针对特定神经元群体的神经营养素：NGF、BDNF和NT-3及其在脊髓损伤治疗中的相关性

摘要

神经营养素是一类蛋白质，可调节神经元存活、突触功能和神经递质释放，并在成人中枢和外周神经系统中诱导轴突的可塑性和生长。自20世纪50年代以来，这些因素在创伤模型中得到了广泛研究。在这里，我们回顾了神经营养素经典家族的几个成员，它们结合的受体，以及它们对脊髓损伤后轴突再生和感觉运动通路萌芽的贡献。我们关注神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素-3（NT-3）及其对不同脊髓束内神经元数量的影响。了解神经营养因子的细胞靶点和特定神经元群体的反应性，将有助于对受损脊髓采取最有效的治疗策略。

1.简介

在成人中枢神经系统中，轴突在损伤后无法再生。这种缺乏再生可归因于固有生长程序的激活减弱，以及缺乏生长许可分子和包含许多生长抑制分子的局部环境。即使轴突能够再生，它们也很少瞄准正确的突触后神经元或形成恢复功能的突触连接。再生的最佳环境包括增强的内部生长状态和分子的存在，这些分子可以克服抑制影响，引导轴突到达适当的靶点，并且只诱导受损神经元的生长，而不会影响非受损神经元的数量。此外，由于运动和其他运动需要多条运动和感觉路径来正确整合和重建运动模式，因此可能需要多个神经元群的生长和连接来促进显著的功能恢复。

在发育过程中，生长抑制性神经营养因子允许轴突延长并向适当数量的靶点延伸。目前，有50多个已知因素可以指导轴突的生长和引导、突触的形成以及轴突和树突在发育过程中的修剪。在成人中，这些因素有助于神经元存活、轴突可塑性和突触功能，包括神经递质的可用性[1,2,3,4,5,6,7,8,9]. 然而，许多神经营养因子在成人中枢神经系统（CNS）中的表达大大减少。这些因素的外源应用有可能在受伤后创造一个允许生长的环境。在这里，我们重点关注被描述为“经典”神经营养素家族的三个因子：神经生长因子（NGF）、脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素-3（NT-3），以及它们对脊髓损伤的治疗潜力。

经典神经营养素家族的成员是结构相似的蛋白质。它们被制造成较大的前体蛋白，称为前神经营养素，由N端前体蛋白和C端成熟结构域组成[10]. 原形物曾经被认为只影响成熟蛋白质的折叠，现在被认为是具有生物活性的分子，可以补充或反对成熟形式的活性。成熟的神经营养素是在原型分裂并形成非共价连接的同源二聚体时产生的。前神经营养素既可以被furin或proconvertase在细胞内裂解，然后分泌，也可以被纤溶酶、基质金属蛋白酶-3（MMP-3）或基质金属蛋白酶-7（MMP-7）在细胞外加工[11,12,13,14,15,16]. 这些同型二聚体与两类主要受体-原肌球蛋白受体激酶（Trk）受体和泛神经营养素（p75）结合^NTR公司)受体(图1). 所有家族成员与p75的亲和力都很低^NTR公司受体。该受体包含四个富含半胱氨酸的重复序列（CR1-4）。CR2和CR3被认为是神经营养素的结合位点[17,18]. 单个神经营养素与Trk受体特异性结合并具有高亲和力，NGF与TrkA结合，BDNF与TrkB结合，NT-3与TrkC结合[19,20,21]. 体外实验也证明，神经环境中NT-3与TrkA和TrkB的低亲和力结合[22,23]. 结合作用主要发生在Trk受体的免疫球蛋白样结构域（Ig1和Ig2）中[21].

神经营养素与Trk受体结合导致受体二聚化和酪氨酸残基的自磷酸化，最终导致下游信号级联的激活。已知激活或上调的几个级联是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）、Ras/有丝分裂原活化蛋白激酶（Ras/MAPK）和磷脂酶C-γ（PLC-γ）。这些通路在神经元存活、轴突生长和突触可塑性中具有已知的作用[24]. 与Trk受体的结合受p75的影响^NTR公司在许多方面。第75页^NTR公司可以通过影响受体的确认来促进配体与Trk受体的结合，从而增加“首选”神经营养素的亲和力并减少其他神经营养素之间的结合[25,26,27]. 一些研究表明，神经营养素如NGF需要p75的存在^NTR公司用于与TrkA的高亲和力结合[28]. 第75页^NTR公司也可以促进神经营养素的内吞和逆行运输到膜室，在那里它们可以与Trk受体相互作用[29,30,31]，并可能减少Trk泛素化，这可以延迟受体的内化和降解，从而延长信号周期[30]. 此外，P75^NTR公司可以激活Akt等促生存途径，与Trk介导的神经营养素效应协同作用[32].

