效率，我们分析了培养中乙酰胆碱分泌的变化和乙酰胆碱受体簇的形成。我们首次报道T-MSC可以分化为MN，并描述了使用神经前体细胞（NPC）分化过程来分化MN的方法。

2.结果

2.1. 骨髓间充质干细胞向MN样细胞的分化

为了诱导向跨国公司分化，未分化的T-MSCs(图1A） 表达Nanog(图1D） 使用先前在聚乙烯亚胺（PEI）涂层培养皿上形成球体的方法将其分化为NPC[24]。T-MSC-NPC随着细胞尺寸的增加而伸长(图1B） 分化后弱表达Tuj1(图1E） ，一种神经细胞因子。随后，通过在运动神经元诱导培养基（MNM）中培养，将T-MSC-NPC分化为T-MSC-MNC。这些细胞相互连接，呈现出神经样形态。最终分化为β-III微管蛋白（Tuj1）+/胰岛1+T-MSC-MNC后(图1F、 G），细胞薄而细长，相互连接，看起来像神经细胞(图1C） ●●●●。

2.2。T-MSC-MNC运动神经元标记物的检测

2.2.1、。RT–qPCR

为了研究T-MSC-MNC分化的有效期，我们使用RT-qPCR分析检测了分化培养4周期间几个MN相关基因（胰岛1、HB9/HLXB9（HB9）和胆碱乙酰转移酶（ChAT））表达的时间变化。胰岛1的表达在培养的第二周显著增加，随后在随后的两周逐渐减少(*第页< 0.05;图2A） ●●●●。如所示图2B、 HB9基因表达在4周内逐渐增加，但未发现显著性(第页= 0.288;图2B） 。值得注意的是，与T-MSCs相比，ChAT外显子3的表达显著增加(*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001;图2C） ，但ChAT第6外显子的表达在3后显著低于ChAT第3外显子(**第页<0.01）和4周分化(第页< 0.05;图2D类；补充数据1). 外周型ChAT（pChAT）在人类外周神经系统（PNS）中优先表达，是转录后修饰中外显子跳跃（外显子6-9）的结果。因此，我们使用两种亚型（分别为外显子3和外显子6）的特异性引物证实了ChAT的表达。根据ChAT表达分析，T-MSC-MNC可能属于PNS。

2.2.2. 免疫细胞化学

与上述结果一致，免疫细胞化学分析显示在MN分化的第14天有效诱导MNC(图2E–G）。胰岛1+、HB9+、ChAT+和Tuj1+T-MSC-MNCs占总细胞的比例分别为23.68%±1.70%、11.74%±1.7%、11.72%±1.74%和67.20%±3.96%(n个= 3). 此外，Tuj1+T-MSCs-MNCs中胰岛1、HB9和ChAT的表达率分别为39.29%±1.16%、19.69%±4.0%和16.10%±3.42%(n个=3；补充数据2).

2.2.3. Western Blot分析

接下来，我们通过蛋白质印迹分析检测了在分化为T-MSC-MNC的4周期间几种MN相关蛋白的表达(图3A；补充数据3). 在分化的4周内，胰岛1蛋白的表达显著增加(图3B） 在MN分化的第2周和第3周，HB9高于未分化的T-MSCs、T-MSC-NPC和MN分化第4周(第页< 0.001;图3C） ●●●●。与T-MSCs相比，T-MSC-NPC中ChAT蛋白的表达在MN分化的第2周和第3周略有增加，而MN分化第4周则有所减少(第页< 0.001). 与上述ChAT基因表达特征一致，在MN分化的第2周和第3周也检测到82和68-kDa ChAT亚型(图3D） ●●●●。总的来说，这些结果证实了我们有一个有效的分化方案，通过2周分化T-MSC-NPC来诱导T-MSC-MNC，尽管我们尽量减少了MNM中的补充剂和所需的持续时间。

2.3. 从T-MSC有效区分MN

乙酰胆碱酶促反应检测结果显示，与新鲜MNM相比，分化后1、2、3和4周（分别为MN1w、MN2w、MN3w和MN4w）T-MSC-MNC的乙酰胆碱分泌显著增加(图4A；补充数据4). 乙酰胆碱浓度与MNM（定义为100%）的比值为127.9%±1.925%（分化2周后；第页<0.001），114.0%±1.592%（分化3周后；第页<0.05）和109.4%±4.612%（分化4周后；第页> 0.05). 值得注意的是，分化2周后浓度比最高的观察结果证实了上述结果(图2和图3)表明2周是分化的最佳时间。这些结果表明，T-MSC-MNC具有胆碱能神经元的特征。

