扁桃体间充质干细胞分化为雪旺细胞表型并促进周围神经再生

摘要

雪旺细胞（SCs）能产生神经营养因子和粘附分子，以前有报道称其在轴突再生过程中有助于结构支持和引导；因此，它们可能是修复受损神经组织的关键靶点。自体SC移植已经实施，并在治疗神经损伤和供体部位发病率方面显示出良好的临床效果，而细胞生产不足被认为是一个主要问题。在这里，我们将扁桃体来源的间充质干细胞（T-MSCs）分化为SC样细胞（T-MSC-SC），以评估T-MSC-SC作为SC的替代品。使用SC标记，例如19加元,GFAP公司,MBP公司,神经生长因子受体,S100B型，以及KROX20系列在定量实时PCR中，我们检测到神经生长因子受体,S100B型，以及KROX20系列和下调19加元和MBP公司在完全分化阶段。此外，当分化的SC与小鼠背根神经节神经元共同培养时，我们发现轴突髓鞘化。将T-MSC-SC应用于坐骨神经损伤小鼠模型，显著改善了步态，促进了受损神经的再生。因此，人T-MSCs移植可能适合于辅助周围神经再生。

1.简介

雪旺细胞是外周神经的胶质细胞，包裹轴突在外周神经系统中形成髓鞘。干细胞的发育包括一系列步骤，其中神经嵴细胞产生干细胞前体，然后分化为未成熟干细胞。这些最终分化为包括髓鞘化和非髓鞘化类型的成熟SC[1].

SCs是神经组织损伤后不可缺少的修复介质[2]. 它们还参与许多疾病的发病机制，包括遗传性疾病，如夏科特-玛丽-牙病、易患压力性麻痹的遗传性神经病，以及代谢性疾病，例如糖尿病性神经病[3,4,5]. SCs被认为是一种潜在的细胞来源，可用于移植修复功能性周围神经。内源性SC产生各种神经营养因子、细胞因子和细胞外基质分子，从而为轴突再生提供结构支持和指导[6]. 自体SC移植已显示出良好的临床效果，例如对受损轴突进行再髓鞘化并恢复其导电特性[7]. 然而，为了从神经活检中获得SCs，必须牺牲另一条功能性神经，以进行所需细胞系的体外扩增。此外，由于培养SC存在技术困难，因此确保足够的数量并不容易。因此，最好采集具有广泛自我更新能力、广泛分化潜能和易于获得特性的其他细胞源。

间充质干细胞（MSCs）是来源于各种组织的多能干细胞，具有分化为多种中胚层谱系的能力，包括成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞[8]. 这些不同的多能干细胞也可以分化为外胚层谱系的细胞，包括神经元和胶质细胞。利用皮肤衍生MSCs、脂肪组织衍生MSCs（AMSC）、骨髓衍生MSCs和脐带衍生MSCs进行的各种研究试图在不同条件下将其分化为SC[9,10,11,12]. 尽管骨髓源性骨髓间充质干细胞是与SC分化相关的最深入研究的骨髓间充质干细胞类型之一，但由于其产量低且需要侵入性手术来分离，因此在临床应用方面受到限制[13]. 此外，它们的增殖率和分化潜能已被证明随着供体年龄的增加而降低。

扁桃体衍生MSCs（T-MSCs）是扁桃体切除术中作为“废物”组织从腭扁桃体中分离出来的一类新的MSCs[14,15]. 人类扁桃体是淋巴上皮组织，在青春期前充当免疫器官，在衰老过程中发生萎缩。与其他MSC一样，T-MSC也表现出自我更新能力、多系分化特性和免疫抑制特性[15]. 特别是，T-MSCs的高增殖率对于定量恢复和建立可靠的细胞系非常重要。几项研究证实，T-MSCs表达典型的MSC细胞表面标记，并能分化为中胚层谱系[14,15,16].

这里，我们证明T-MSC可以分化为SC（T-MSC-SC）。为了评估这一点，我们进行了定量逆转录聚合酶链反应（RT–qPCR）、蛋白质印迹和免疫染色。将T-MSC-SC与小鼠背根神经节（DRG）神经元共培养，研究轴突上髓鞘的形成，并将T-MSCS-SC移植到坐骨神经损伤的小鼠体内。为了评估神经营养因子的分泌，在NSC34小鼠运动神经元与T-MSC-SC培养获得的条件培养基（CM）培养时，测量了它们的突起生长。我们假设T-MSC-SCs可能作为天然SCs的替代细胞来源，并可用于周围神经损伤的自体移植治疗。