激活p75^NTR公司受体也可以对细胞生存和生长起拮抗作用，触发几个潜在的促凋亡级联反应。在缺乏Trk的情况下，成熟神经营养素与p75结合^NTR公司可以激活Jun N末端（JNK）激酶，通过激活p53触发细胞死亡[19,33]. JNK激活已明确显示在p75期间以NGF依赖的方式运行^NTR公司-皮质少突胶质细胞介导的细胞死亡[34]. 在交感神经元中，p75^NTR公司可以通过JNK独立机制与BDNF结合触发促凋亡级联[35]. 最近对前神经营养素的研究表明，这些分子对p75有较高的亲和力^NTR公司受体比成熟形式[14]. 第75页^NTR公司可与sortilin受体形成复合物，该复合物与前-NGF、前-BDNF和前-NT-3的N末端前体结合。Pro-NGF是定义最明确的前神经营养素，与p75中少突胶质细胞、脊髓运动神经元和皮质脊髓神经元的死亡有关^NTR公司依赖方式[36,37,38]. 这种分子的上调可能发生在损伤状态[12,13,14]. 因此，细胞的命运可能取决于前或成熟神经营养素的相对丰度，或Trk和p75的相互作用^NTR公司受体可用性[33,39].

在未受伤的成年大鼠中，脊髓神经元通常不会产生本文所讨论的神经营养素，缺乏可检测的mRNA转录表达就证明了这一点[40]. 然而，某些Trk受体的表达是丰富的，因为mRNA探针显示TrkB和TrkC转录物在脊髓灰质的大多数神经元上的各级检测[40,41,42]. TrkA mRNA在散布于中间灰质的少量神经元上表达[43]和背根神经节小直径伤害性神经元[44]. Trk受体成熟形式的存在可以允许这些因子的结合和逆行运输。

在脊髓损伤的情况下，Trk受体的存在可以提供针对特定脊髓束的治疗。图2概述了从普通运动中引发生长反应的神经营养素(图2A） 和感官(图2B） 脊髓束（克拉克核（本体感受性）：[45]; 皮质脊髓束：[46,47]; 楔束和纤细束：[48,49,50,51,52]; 网状脊髓束：[53,54]; Rubrospinal束：[54,55,56]; 脊髓丘脑束：[50,57,58]; 前庭脊髓束：[53]).

2.神经生长因子

神经生长因子（NGF）是20世纪50年代由Rita Levi Montalcini和Viktor Hamburger在体外培养的小鼠肉瘤中发现的第一种神经营养因子[59]. 随后的研究发现NGF在调节外周神经系统（PNS）中发育中神经元的存活和成熟中发挥作用。在中枢神经系统（CNS）中，成熟的NGF具有神经保护作用，可以影响显示NGF受体的细胞类型对损伤的神经反应，例如伤害性感觉神经元（交感神经和小直径外周神经）、α运动神经元和施万细胞[60,61,62,63,64].

NGF与TrkA和p75的结合^NTR公司受体激活下游信号级联，如MAPK/ERK、PI3K/Akt和PLC-γ途径[65,66]. 众所周知，激活MAPK/ERK和PI3K/Akt都可以促进神经元的分化和存活（参见Pearson等人，2001年和Yuan等人，2003年的综述）[67,68]. 下游蛋白的PI3K/Akt磷酸化在运动期间和生长锥处修改细胞的细胞骨架（参见Yuan等人，2003年的综述）[68]. PLC-γ途径影响钙的细胞内释放²⁺通过三磷酸肌醇依赖途径[69]. 反过来，这允许激活钙依赖蛋白（例如钙²⁺钙调素依赖性蛋白激酶²⁺钙调素相关靶点）与离子通道和转录因子的表达[70,71].

NGF诱导轴突萌芽到感觉神经元的机制是一个备受关注的研究领域。脊髓内NGF的表达诱导伤害性轴突的强劲喷发和痛觉过敏[72]. TrkA或NGF本身的抑制剂可以减少伤害性轴突的轴突萌芽[73,74]. 将表达和分泌NGF的移植物移植到未受损和受损的大鼠脊髓中，显示伤害性轴突萌芽增加[50,58,75,76]. 此外，在表达NGF的移植物中观察到去甲肾上腺素能、脊髓和胆碱能局部运动轴突萌芽[58,76]. 众所周知，NGF还会导致切断的初级伤害性感觉通路再生，穿过背根进入区（DREZ）进入脊髓[57,77].