2.4. T-MSC-MNC表达神经营养因子

研究T-MSC-MNCs是否显示促进中枢神经系统（CNS）和PNS神经元初始生长和发育的神经营养因子表达水平增强[25]，我们使用RT-qPCR分析了神经营养因子（脑源性神经营养因子，BDNF）、胶质细胞源性神经滋养因子（GDNF），神经生长因子（NGF）和海铁蛋白（HRG））在T-MSCs和T-MSC-MNC中的表达(图4B类；补充数据5). T-MSCs MN分化后，BDNF的表达水平(第页<0.05），GDNF(第页<0.05），NGF(第页<0.001）和HRG(第页<0.01）显著增加，尤其是BDNF和NGF。

2.5. T-MSC-MNC与人骨骼肌细胞共培养中乙酰胆碱受体簇的形成

除上述结果外，我们还观察到T-MSC-MNC的形状与未分化T-MSC的形状不同(图5A） ●●●●。与T-MSCs相比，T-MSC-MNC变得多极，细胞体长度典型增加。它们还有一个明亮的细胞核和一个具有长轴突状结构的细胞体，末端有小的延伸（黑色箭头；图5B） 。为了评估T-MSC-MNC的功能特性，将其与人类骨骼肌细胞（hSKMC）衍生的肌管共培养4天(图5C） ●●●●。共同培养之后(图5D） ，T-MSC-MNC中乙酰胆碱受体（AchR）聚集，可使用Alexa 555结合的α-BTX（红色）进行可视化，AchR聚集与α-银杏毒素（α-BTX+）+细胞中的Tuj1（绿色）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，蓝色）共定位（分别为白色和黄色荧光）(图5E、 F）。这些结果表明，T-MSC-MNC与hSKMC衍生的肌管共培养时可有效形成功能性神经肌肉接头（NMJ）。

3.讨论

为了诱导T-MSC-MNC的发育，我们使用了两步分化程序，使用不同的材料和方法将T-MSCs分化为NPC和MNCs。这种通过NPC将T-MSC区分为T-MSC-MNC的方法似乎是成功创建功能性跨国公司的一个因素。先前的一项研究表明，iPSCs也可以分化为MN，但没有显示乙酰胆碱分泌增加或NMJ形成增加[26]。将我们研究中使用的分化方法与先前报道的方法进行比较表明，添加到分化培养中的大多数因素，如视黄酸（RA）和声波刺猬（Shh），在这些方法中是常见的，尽管添加了一些额外的因素。已经努力在时间和程序方面简化最近报道的将人iPSC分化为MN的方案，并提高其效率。当包括鼻咽癌诱导期时，分化期通常为4周左右；然而，分化效率因所使用的细胞来源或用于鉴定的标记而略有不同。本研究中，作为MN分化指标的胰岛1+和HB9+细胞的比例分别为T-MSC-MNC的23.68%和11.74%，其他研究中产生的iPS-MNC的比例为70-90%和35-46%[18,26,27]。这些结果表明，尽管T-MSC的分化效率低于iPSC，但可以分化为MN。

ChAT负责神经元体内产生的乙酰胆碱的合成，并被输送到神经末梢，其浓度是所有神经末梢蛋白质中最高的。ChAT由人类的ChAT基因编码[28]。我们分析了4周MN分化过程中CHAT的表达；外显子3的表达在4周后逐渐增加，但外显子6的表达在2周后增加，3周后减少。ChAT以两种亚型存在：在中枢神经系统和PNS中都存在常见型ChAT（cChAT）。pChAT优先存在于PNS中，在转录后修饰过程中通过外显子跳跃（外显子6-9）形成。因此，根据ChAT外显子的特异表达，我们的结果表明T-MSC-MNC属于PNS[29,30].