2.结果

2.1、。分化的扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）表现出雪旺细胞（SC）样形态

如前所述，为了检测T-MSCs的细胞表面标记和中胚层分化能力，测定了流式细胞术分析和中胚叶分化[17].图1A显示MSC表面标记的染色模式。T-MSCs缺乏CD14、CD34和CD45表面标记的表达，并表达CD73、CD90和CD105细胞表面标记。我们还利用分化培养基研究了T-MSCs分化为中胚层细胞的能力。油红O染色证实脂肪分化，茜素红S染色证实成骨分化，阿尔新蓝染色证实软骨分化(图1B） ●●●●。人T-MSCs在原代培养物初筛后5-8代内恢复，呈单层大扁平细胞。将它们重新放置在含有DMEM/F12培养基并辅以EGF、bFGF和B27的塑料皿中。在该培养基中培养7天后，出现了许多漂浮细胞球体。将这些神经球磨碎并用SC分化培养基替换成层粘连蛋白涂层培养皿(图2). 分化10天后，机械分离的细胞表现出形态变化，如伸长的双极或三极纺锤形(图2C、 D）。与未分化的T-MSCs相比，T-MSC-SCs也表现出更薄的细胞质延伸和更大的细胞核。

2.2. RT–qPCR

为了确定SC样细胞的分化潜能，我们检测了作为SC前体标记物的钙粘蛋白19（CAD19）的表达，以及作为SC标记物的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、神经生长因子受体（NGFR）和S100钙结合蛋白B（S100B）的表达(图3). SC的每个标记可以表征谱系的每个阶段。GFAP、NGFR和S100B是典型的未成熟SC标记。因此，它们在前体细胞和神经嵴细胞中缺失或以极低水平存在，但在未成熟的SC中表达。Cad19主要在大鼠的前体阶段表达；然而，鸡Cad19直到发育后期才在SC中表达。成熟的髓鞘形成细胞的特点是转录因子Krox20和髓鞘相关蛋白如髓鞘碱性蛋白（Mbp）上调[18,19,20,21]. 除了24克朗，所有SC标记均在神经球期高表达。SC分化后GFAP公司,神经生长因子受体,S100B型,KROX20系列，以及24克朗增加，而MBP公司和19加元降低。的表达式级别MBP公司是SC发育成熟阶段的特异标志，在SC分化阶段下降。这些数据证实了人类T-MSCs分化为SC的潜力。

2.3. 免疫荧光和Western印迹证实神经生长因子受体（NGFR）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）蛋白的表达

为了确定T-MSC-SC的分子特征，在SC分化前后进行免疫细胞化学和免疫印迹，使用NGFR和GFAP抗体(图4). NGFR蛋白在分化前未检测到，但分化后通过免疫荧光染色和Western blotting检测到。NGFR-阳性细胞比例为67.6%±17.4%。与NGFR类似，几乎所有细胞在SC分化后也表达GFAP。然而，通过Western blotting在未分化的T-MSCs中也检测到GFAP蛋白。在另外三代中，GFAP和NGFR蛋白的表达水平保持良好。

2.4. 从扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSC-SCs）分化的SC-样细胞条件培养基（CM）促进NSC34运动神经元的神经突起生长

SC分泌几种可溶性生长因子，可刺激神经突起生长[22,23]. 我们使用NSC34小鼠运动神经元细胞来评估从T-MSC-SC培养物中收集的CM是否能够刺激神经突起的生长。为了消除雪旺细胞诱导培养基的任何其他影响，包括一些分子，如forskolin、PDGF、bFGF和heregulin-β1，用PBS洗涤两次后收集CM样品。作为另一个对照，NSC34细胞也在SC分化培养基（SM）中培养。在CM和SM中培养4天后，一些NSC34细胞出现了突起生长，其形态学变化与在常规NSC34分化培养基（DM）中生长的细胞相似，而在增殖培养基（PM）中培养的细胞没有突起生长(图5A） ●●●●。糖尿病包括有效量的全反式维甲酸（atRA）和非必需氨基酸（NEAA），已知它们通过调节神经营养素受体或其他神经调节因子的转录水平参与神经元的生长[24,25]. SM最长轴突的长度大于CM。SM中的Heregulin可能促进NSC34细胞的轴突生长[26]. 在SM中存在的其他因子中，已知bFGF通过刺激MEK-ERK1/2和PI3K-AKT通路来促进神经突起的生长[27].