其他神经营养素如脑源性神经营养因子（BDNF）、神经营养素-3（NT-3）和神经营养素4/5（NT-4/5[78,79,80,81,82]. 这些研究表明，轴突生长得到改善，伤害感受功能得到恢复[80,81,82]或后肢运动功能[78,79]脊髓损伤模型。

由于NGF的主要营养作用见于小直径感觉神经元，临床试验的重点是糖尿病或HIV相关神经病等问题。使用重组人NGF（rhNGF）进行的第二阶段试验很有希望，神经系统检查和平均每日疼痛评估的感觉成分有所改善[83,84]. 然而，这些试验的痛苦副作用揭示了rhNGF蛋白的剂量限制，而后续III期试验未能显示任何显著的改善效果[85]. 这是否是因为剂量较小、研究人群不同或rhNGF的配方改变，尚不清楚，但制造商在这种情况下放弃了使用。另一家公司目前正在对一种改良的rhNGF进行神经营养性角膜炎的试验评估，研究表明它可以促进大鼠和人类的角膜愈合[86].

动物模型和临床研究中报告的NGF刺激的伤害性萌芽和伴随的疼痛限制了这种神经营养素在脊髓损伤再生研究中的应用[87,88]. 然而，对SCI患者常见的慢性疼痛状态的研究仍在进行中。Fasinumab是一种抗NGF的药物抗体，发现研究组的疼痛评分有显著改善[89].

促进神经保护的替代治疗靶点可能包括抑制前神经营养素的信号传导。损伤后CNS中的前-NGF水平上调[15,38]，当p75时被认为是凋亡的^NTR公司受体水平高[14,90,91]. 原代颈上神经节培养物、平滑肌细胞和PC12细胞中的前NGF可诱导细胞死亡[14,90,91]在阿尔茨海默病、孤独症或与HIV相关的认知障碍等神经系统疾病状态中，观察到前-NGF或前-BDNF水平升高[15,92,93,94]. 临床前研究已经证明，通过基因删除sortilin或在小鼠中引入前-NGF特异性拮抗剂可以实现神经保护[95,96]. 脊髓损伤后，NGF拮抗剂也显示出积极效果[97]，或肌萎缩侧索硬化症（ALS）[98]. 其他治疗方案可能包括调节原形态的裂解，以鼓励更成熟的神经营养素的存在。

3.脑源性神经营养因子

脑源性神经营养因子在损伤后对多种神经元群发挥神经保护和促生长作用。这在红核脊髓束、网织脊髓束和前庭脊髓束以及腰部脊髓灰质中克拉克核的本体感受神经元中尤为明显。神经保护效果尤其可能归因于TrkB受体信号的下游效应。糖原合成酶激酶3（GSK-3）、（Bcl-2相关死亡启动子）Bad和JNK等促凋亡分子通过PI3-激酶和Akt途径被TrkB信号抑制，使标记为死亡的细胞存活。也有研究表明BDNF减少谷氨酸诱导的凋亡细胞死亡[99].

BDNF在保护红核脊髓束神经元（其细胞起源于红核）时尤其有效。这些神经元在损伤后的几周内会发生明显的萎缩[1]. TrkB受体表达的原位杂交发现，几乎所有红核脊髓神经元都表达该受体。通过红核脊髓神经元（RSN）附近的套管输注BDNF可完全防止这些细胞的萎缩。NT-4/5也有这种作用，它与TrkB受体有类似的结合模式[23,100,101]. 在施用BDNF期间，还发现显示生长相关蛋白（如GAP-43和Tα1-微管蛋白）mRNA转录物的细胞百分比显著增加。同一组的后续研究通过病毒载体注射表达BDNF，发现RSN萎缩的逆转和再生相关基因的上调类似[102]. 这些研究侧重于急性损伤，但RSN也可以在慢性时间点进行抢救。当在损伤后18个月用编码BDNF的病毒载体转导这些神经元时，发现红核内的细胞数量增加，神经元形态恢复[103].

