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.2016年5月；37(5):1209-20.
doi:10.3892/ijmm.2016.2536。 Epub 2016年3月22日。

人扁桃体来源的间充质干细胞的肌源分化潜力及其促进骨骼肌再生的潜力

赛阳公园 1, Yoonyong Choi先生 1, Namhee Jung女士 1, Yeonsil Yu公司 2, 京下柳 三, 韩素金 4, 仁浩·乔 2, Byung-Ok Choi先生 5, 宋楚荣 1
附属机构

人扁桃体间充质干细胞的肌源性分化潜能及其促进骨骼肌再生的潜能

赛阳公园等。 国际分子医学杂志. 2016年5月.

摘要

干细胞被认为是一种重要的细胞来源，可用于促进因先天性疾病、创伤或肿瘤切除导致肌肉组织组织缺陷而受损的骨骼肌（SKM）的再生。尤其是间充质干细胞（MSCs），需要较少的侵袭性采集技术，是干细胞治疗的宝贵细胞来源。在本研究中，我们证明了人扁桃体来源的MSCs（T-MSCs）可以在体外分化为肌源性细胞，并且人T-MSCs生成的成肌细胞和肌细胞移植可以在体内介导肌肉功能的恢复。为了诱导肌源性分化，将T-MSC衍生球体培养在添加1 ng/ml转化生长因子-β、，非必需氨基酸和胰岛素-转铁蛋白-硒培养4天，然后在肌原诱导培养基[含2%胎牛血清（FBS）和10 ng/ml胰岛素样生长因子1（IGF1）的低血糖DMEM]中培养14天。T-MSCs依次分化为成肌细胞和骨骼肌细胞，骨骼肌生成相关标记物[包括α-肌动蛋白、肌钙蛋白I型1（TNNI1）和肌生成素]的表达增加以及体外肌管的形成证明了这一点。步态评估（足迹分析）表明，将T-MSCs原位移植到右侧腓肠肌部分切除的小鼠体内可以增强肌肉功能，并恢复SKM的形状，而不会形成畸胎瘤。因此，T-MSCs可以分化为肌源性细胞，并在损伤后有效再生SKM。这些结果证明了T-MSCs在促进创伤后SKM再生方面的治疗潜力。