神经突起的生长通过两个独立参数进行评估：带神经突起细胞的百分比和最长神经突起长度(图5B） ●●●●。PM中没有NSC34细胞显示延伸的轴突，但显著增加到28.24%±14.06%(第页<0.01）。培养的神经突平均最大长度为170.33±40.83µm(第页<0.01），在DM中为105.00±20.00µm(第页<0.05），以及252.70±29.81µm(第页<0.001）。

神经营养因子（脑源性神经营养因子）的表达水平(BDNF公司)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF公司))T-MSC-SC中神经生长因子水平升高(NGF）与未分化T-MSCs中的表达水平相比，表达水平降低(图5C） ●●●●。然而，这些神经营养因子的表达水平，包括神经生长因子与在原代人雪旺细胞（HSC）中观察到的细胞相比，其数量显著增加。

2.5. 体外培养的骨髓间充质干细胞可使轴突髓鞘形成

将T-MSC-SC接种到新的培养皿中后，与小鼠胚胎DRG神经元共培养。基于先前的研究[28]，我们将两种不同的培养基配方依次应用于T-MSC-SC和DRG共培养。4-5天后，DRG外植体出现广泛的突起，并延伸至T-MSC-SC区域；此外，一些T-MSC-SC与神经突束相关(图6A、 B）。在小口径轴突周围检测到MBP阳性但无髓鞘的T-MSC-SCs(图6A） ●●●●。然而，这些T-MSC-SC位于束的外侧，而不是沿着神经突纵向分布。3-4周后，T-MSC-SC偶尔包裹轴突，这种髓鞘的形成通过抗人线粒体和抗MBP抗体的双重免疫染色得到证实(图6C） ●●●●。DRG与T-MSC-SCs共培养的轴突中髓鞘形成事件的比率为14.44%±3.84%。在没有T-MSC-SC的情况下培养DRG神经元时，未观察到MBP阳性轴突(图6D） ●●●●。这些结果表明，DRG神经元制剂不含可能有助于髓鞘形成过程的污染SC。对于树突状标记物染色，MAP2在DRG的感觉神经元和DRG的迁移感觉神经元中呈阳性染色(图7). 然而，在轴突或轴突束中未观察到MAP2阳性细胞。

2.6. 受损坐骨神经的功能恢复

为了评估T-MSC-SC对改善小鼠周围神经损伤模型的疗效，在坐骨神经部分切断后，将T-MSC-SC移植物移植到小鼠坐骨神经的瘢痕区。每周通过研究足迹模式进行功能恢复分析(图8A） ●●●●。移植后一周内，与对照组相比，细胞移植组和损伤组的脚趾排列没有改变。到第2周，移植组脚趾分离明显改善，并在实验期间持续。虽然移植组的步态有了根本性的改善，但受伤和未经治疗的小鼠的脚趾分离没有任何变化。这些测量值是根据SFI公式计算的(图8B）[29].

步态分析后，采用免疫组织化学方法评估有髓神经的再生效果(图8C） ●●●●。免疫染色显示，移植组大量再生轴突被髓鞘包围，部分轴突形成簇状。在损伤组，一些髓鞘出现扭曲，许多轴突被破坏。为了验证这些结果，我们使用了复合肌肉动作电位（CMAP）振幅和运动神经传导速度（NCV）的电生理测量(图9).图9显示出统计显著性(第页术后6周，T-MSC-SC移植组CMAP振幅（17.41±2.37 mV）较损伤组（9.10±1.23 mV）增加（p<0.01）。然而，损伤组和移植组小鼠的MNC速度没有显著差异。因为CMAP振幅取决于轴突的数量，这些数据表明T-MSC-SC有能力支持坐骨神经再生[30].

3.讨论

在这里，我们证实了从人类腭扁桃体分离的T-MSC具有沿着神经胶质细胞谱系分化的能力，并表达包括SC在内的神经胶质细胞的典型细胞标志物。通过RT-qPCR和Western blot分析，我们观察了SC-特异性标记的表达。未成熟SC标记物GFAP和NGFR在T-MSC-SC中的表达增加，但GFAP在未分化T-MSCs中的表达也较低。这一观察结果与报告一致，即骨髓间充质干细胞可以在4-5代后获得GFAP表达，而无需任何特定的神经诱导[31]. 直接早期基因的最高表达，KROX20系列在神经球期观察到。然而，另一个即时早期基因的表达，KROX24系列，在T-MSC-SCs中最高。根据其他研究报告，KROX20系列和KROX24系列以连续和相互排斥的方式表达[32,33,34]. Krox20促进SC分化为有髓鞘表型，而Krox24是一种无髓鞘SC标志物[33]. Krox20和Krox24在SC谱系的发展中起着拮抗作用[34].