在T-MSC-MNCs的CHAT表达增加的同时，CM的乙酰胆碱分泌也增加，这表明T-MSCs可以分化为包括MNs在内的胆碱能神经元。来自骨髓间充质干细胞的MN样细胞中也有乙酰胆碱分泌增加的报道[21]和脐带MSC[20]。然而，通过证明NMJ的形成或证明其作为高级MN的功能，如突触后反应，证实了iPSC-MNC中存在乙酰胆碱。乙酰胆碱是神经系统用来激活骨骼肌的物质，骨骼肌由位于脊髓或PNS中的MN直接控制。MN和肌肉纤维之间的接触形成一种化学突触，称为NMJ[31]。特别是，当T-MSC-MNC与hSKMC共培养时，也观察到类似于先前仅在NMJ中观察到的由iPSC-MNC形成的乙酰胆碱簇，进一步证实了T-MSCs衍生的MN的分化。

一些研究表明，在MND的早期阶段，如ALS和脊髓性肌萎缩，NMJ的功能和维持受损[32]。据报道，NMJ障碍在与年龄相关的肌肉减少症的发展中起着关键作用[33]。在本研究中，我们使用了MNCs和SKMC的体外共培养，这对于NMJ相关疾病的研究应该是有用的。在使用人类iPSC-MNC开发MND治疗药物的研究中，主要报道了这种共培养的使用[34]。目前尚无治愈MND的方法，只有缓解症状的药物和可以提高患者生活质量的支持性治疗。这种对MND的支持性治疗包括利鲁唑（已被批准用于治疗ALS）、努西内森（已被许可用于治疗脊髓性肌萎缩）、延缓疾病进展的自由基清除剂、肌肉松弛剂，如巴氯芬、替扎尼丁和苯二氮卓，以及肉毒杆菌毒素。因此，针对基因突变和影响MND发病因素的新药开发的研究重点是药物干预、基因治疗和干细胞治疗[35]。利用ESCs、iPSCs、神经干细胞、MSCs和嗅鞘干细胞进行的干细胞治疗已经在体外和小鼠模型中进行了研究，但将干细胞移植到MND患者中以获得治疗益处仍然具有挑战性[36]。一些国家提供了多能干细胞（iPSCs）治疗多能干疾病（如肌萎缩侧索硬化症）的治疗试验，但由于缺乏明确的疗效和安全性，因此不适合临床应用。根据以往干细胞治疗MND的研究结果，本研究中开发的T-MSC-MNC应该适合作为治疗剂，因为它们能够进行异体移植，更容易获得原料，并且与其他类型的MSC相比具有更好的增殖能力[27].

同样值得注意的是，神经营养因子在分化为T-MSC-MNC后表达增加。对MN成熟至关重要的各种神经营养因子已经有报道[18,27]。在本研究中，GDNF和HRG基因的增加表达，以及添加到分化培养基中用于MN分化的BDNF和NGF，证明了T-MSC-MNC的功能优势。BDNF通过酪氨酸受体激酶B保护神经元并促进受损神经的生长。它还经常用于区分ESC和iPSC的MN的成熟[25]。相比之下，NGF使用酪氨酸受体激酶A，支持髓鞘形成，促进神经分化，并与PNS发育中神经的成熟和存活有关[37]。GDNF是一种小蛋白，能强烈刺激多种神经元的存活，并通过GDNF家族受体α（GFRα），尤其是GFRα1发送信号。GDNF最显著的特点是其支持跨国公司生存的能力[38]。最后，HRG已被证明能够通过施旺细胞间接向肌肉细胞发出信号，以调节NMJ的形成[39,40].

4.材料和方法

4.1. 道德声明

T-MSCs取自扁桃体切除术患者。本研究中使用的所有实验程序均获得了Ewha Womans University Mokdong Hospital机构审查委员会（大韩民国首尔，许可证号ECT-11-53-02；批准日期：2011年9月22日）的批准。研究开始前，我们获得了所有患者和/或其法律代表的知情书面同意。