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数字

图1
图1
扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）向中胚层谱系分化潜能的建立。通过油红O、茜素红S染色和阿尔西安蓝分别测定，T-MSCs容易分化为（A）脂肪细胞、（B）成骨细胞和（C）软骨细胞。
图2
图2
人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）肌源性分化示意图。（A） 未分化的T-MSCs被诱导形成约50–100的（B）球体µ培养皿上直径为m。（C） 当转移到复制培养基中的胶原包被的培养皿中时，T-MSCs从球体中生长出来，并形成玫瑰花状扩展。（D） 将被镀细胞在成肌诱导培养基中培养2周，并改变其形态；他们相互融合以产生新生的肌管。原始放大倍数，×40。lgDMEM，低血糖DMEM；NEAA，非必需氨基酸；ITS，胰岛素-转铁蛋白-硒。
图3
图3
扁桃体来源的间充质干细胞（T-MSC）来源的肌源性细胞中肌源性标志物的检测。（A） 测定多能性和肌源性标记的mRNA表达水平。从（a区）未分化的T-MSCs、（b区）以玫瑰花瓣样扩张球培养的T-MSC衍生成肌细胞和（c区）终末分化的T-MSC衍生肌细胞中分离出mRNA，并用RT-PCR检测细胞。（B） 肌源性诱导过程中T-MSCs中肌源性标记物的蛋白表达水平（通道a，T-MSCs；通道B，T-MSC-derived myoblasts；通道c，T-MSC-derived monocytes）。测量GAPDH水平作为负荷控制。使用ImageJ软件对谱带强度进行量化。数据为一式三份实验的平均值±SEM。*P<0.05；**P<0.01。Klf4、Krüppel-like因子4；Pax7，配对盒7；Myf6，肌生成因子6；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；TNNI1，肌钙蛋白I 1型；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶。
图4
图4
肌源性标记物的免疫细胞化学检测。肌源性诱导过程中扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）中肌肉相关蛋白的表达通过使用肌源性卫星细胞抗体（a组，CD34；红色）、前体[b组，配对框7（Pax7）；绿色]、，分化成肌细胞[面板c，结蛋白（红色）；面板d，肌营养不良蛋白（绿色）；面板e，肌球蛋白重链（MHC；红色）]，骨骼肌原细胞[面板f，α-肌动蛋白（绿）；面板g，肌钙蛋白I型1（TNNI1；绿）；板h，肌原蛋白（红）]。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染。样品在荧光显微镜下使用适当的过滤器进行分析。（A） 未分化T-MSCs表达（A组）CD34和（b组）Pax7，但没有其他肌源性细胞标记物。（B） 分化成成肌细胞后，80-90%的细胞表达（c组）结蛋白、（d组）肌营养不良蛋白和（e组）MHC，20-50%的细胞表达骨骼肌（SKM）标记物，包括（f组）α-肌动蛋白、（g组）TNNI1和（h组）肌生成素。（a组）CD34和（b组）Pax7在T-MSC衍生成肌细胞向T-MSC派生肌细胞分化过程的任何阶段均未表达。（C） 与T-MSC来源的成肌细胞相比，T-MSC源性心肌细胞（C至h组）肌源性和SKM细胞标记物的表达增加，并形成多核肌管。异硫氰酸荧光素；TRITC，四甲基罗丹明异硫氰酸盐。原始放大倍数，×200。
图5
图5
免疫荧光染色的定量证实，在肌源性分化过程中，肌源性标记物的表达，表明T-MSCs形成成肌细胞的分化潜力。数据为平均值±SEM。对于每种情况，使用4张载玻片进行量化。图表示3个独立实验的多次测试的平均值。
图6
图6
从人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）衍生成肌细胞。（A） 通过使用针对配对盒蛋白7（Pax7；绿色）或α-肌动蛋白（绿色）的一级抗体进行免疫染色，评估T-MSCs在肌生成诱导过程中肌生成蛋白的表达。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染。样品在荧光显微镜下使用适当的过滤器进行分析。（B） 免疫荧光定量证实，在肌源性分化过程中，Pax7和α-肌动蛋白的表达分别减少或增加，表明T-MSCs具有形成肌细胞的分化潜力。数据为平均值±SEM。对于每种情况，使用4张载玻片进行量化。图表示三个独立实验的多次测试的平均值，*P<0.05。异硫氰酸荧光素。原始放大倍数，×200。
图7
图7
人类扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）移植到切除了骨髓的C57BL/6小鼠体内的再生潜能。肌肉损伤48小时后，将T-MSCs或T-MSC衍生肌源细胞肌肉注射到腓肠肌损伤部位的中点。DAPI染色（蓝色）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色）、肌营养不良蛋白（红色）免疫染色；对于α平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色），肌营养不良蛋白（红色）；黄色表示α-SMA和肌营养不良蛋白的合并图像。原始放大倍数，×400。
图8
图8
将人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）移植到切除骨髓的C57BL/6小鼠体内的骨骼肌（SKM）再生。肌肉损伤后，肌肉注射T-MSCs或T-MSC衍生肌源细胞，并在移植后2天、1周、4周和8周获取活检标本。SKM再生的代表性图像显示，在受伤、车用治疗（车用）和T-MSC-和T-MSC肌细胞注射组小鼠的组织横切面上，肌钙蛋白I 1型（TNNI1；红色）和DAPI（蓝色）染色。原始放大倍数，×400。
图9
图9
通过足迹分析评估步态。（A） 图中显示了足迹分析中测量的参数，虚线表示进展方向。在移植后1周、2周、3周、4周和8周对正常（n=8）和受伤（n=八）、假手术（n=八月）和肌细胞注射小鼠（n=八十）的足迹进行评估，以测量步长（厘米）。（B） 直方图表示正常小鼠、受伤小鼠、车辆治疗小鼠以及注射T-MSC衍生心肌细胞的小鼠之间的步长差异。图表示三个独立实验的多次测试的平均值，*P<0.05，**P<0.01。TP，移植。
图10
图10
小鼠腓肠肌的形态学。植入后肌肉的形状发生了变化。照片显示了移植后（A）1周和（B）10周受伤小鼠的肌肉。照片显示了移植后10周时，（C）车辆处理小鼠、（D）扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSC）注射小鼠、（E）T-MSC衍生成肌细胞注射小鼠和（F）T-MSC-衍生肌细胞注射鼠的肌肉。
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