在SC发育过程中，成熟的SC最终分化为两种不同的功能类别：髓鞘化和非髓鞘化类型。髓鞘化SC选择性地包裹大直径轴突，而非髓鞘化SCs偶尔附着在小的神经元束上[4]. 为了研究T-MSC-SC是否能够获得成熟SCs的双重能力，我们与12.5至13天龄小鼠胚胎分离的初级DRG神经元进行了共培养。4-5天后，我们观察到来自DRG外植体的神经纤维倾向于向附近的T-MSC-SC生长，并通过其尖端附着在其中一些细胞上。其中一些形成了束，但它们的结合模式不被视为表明髓鞘拉长。3-4周后观察T-MSC-SC新形成的髓鞘，并用抗人线粒体和抗MBP抗体双重染色进行验证。MBP是SC发育成熟阶段的一个特定标记，是髓磷脂的主要成分[35]. Liu等人报告说，MBP在初级SC纯培养物早期的表达率很高，在P3 SC中达到100%[35]. 然而，在我们的研究中，MBP在分化的T-MSC-SC中的表达水平降低。如所示图6A、 只有当T-MSC-SC与DRG神经元接触时，才能检测到T-MSC-SCs中MBP的表达。MBP的表达可能依赖于SC-轴突通讯，SCs的髓鞘形成完全依赖于与轴突的接触[36]. 虽然我们无法测量这些T-MSC-SCs的髓鞘化功效或功能相关性，但这一观察结果表明，这些T-MSCS-SCs的生物学功能类似于内源性SCs，因此它们可能适用于周围神经损伤的细胞移植。

众所周知，成熟的SC会产生支持轴突生长的可溶性神经营养因子，包括NGF、BDNF、睫状神经营养因子、神经营养素-3和FGF[1,12]. 我们从T-MSC-SC培养物中收集CM，并研究其对NSC34小鼠运动神经元突起生长的可能有益作用。具有轴突的细胞百分比和最长轴突的长度显示出与含有NEAA和atRA的常规NSC34轴突DM相似的效果。我们观察到BDNF公司和GDNF公司远高于未分化T-MSCs和原发性HSC中检测到的结果。因此，神经突起的生长可能受T-MSC-SC分泌的可溶性神经营养因子控制。最初，我们尝试使用NSC34细胞不仅用于神经突起的生长，还用于共培养实验。然而，与神经突起生长实验相反，由于NSC34的细胞大小和轴突生长长度的限制，NSC34细胞不能用于进行共培养实验。因此，我们使用DRG外植体与NSC34细胞坚持的T-MSC-SCs共培养。我们观察到T-MSC-SC在与DRG外植体共培养期间能够使轴突髓鞘化。

在这里，我们证明，与未治疗组相比，T-MSC-SCs显著改善了受伤小鼠的步态，这表明在这种急性周围神经损伤的啮齿动物模型中，T-MSC-SCs支持强大的轴突生长和髓鞘的结构形成。与足迹结果一致，再生坐骨神经中MBP和NF-H蛋白的免疫染色模式以及CMAP振幅的增加表明，T-MSC-SC促进轴突再生和再髓鞘化。众所周知，再生神经的直径通常小于正常神经，髓鞘较薄，T-MSC-SC移植小鼠的再生轴突也显示出相对较小的轴突和较薄的髓鞘[37]. 然而，与未治疗的损伤组相比，髓鞘结构显示出刚性结构。由于T-MSC-SCs在与DRG外植体共培养期间能够使轴突髓鞘化，我们假设T-MSC-SC通过直接使再生轴突髓磷脂化来改善神经损伤修复后的步态。然而，T-MSC-SC移植到周围神经损伤小鼠后，几乎未检测到抗人线粒体或抗人细胞核抗体等人类特异性标记物。关于这些移植如何能诱导如此显著的恢复的一个解释是，它们可能会招募内源性宿主SC来进行髓鞘形成，如脊髓损伤模型所示[38]. 这种积极影响可能是由内源性宿主SC的神经营养作用引起的。另一种强烈的可能性是，T-MSC-SC分泌的神经营养因子可能影响受损坐骨神经的轴突再生。根据轴突生长实验，在T-MSC-SCs中观察到的BDNF和GDNF的高表达水平可能在这一再生过程中发挥重要作用。T-MSC-SC可能通过提供神经营养因子为轴突再生提供更合适的环境，从而帮助轴突再生，避免出现非允许性再生的线索[39]. 虽然受损的外周神经轴突有再生能力，但功能恢复通常是不完整的。这是因为轴突生长锥在再生过程中遇到物理屏障，如胶质细胞、炎性细胞和髓鞘碎片，可能会被误导。除了神经营养和髓鞘形成功能外，SCs在降解损伤部位的组织碎片方面发挥着关键作用，并为神经再生提供营养环境[2]. 因此，考虑到MSC的这些不同作用，T-MSC-SCs可能会在我们的MSC诱导的损伤后周围神经修复模型中诱导功能改善。