BDNF的神经保护作用延伸至皮质脊髓运动系统。Lu及其同事探讨了BDNF对皮质脊髓运动神经元和皮质脊髓束（CST）轴突生长的影响。他们发现，将分泌BDNF的成纤维细胞移植到皮质区的抽吸病灶中可以提高脊髓运动神经元的存活率，但对CST轴突的生长没有帮助。支持这些结果的是，他们的研究发现，TrkB受体在皮质脊髓运动神经元的细胞体和树突上有较强的表达，但在其下行轴突上没有表达[4]. 在T9脊髓损伤和移植用于分泌BDNF的间充质干细胞后，BDNF在初级运动皮层也有神经保护作用。荧光标记皮质脊髓神经元数量的量化显示，与T9损伤对照组相比，BDNF可以拯救这些神经元[104].

对损伤部位BDNF分泌细胞的研究表明，其保护作用可以远距离发挥作用。2010年的一项研究或许最令人印象深刻地证明了这一点，该研究发现，将BDNF和NT-3分泌细胞植入距细胞体约10厘米的C7损伤部位时，猕猴锥体神经元具有神经保护作用。对同一组啮齿动物的同期研究表明，BDNF而非NT-3是影响这些神经元存活的因素[105].

除了神经元保护外，BDNF还可以促进脊髓损伤轴突的再生和发芽[54,55,106,107]或受损轴突的髓鞘化增加[107,108]. 一些研究小组发现，BDNF的应用可诱导神经元中GAP-43和T-α-1-微管蛋白等生长相关基因的上调[55,109]. 这些基因的上调可能有助于促进再生[110]. 也有人认为，ERK通路信号的TrkB受体激活可能刺激再生，因为ERK可以增加环腺苷酸（cAMP）的水平，这可能在一定程度上负责调节周围损伤的促生长效应[110,111]. 由于TrkB受体存在于脊髓的许多神经元上，BDNF可能是发芽和再生的一般诱导剂。

一些报道保护红核脊髓神经元的小组也发现了轴突再生或红核脊髓束再生发芽[54,55,112,113,114]. Jin及其同事的一项研究还注意到，网状脊髓束和前庭脊髓束轴突在含有分泌BDNF的成纤维细胞的病变腔中的生长增加[53]. 拉斐斯皮纳尔也有促生长作用[104,113]BDNF与胎儿脊髓移植联合应用时的蓝棘轴突[113].

BDNF对皮质脊髓束轴突生长的影响是混合的。Bregman研究发现，在胚胎脊髓组织移植的同时，将浸泡BDNF的明胶海绵应用于损伤部位，皮质脊髓轴突的生长增加[113]. 分泌BDNF的干细胞或移植细胞和BDNF在病变尾部注射也可观察到CST纤维的发芽和部分运动恢复[104,106]. 然而，其他几组没有看到CST轴突对BDNF的反应有任何显著的生长[4,115,116]部分原因可能是这些神经元缺乏TrkB受体。Hollis及其同事的一项有趣的研究发现，在这些神经元上过度表达TrkB可以增强轴突的表达，并使CST轴突延伸到表达BDNF的细胞移植物中[117].

TrkB在脊髓神经元中大量表达[41,42]可能使BDNF和与之结合的神经营养素家族其他成员（如NT-4/5）成为受伤运动束最普遍适用的分子。然而，这种受体的大量表达也有不利的一面，因为疼痛或痉挛等非靶向效应有时与BDNF治疗相关[118,119,120,121]. TrkB在接受伤害性传入的背角神经元上表达。这些神经元在损伤过程中也可以上调TrkB受体[122,123]. 这可能导致BDNF促进C纤维发芽，增加疼痛通路中的突触连接，然后可以通过阻断BDNF-TrkB信号来阻止这种现象[119,120]. 最近，高浓度BDNF被证实通过下调钾-氯协同转运蛋白（KCC2）来改变神经元中氯的稳态。在这种情况下，KCC2的下调会导致神经元过度兴奋，增加疼痛和痉挛[124,125,126]. 如前所述，另一个考虑因素是BDNF原形态的相对丰度，它在损伤状态下上调[16,127,128]与不同神经元群的神经元死亡、轴突塌陷和突起收缩有关[127,129,130].

有一些相互矛盾的证据与BDNF治疗及其对疼痛和痛觉超敏的影响有关。一些作者发现BDNF治疗可以逆转痛觉超敏反应[131,132,133]或者，触觉效应可能只发生在非损伤状态[134]. 也有人推测BDNF对痉挛的作用可能仅由持续高水平的该因子诱导，因此调节或暂时剂量可能解决这个潜在问题[135].