4.2. T-MSCs的制备及其向MN样细胞的分化

如前所述，从患者（≤10岁）的扁桃体中分离和培养T-MSCs[2,三]。将扁桃体组织切碎，并在含有210 U/mL I型胶原酶（Invitrogen）和DNA酶（10µg/mL；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）的Dulbecco改良Eagle’s培养基（DMEM；Invitrogin，Carlsbad，US）中消化。消化后的细胞通过细胞过滤器（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）过滤后，通过Ficoll-Paque（GE Healthcare，Chicago，IL，USA和1%青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich）置于5%CO的湿化室中₂在空气中。为了生成NPC，在PEI涂层培养皿上诱导T-MSC在2-3天内形成直径100–400µm的球体。然后将形成的球体转移到新鲜培养皿中，在添加10%FBS的低葡萄糖DMEM培养基中进行扩张。球体中的细胞从聚集物中生长出来，形成玫瑰花状排列。一旦汇合，细胞被继代培养并扩增至3代。诱导MN分化，1.5–2×10⁴/厘米²将T-MSC-NPC置于运动神经元诱导培养基（MNM）中，该培养基由添加2.5%FBS、1%N₂补充剂（Gibco，Life Technologies，伯灵顿，安大略省，加拿大），1µM维甲酸RA（Sigma-Aldrich），10 ng/mL BDNF（研发系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国），10 ng/mL NGF（研发系统），0.1 ng/mL Shh（研发系统）。在这些条件下，T-MSC-MNC分化2-4周，然后收获用于表征。

4.3。RT–qPCR

使用Qiagen RNeasy迷你套件（德国希尔登市Qiangen）从细胞中提取RNA。为了合成互补DNA（cDNA），在42°C下使用Superscript II（Invitrogen）和oligo（dT）20引物1 h，然后在72°C下孵育15 min。在ABI 7500快速实时PCR系统（美国加利福尼亚州福斯特市Applied Biosystems）上，使用SYBR Premix Ex Taq DNA聚合酶（日本志贺县Takara Bio）进行RT-qPCR，如前所述，确认T-MSCs和T-MSC-MNC中基因表达的相对水平。为了量化每个候选基因的表达，将mRNA表达水平标准化为3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）mRNA水平。比较阈值循环（Ct）法（∆∆C类t） 用于分析相关基因表达[41]。RT-qPCR一式三份，重复三次。使用的正向和反向引物序列如下：Islet1正向5′-AGCGCAAATGACAAAACT-3′，反向5′-CTGAAAATTGACCAGTGCTG-3′；HB9，正向5′-GTCACCGCGCATGATCC-3′，反向5′-TCTTCCACCTGTGTCGTGTGAGC-3′；ChAT外显子3，正向5′-GGGCTGCCCAAACTGCCCG-3′，反向5′-CGAGACCTCAGCAAAC-3′；ChAT外显子2.3.1.6，正向5′-TGTCTGAGTACTGGCTGAATGA-3′，反向5′-CACTTCCCTGGCACGAT-3′；BDNF，正向5′-GATGCCAGTTGTTTGTCTTC-3′，反向5′-TAAAAATCTCGTCCCCAACA-3′；GDNF，正向5′-TTCAAGCCACCATTAAAAGAC-3′，反向5′-GACAAAGGTGAGTGAGTCGGT-3′；NGF，前5′–GTCAGCGTTGGGTGGGGGATA–3′，后5′–GACAAAGGTGTGAGTCGGT–3′；HRG，向前5′–CGGTGTCCATGCTTCCAT–3′，向后5′–GCGAGTTTTAACAGGCTCT-3′；GAPDH，正向5′-ACACCCACTCCACCTTTT-3′，反向5′-TGCTGTAGCAATTCGT-3′。

4.4。西方印迹法

用冰冷的磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤来自总细胞提取物的蛋白质样品。蛋白质样品在含有磷酸酶抑制剂鸡尾酒溶液的Pro-Prep缓冲液（iNtRON Biotechnology，Seongnam-si，Korea）中在冰上溶解30分钟，然后在13000×克在4°C下保持20分钟。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离每个上清液中等量的蛋白质，并将其转移到聚偏乙烯膜上（Millipore，Billerica，MA，USA）。然后用抗Islet 1（分类号ab86472）、HB9（分类号ab79541）或ChAT（分类号ab178850）（1:500，均来自英国剑桥Abcam）的单克隆抗体在4°C下探测印迹过夜，然后用相应的二级抗体。印迹是使用增强化学发光试剂（WestSave Gold Western印迹检测试剂盒；AbFrontier，首尔，韩国）开发的。通过密度扫描评估每个波段的强度（LAS-3000；日本东京富士胶片公司）。每个蛋白的表达水平根据GAPDH水平进行标准化（编号LF-PA0018；1:1000，pRb，AbFrontier）。使用Multi-Gauge软件（3.0版；日本神奈川富士照片胶片）量化蛋白质水平。