迄今为止，人们主要研究T-MSCs，以了解其作为MSCs的基本特征。根据我们小组和其他人的报告，T-MSCs表现出MSC表面标记的典型表达模式（CD14、CD34和CD45为阴性；CD73、CD90和CD105为阳性），并具有多系分化潜能[14,15,16,17,40]. 之前的研究也强调，与其他类型的MSC相比，T-MSC的倍增时间相对较短（约38小时）（14-17）。本研究首次证明了在适当的条件下，人T-MSCs可以分化为SC。将我们的数据与以前的研究相结合，T-MSCs的分化潜能似乎可以克服分化极限，从而进入中胚层、内胚层和外胚层谱系。

总之，我们在这里已经表明，T-MSC有能力分化为SC。SC-特异性标记物的表达、神经突起生长的支持和髓鞘的形成表明，T-MSC-SC具有与内源性SCs相似的能力。T-MSC-SC移植可改善小鼠坐骨神经损伤模型的功能。因此，T-MSCs可能是SC移植的一种有价值的细胞来源，而人类T-MSC-SCs的移植可能适合于协助周围神经再生。然而，本研究中使用的损伤模型是轻度损伤模型。进一步研究T-MSC-SC在其他中度或重度损伤模型中的应用，如标准的15-mm神经缺损模型，将提供更多关于T-MSC-SCs在周围神经再生中应用可行性的信息。

4.材料和方法

4.1. 扁桃体间充质干细胞（T-MSC）和人雪旺细胞（HSC）培养

如前所述，分离并培养T-MSCs[15,17]，稍作修改。简言之，在本研究中，我们使用了一名6岁接受扁桃体切除术患者的扁桃体。参与本研究的患者的法定监护人提供了知情书面同意书，研究方案得到了韩国首尔Ewha Womans大学机构审查委员会（ECT-11-58-37）的批准。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗分离的扁桃体组织三次，切碎，并用I型胶原酶（210 U/mL；Gibco BRL，Carlsbad，CA，USA）和DNase I（10µg/mL；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA在37°C下搅拌30分钟。消化后的组织通过细胞过滤器（孔径70µm；SPL，Pocheon，韩国）过滤，然后在300×克在室温下保持3分钟。在这些细胞中，我们使用Ficoll–Paque™PREMIUM（GE Healthcare，Pittsburgh，PA，USA）在300×克在室温下保持30分钟。MNC的电镀密度为1×10⁸在湿化5%CO条件下，在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素（Hyclone）的DMEM中，每个T-150烧瓶中的细胞数₂在37°C的空气中。48小时后，去除非粘附细胞，将剩余的粘附细胞（以下简称T-MSCs）培养在DMEM生长培养基中，并每周传代两次。根据特异性表面抗原表达确认T-MSCs：造血干细胞生物标记物CD14、CD34和CD45不表达，间充质干细胞生物标志物CD73、CD90和CD105阳性表达。本研究中使用的所有T-MSCs均在第6代和第8代之间。

HSC购自ScienceCell（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市，目录编号1700），并根据制造商的说明，在含有5%CO的加湿培养箱中在培养基（目录编号1701）中培养₂37°C时。每3天更换一次媒体。

4.2. 脂肪、软骨和成骨分化

如前所述，检测了T-MSCs的中胚层分化[17]. 为了进行成脂分化，将T-MSCs培养在商用成脂培养基（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）中3周。在PBS中洗涤后，将它们在4%多聚甲醛中固定15分钟，然后再次用PBS洗涤，并在室温下用2%油红O（Sigma-Aldrich）染色1小时。再次用PBS冲洗T-MSCs。光镜下观察细胞内脂滴。为了进行软骨分化，T-MSCs在软骨生成诱导培养基（Invitrogen Life Technologies）中培养3周。用PBS清洗细胞，并将其固定在4%多聚甲醛中15分钟。用PBS再次清洗后，在室温下用1%阿尔西安蓝（Sigma-Aldrich）染色1小时。为了去除多余的染料，再次用PBS洗涤T-MSC。用0.1N HCl冲洗细胞后，使用相差显微镜观察细胞。为了进行成骨分化，T-MSCs在成骨培养基（Invitrogen）中培养3周。随后，用PBS清洗细胞，并将其固定在4%多聚甲醛中15分钟。用2%茜素红S（Sigma-Aldrich）染色1小时后，再次用PBS冲洗细胞两次。显微镜下观察细胞外基质钙化。