当考虑在临床环境中使用BDNF时，剂量和外显率尤其重要。由于组织外显率低和不良副作用，BDNF在临床试验中的系统应用一直不成功。BDNF仅以极少量穿过血脑屏障，使得外周给药不足以治疗，正如一项寻求治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）的大型临床试验所示[136]. 在进一步的ALS试验中，探索了将BDNF直接输送到中枢神经系统的方法，如脑室内或鞘内给药，以及修改蛋白以增加组织灌注。然而，BDNF不能充分穿透大脑或脊髓表层以外的组织，无法到达脊髓中退化的运动神经元[137,138]目前，正在探索诸如实质内蛋白输注和病毒介导的基因传递等方法，以增加神经营养素对适当神经元群体的可用性[139,140,141,142].

4.神经营养素-3

神经营养素家族的第三个成员，神经营养素-3（NT-3），是由马克斯·普朗克研究所的一个小组于1990年发现的[143]. 由于蛋白质丰度较低，这种神经营养因子比NGF或BDNF更难鉴定。然而，研究人员使用来自NGF和BDNF的保守氨基酸序列创建退化引物，使他们能够分离出具有类似结构和序列的蛋白质的mRNA，他们将其命名为NT-3。他们发现，NT-3支持鸡三叉神经中脑神经元的存活，三叉神经是一组支配骨骼肌的本体感受神经元。他们还在肝脏和内脏器官中发现了NT-3[143]. 同年，另一组人同时分离出了该因子，他们在肾、肺、小脑、髓质和海马中也发现了NT-3，并表明该因子的广泛分布说明了其作为生长交感和感觉神经元的营养因子的作用[144].

后来的研究发现，NT-3对其他几组神经元的存活至关重要。对NT-3缺失突变体的研究发现，背根神经节神经元缺乏TrkC表达亚群的发育[145]，以及消除肌梭1a本体感觉神经元[146]. 这两项研究都导致了异常的运动模式和非常有限的存活率。在体外，NT-3也有助于海马、交感神经节、背根神经节以及中脑腹侧多巴胺能和GABA能神经元的存活[60,147].

NT-3是上述三种神经营养素中最不加区分的结合伙伴，与TrkA、TrkB和p75的亲和力较低^NTR公司受体，与具有最高亲和力的TrkC受体[148,149]. 到目前为止，NT-3是唯一分离出的与TrkC受体高亲和力结合的神经营养因子。这很重要，因为皮质脊髓束的神经元表达TrkC受体[150]. CST是从大脑下降的最大、也是最重要的运动束之一。它涉及精细运动技能，如详细的手和数字功能。在发育中的脊髓中，高水平的TrkC受体位于发育中皮层的深层，CST神经元起源于此[151]. NT-3 mRNA在发育中的运动神经元脊髓中高度表达。向投射的CST靶区局部注射NT-3可增加CST的侧支出芽，这对靶区发现、神经支配和突触形成是必要的[47,152]. 虽然NT-3在成人脊髓中的表达很低，但TrkC的丰富表达允许CST的反应性模仿发育过程中的一些观察结果。将表达NT-3的细胞移植到病变部位，可使急性期和急性期CST在短距离内生长[46,153,154]和慢性时间点[155]. 这些研究还发现，无论是网格行走技能还是运动成绩，都有适度的功能恢复。

其他使用病毒载体介导的NT-3递送的研究发现，当与神经植入物结合时，CST纤维再生[156]或注射到头侧脊髓时[157]或三头肌[158]. CST轴突的侧支萌芽也可以从中线向表达NT-3的失神经运动神经元延伸[159,160]. CST轴突似乎是这种神经营养素的主要供体，因为在红脊髓或脊髓颈等其他神经束中也发现了缺乏发芽的现象[46].

NT-3的另一个优点是它与疼痛或痉挛等非目标效应无关。事实上，NT-3目前正在临床试验中作为周围神经病变的治疗方法进行研究，周围神经病变通常与慢性疼痛和痛觉超敏有关。这些试验的依据是，NT-3可以防止外周感觉轴突的退化，并可以改善这些神经元的功能反应[161,162,163]. 在一项试验中，NT-3研究组的神经病变损害评分显著改善，治疗后从腓肠神经活检评估的小有髓纤维数量增加[163]. 动物研究支持，在Charcot-Marie Tooth神经病中也考虑皮下注射NT-3[164].

5.结论

神经营养素对脊髓损伤神经元的生长、存活和引导的积极作用使其有望纳入治疗策略。充分了解它们对特定神经元群体的影响，可以实现最有效的靶向，而对受体相互作用的了解可以微调剂量并避免非靶向效应。结合干细胞移植或神经桥等有助于改善损伤环境的治疗，这些因素有可能促进脊髓损伤后的有意义恢复。