4.5. 免疫细胞化学

细胞固定在4%(v（v）/v（v）)多聚甲醛（Sigma-Aldrich）在室温下保持1小时或在4°C下过夜，然后在封闭缓冲液中封闭（含2%牛血清白蛋白的PBS（Bovogen Biologicals，East Keilor，Australia），0.1%吐温-20）。将固定细胞在稀释的一级抗体中在室温下培养1小时或在4°C下培养过夜。在PBS中清洗三次后，将样品在室温下与PBS中稀释的二级抗体孵育1小时。然后使用含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚的Vectashide安装介质（DAPI；Vector Laboratories，加利福尼亚州伯灵盖姆）安装制备的样品。使用荧光显微镜拍摄图像（日本东京尼康）。免疫细胞化学中使用的抗体如下：小鼠抗Nanog（分类号sc-374001；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA，USA）、小鼠抗Tuj1（分类号ab14545；Abcam）、兔抗Tujl，兔抗ChAT（分类号ab178850；Abcam）、鼠抗α-SMA（分类号A2547；Sigma-Aldrich）（一级抗体）和Alexa-568山羊抗鼠IgG（分类号A-11031）、Alexa-488山羊抗鼠-IgG（类别号A-11001）、Alexa 568山羊抗兔IgG，和Alexa-350山羊抗鼠IgG（分类号A-11045）（均来自Life Technologies）（二级抗体）。为了在神经肌肉接头发育期间染色AchR，将Alexa Fluor 555结合的α-BTX添加到样品中，并在室温下培养1 h。

4.6. 乙酰胆碱的酶促反应测定

为了检测功能性MN活性，我们在MN分化1、2、3和4周后测量了MNM和条件培养基（CM）中的乙酰胆碱含量。收集样品并将其储存在−80°C下。通过抽吸培养基并用PBS洗涤细胞两次来制备CM样品，然后用无血清DMEM/F12培养基培养T-MSC-MNC 24 h。通过离心1000收集无血清培养基克持续5分钟，收集上清液作为CM。使用检测试剂盒（Cell Biolabs，San Diego，CA，USA）测量乙酰胆碱含量。使用标准曲线测定测试样品中的乙酰胆碱浓度。根据制造商的说明，使用微孔板阅读器（Bio-Tek Instruments，Winooski，VT，USA）测量结果[42].

4.7. 人骨骼肌细胞与T-MSC-MNC的共培养

人类骨骼肌细胞（hSKMC；Lonza Walkersville，Walkersvelle，MD，USA）被镀在盖玻片上（Paul Marienfeld，Lauda-Kӧnigshofen，Germany）并培养至细胞达到约60%的汇合点，然后在SKMC分化培养基（PromoCell，Heidelberg，German）中培养以诱导肌管的形成。随后，将培养基改为MNM，并将SKMC肌管培养4天。最后，将T-MSC-MNC接种到SKMC衍生的肌管上，并在MNM中共培养3-4天。

4.8. 统计分析

数据表示为平均值的平均值±标准误差（SEM），并使用GraphPad Prism版本4（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）进行分析。通过单因素方差分析（ANOVA）对对照组和试验组进行统计比较，然后进行Tukey的western blotting事后检验、RT–qPCR和酶促反应分析。学生的t吨-试验用于比较神经营养因子。差异被认为在第页< 0.05.

5.结论

总之，本研究表明，我们可以使用我们的方法将来源于人类T-MSCs的T-MSC-NPC分化为功能性T-MSC-MNC。我们证实，与T-MSC相比，在MN分化后，T-MSC-MNCs中MN相关标记物的表达增加，如胰岛1、HB9和ChAT。此外，T-MSC-MNC对分化培养基的乙酰胆碱分泌增加，与hSKMC共培养时发现乙酰胆碱受体簇。这些结果表明，本研究中使用的分化方法是非常有效的。然而，MNC的功能性MN分化和形态学改善是否有助于治疗人类MND和其他神经肌肉疾病，尚待确定。