4.3. 动物和T-MSC-SC移植

实验动物的使用和护理得到了Ewha Womans大学医学院动物护理和使用委员会（ESM#15-0294）的批准，所有实验均按照批准的指南和法规进行。对于损伤对照组，麻醉体重20–30 g的成年雄性C57BL/6小鼠（腹腔注射50 mg/kg Zoletil，Virbac，Carros，France），并在坐骨切迹处部分切断右侧坐骨神经，形成神经间瘢痕。对于T-MSC-SC移植，分化细胞悬浮在6%聚乙二醇-b-聚丙氨酸（PEG-l-PA）凝胶中（由韩国首尔Ewha Womans大学化学与纳米科学系Byeongmoon Jeong善意提供），溶解在补充50 mg/mL l-抗坏血酸的DMEM/F12中，浓度为4×10⁶细胞/mL，并在神经手术后转移到7-mm PVC管中。正常对照组和T-MSC-SC移植组各使用6只小鼠，其中5只用作受伤的未治疗对照组。

4.4. SC表型的分化

为了将T-MSCs分化为SC，我们使用了Razavi等人的技术[41]诱导人T-MSC形成神经球。我们采集人类T-MSCs（80%–90%融合），然后将其置于（1.5–2）×10的塑料皿中⁵细胞/厘米²DMEM/F-12（Welgene Inc.，韩国大邱）中添加20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，PeproTech，英国伦敦）、20 ng/mL表皮生长因子（EGF，PeproTech）和2%B27补充剂（1:50，Gibco，Life Technologies，Burlington，ON，Canada），温度37°C，5%CO₂在潮湿的空气中。我们每隔3-4天用新鲜培养基补充培养物。7天后，使用25号针头研磨神经球，并将其重新放置在含有DMEM/F12（补充有10%FBS）、14µM forskolin（Sigma-Aldrich）、5 ng/mL血小板衍生生长因子-AA（PDGF，PeproTech）、10 ng/mL bFGF（PeproTech）和200 ng/mL重组人血凝蛋白-β1（PeproTech）的层粘连蛋白涂层细胞培养板中用于末端分化。这些细胞在这些条件下孵育9天，然后收获用于进一步研究。

4.5. RT-qPCR

这是使用SYBR执行的^®在ABI 7500快速实时PCR系统（Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上预混料Ex Taq™试剂盒（TaKaRa Bio Inc.，日本志贺），以确认T-MSC和T-MSC-SC细胞系中基因的相对表达水平。使用了以下人类引物：正向间隙引物：5′-CCCCACTCCACCTTGAC-3′，反向间隙引物：5′-CTGTGCTGTAGCCAATTCG-3′；向前地钙19引物：5′-TTACTGCTGCGTTTTATGTTGGG-3′，反向19加元引物：5′-CACAGCCTTCACTCTC-3′；向前地GFAP公司引物：5′-CCGACAGTGCCATGTG-3′，反向GFAP公司引物：5′-GTGCTGGACGCCATTGC-3′；向前地KROX20系列引物：5′-AACGGAGTGGCCGGATAT-3′，反向KROX20系列引物：5′-ATGGGGAGATCCAACGACCTCT-3′；向前地KROX24系列引物：5′-CAGCAGTCCATTTACTCAG-3′，反向KROX24系列引物：5′-GACTGGTTAGCTGGTATTG-3′；向前地MBP公司引物：5′-ATCCAAGTACCTGCCACAG-3′，反向MBP公司引物：5′-CAAGGATGCCGTGTCTC-3′；向前地神经生长因子受体引物：5′-CCTACTGTACCGAT-3′，反向神经生长因子受体引物：5′-TGGCCTCGTCGGAATACG-3′；向前地S100B型引物：5′-GGAGACGGCGAATGTGACTT-3′，反向S100B型引物：5′-GAACTCGTGGCAGGCAGTAGTAA-3′；向前地BDNF公司引物：5′-GATGCCAGTTGCTTTGTCTTC-3′，反向BDNF公司引物：5′-TAAAAATCTCGTCCCCAACA-3′；向前地GDNF公司引物：5′-TTCAAGCCACCATTAAAAGAC-3′，反向GDNF公司引物：5′-ATAGCACAGAGACCCAGTCAGT-3′；向前地神经生长因子引物：5′-GTCAGCGTGTGGGTGGGGATA-3′，反向神经生长因子引物：5′-GACAAGGTGTGAGTCGTGT-3′。使用比较C_t吨方法(${\mathrm{<trans\; data-src="2">2</trans>}}^{<trans\; data-src="-">负极</trans>\mathsf{<trans\; data-src="\Delta ">\Delta </trans>}\mathsf{<trans\; data-src="\Delta ">\Delta </trans>}{\mathrm{<trans\; data-src="C">C</trans>}}_{\mathrm{<trans\; data-src="t">t吨</trans>}}}$) [42]. 所有测量均一式三份。

4.6. Western Blot分析

用冰镇PBS清洗T-MSCs和T-MSC-SC，并在含有磷酸酶抑制剂鸡尾酒溶液的PRO-PREP缓冲液（iNtRON Biotechnology，Seongnam-si，Korea）中在冰上溶解30分钟。13000×离心后克在4°C下持续20分钟，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离上清液中等量的蛋白质，并将其电泳转移到聚偏乙烯膜上（Millipore，Billerica，MA，USA）。然后在4°C下隔夜用抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体（1:400，单克隆抗体，Sigma-Aldrich，目录号G3893）或神经生长因子受体（NGFR/p75）（1:500，多克隆抗体，Santa Cruz Biotechnology，目录号sc8317，Dallas，TX，USA）、，其次是相应的二级抗体。根据制造商的说明，使用增强化学发光试剂（WestSave GOLD™Western Blot检测试剂盒）（韩国首尔AbFrontier）清洗并显影印迹。通过密度计扫描（LAS-3000，Fujifilm，Tokyo，Japan）评估谱带强度。

4.7. 免疫细胞化学和免疫组织化学

将T-MSCs和T-MSC-SCs胰蛋白酶化并添加到层粘连蛋白涂层细胞培养玻片中。细胞固定在4%(w个/v（v）)多聚甲醛（15分钟，室温），在冰镇PBS中洗涤三次。用1%牛血清白蛋白（BSA，Bovogen Biologicals，墨尔本，维多利亚州，澳大利亚）封闭后，用抗GFAP单克隆抗体（1:200，Sigma-Aldrich，目录号G3893）在4°C下培养细胞过夜或抗NGFR多克隆抗体（1:200，Santa Cruz Biotechnology，cat.no.sc8317）。在PBS中冲洗后，在室温下黑暗中应用与Alexa Fluor 488偶联的次级山羊抗鼠抗体和次级山羊抗兔抗体1小时。细胞用含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的Vectasheld 1（Vector Laboratories，Burlingame，CA，USA）安装介质固定。使用Olympus BX51相控显微镜（日本东京）观察细胞。

免疫组化显示，小鼠坐骨神经固定在10%甲醛中。在4°C下固定约24小时后，在室温下用PBS洗涤神经。神经在分级乙醇系列中脱水，用二甲苯清除，并用石蜡包埋。将试块切成5µm厚的连续切片。脱蜡切片用3%过氧化氢处理20分钟以阻断内源性过氧化物酶，并在微波炉中与0.01 M柠檬酸缓冲液（pH 6）孵育3个周期，每个周期5分钟，在850 W下进行抗原回收。随后，在室温下用20%马血清（Hyclone）在PBS中封闭切片1小时，然后用抗髓磷脂碱性蛋白（MBP）多克隆抗体（1:100，Millipore，分类号AB980）和抗神经丝重多肽（NF-h）单克隆抗体（1:100，Santa Cruz Biotechnology，分类号sc58553）孵育在4°C下过夜。在PBS中冲洗后，将与Alexa Fluor 568结合的次级山羊抗鼠抗体和与Alexa-Fluor 488结合的二级山羊抗兔抗体在室温下黑暗中涂抹1 h。使用含有DAPI的Vectashide 1（Vector Laboratories）安装介质安装细胞。

4.8. CM准备

CM收集自T-MSC-SC培养物，培养至80%融合。在抽吸培养基并用PBS洗涤细胞两次后，在37°C和5%CO中用补充有2%FBS的DMEM进一步培养细胞₂在潮湿的空气中。2天后，我们收集培养基并在1000×克5 min，收集上清液作为CM。

4.9. NSC34细胞分化的评估

小鼠运动神经元样细胞系NSC34细胞接种含有2×10的1mL等分悬浮液⁴涂有聚乙烯的6孔板每孔中的细胞/mL-我-赖氨酸。20小时后，我们用PBS冲洗细胞两次，并在以下培养基中培养4天：（1）含10%FBS的DMEM（增殖培养基组）；（2） DMEM:F12（1:1），含1%FBS，1%改性Eagle's培养基，含非必需氨基酸（NEAA），1µM全反式维甲酸（NSC34神经突起分化培养基组）；（3）CM（T-MSC-SC CM组）。轴突长度>50µm的细胞被视为分化细胞。

4.10. T-MSC-SCs与小鼠DRG细胞共培养

为了评估共培养物中的髓鞘化程度，在添加DRG前1天，将T-MSC-SC融合培养物进行胰蛋白酶化，并添加到层粘连蛋白涂层的2孔细胞培养载玻片中（SPL Lifesciences Inc.，韩国首尔）。为了纯化DRG神经元，从韩国BioLink Co.（Chungbuk，Korea）购买怀孕的ICR小鼠。妊娠第12.5-13天取出胚胎并解剖DRG。用1mL含10%FBS的DMEM轻轻冲洗两次，然后直接将其涂布在接种有T-MSC-SC的载玻片上。然后在共培养基中培养4天：Eagle's基础培养基、ITS补充物、0.2%BSA、4 mg/mLd日-葡萄糖（均来自Sigma-Aldrich）、谷氨酰胺（Gibco）、50 ng/mL神经生长因子（NGF、PeproTech）和抗生素，然后切换到添加15%FBS和50 mg/mL的相同培养基我-抗坏血酸（Sigma-Aldrich）再维持3-4周以诱导髓鞘形成。这是基于Krause等人的技术，稍作修改[28].

对于免疫染色，培养箱载玻片上的细胞固定在4%(w个/v（v）)多聚甲醛（15分钟，室温），并在冰镇PBS中洗涤三次。用1%BSA（Bovogen）封闭后，在4°C下用抗MBP多克隆抗体（1:200，Millipore，cat.no.AB980）和抗人线粒体抗体（1:400，Millibore，cat no.MAB1273）孵育共培养细胞过夜；DRG对照细胞与抗MAP2多克隆抗体（1:400，Millipore，cat.no.AB5622）孵育。在PBS中冲洗后，将与Alexa Fluor 488偶联的次级山羊抗兔抗体和与Alexa-Fluor 568偶联的二级山羊抗鼠抗体在室温下黑暗中应用1 h。细胞用含有DAPI的Vectashield1（Vector Laboratories）安装介质进行安装。使用Olympus BX51荧光显微镜（日本东京）观察细胞。

4.11. 步态足迹分析与坐骨功能指数（SFI）评价

将正常和受伤的后爪涂上黑色染料，并鼓励小鼠沿着80厘米长的跑道在纸上直线行走。然后观察足迹模式。在同一会话中记录的一系列至少五个连续步骤用于确定每只小鼠的行走模式。诱导损伤后，每周对动物进行一次测试，持续6周。为了进行定量分析，使用步态足迹分析和坐骨神经功能指数（SFI）评估脚印，如前所述[29]. 评估完整侧、受伤侧或移植侧的脚趾伸展参数和掌指长度，以计算SFI。

4.12. 电生理研究

在手术后6周，将每只受伤的和T-MSC-SCs移植的小鼠中的4只用于电生理研究。用异氟醚对小鼠进行轻度麻醉，并彻底清除背部和后肢远端的毛发。使用Nicolet VikingQuest（Natus Medical，San Carlos，CA，USA）测定CMAP振幅和运动NCV[30]. 通过在脚背记录坐骨-胫骨运动NCV，首先在脚踝处进行刺激，然后在坐骨切迹处进行刺激。从CMAP的首次发作开始测量潜伏期。最终NCV是通过将踝关节与切口距离的差值除以踝关节和切口潜伏期的差值来确定的。

4.13. 统计分析

这些值表示为平均值±标准偏差或±标准误差（SE）。数据通过单向或双向方差分析（ANOVA）进行分析，并使用GraphPad Prism版本4的统计软件（GraphPad-software，Inc.，San Diego，CA，USA）进行进一步的事后检验。采用Newman–Keuls多重比较试验，通过单因素方差分析，分析NSC34神经突起培养条件之间的结果差异。使用重复测量的双向方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验，确定非损伤、损伤和移植小鼠组之间的任何统计显著性差异。学生的t吨-测试用于分析和比较两组。A类第页<0.05的值被认为在每个实验中都具有统计学意义。