Downregulation of VAPB expression in motor neurons derived from induced pluripotent stem cells of ALS8 patients

doi:10.1093/hmg/ddr284

.2011年9月15日；20(18):3642-52.

doi:10.1093/hmg/ddr284。 Epub 2011年6月17日。

ALS8患者诱导多能干细胞运动神经元VAPB表达下调

米格尔·米特内·内托¹, 马塞拉·马查多·科斯塔, 玛丽亚·C·N·马尔切托, 马里奥·本特森, 克劳迪奥·A·约阿塞罗, 津田浩史, 雨果·贝伦, 赫尔加·C·A·席尔瓦, Acary S B Oliveira公司, 莫尼泽·拉扎尔, 阿利森·R·穆特里, 玛亚娜·扎茨

附属公司

附属

¹加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院儿科/Rady儿童医院圣地亚哥分院，干细胞计划细胞和分子医学部，9500 Gilman Dr，La Jolla，CA 92093，MC 0695，USA。

PMID： 21685205
预防性维修识别码：项目经理1159551
内政部： 10.1093/hmg/ddr284

ALS8患者诱导多能干细胞运动神经元VAPB表达下调

米格尔·米特内·内托等。人类分子遗传学. 2011.

.2011年9月15日；20(18):3642-52.

doi:10.1093/hmg/ddr284。 Epub 2011年6月17日。

作者

米格尔·米特内·内托¹, 马塞拉·马查多·科斯塔, 玛丽亚·C·N·马切托, 马里奥·本特森, 克劳迪奥·A·约阿塞罗, 津田浩史, 雨果·贝伦, 赫尔加·C·A·席尔瓦, Acary S B Oliveira公司, Monize Lazar公司, 阿利森·R·穆特里, 玛雅娜·扎茨

附属

¹加利福尼亚大学圣地亚哥分校医学院儿科/Rady儿童医院圣地亚哥分院，干细胞计划细胞和分子医学系，9500 Gilman Dr，La Jolla，CA 92093，MC 0695，USA。

PMID： 21685205
预防性维修识别码：项目经理1159551
内政部： 10.1093/hmg/ddr284

摘要

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种无法治愈的神经肌肉疾病，会导致生活质量的严重损失和过早死亡。大约10%的病例是遗传性的，ALS8是由VAPB基因突变引起的家族性ALS的常染色体显性形式。VAPB蛋白参与许多细胞过程，除ALS8外，还可能参与其他形式ALS的发病机制。许多在ALS动物模型中成功的药物试验无法转化为人类，这突出表明需要新的方法。诱导多能干细胞（iPSC）技术带来了新的希望，因为它可以用于体外建模和研究疾病。在这里，我们提供了一个基于ALS8-iPSC的额外工具来研究ALS。来自ALS8患者及其非携带者兄弟姐妹的成纤维细胞被成功重组为多能状态并分化为运动神经元。我们首次表明，在ALS8衍生的运动神经元中，VAPB蛋白水平降低，但与过度表达系统相比，无法鉴定细胞质聚集体。我们的结果表明，最佳VAPB水平可能在ALS8的发病机制中起着核心作用，这与在散发性ALS中观察到的VAPB减少相一致。

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数字

**图1。**
对照组和ALS8患者iPSC的生成和表征。(A类)两个研究的ALS8家族的遗传图谱。ALS8患者用黑色符号表示，非患者用白色符号表示。从家族1的两名受影响和两名对照个体中收集皮肤活检（*）；家系2的一名对照组和两名受影响个体。(B类)相位对比显示，感染后1周，iPSC集落在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞中生长。(C)与人胚胎干细胞形态相似的分离iPSC集落。(D类)无饲料条件下的iPSC菌落。(E类)已建立的人类iPSC群体的代表性图像，具有明确的边界和紧凑的细胞。棒材=100µm。ALS8-iPSC(F类和**G公司**)和WT-iPSC(**H（H）**和我)染色，显示多功能标记的表达。棒材=20µm。衍生iPSC克隆能够在裸鼠体内产生畸胎瘤。可以识别出三个胚层的组织，如箭头所示：中胚层：软骨(J型)和肌肉(**L（左）**); 内胚层：肠样上皮(**K（K）**); 外胚层：神经玫瑰花结(**M（M）**). 棒材=200µm。ALS8-的核型(N个)和WT iPSC(**O（运行）**)染色体数目正常。

**图2。**
人类细胞中的VAPB。(A类)在HEK293T细胞中过度表达WT和P56S形式的VAPB。本实验中的对照是未转染的HEK293T细胞。虽然WT型在细胞核周围呈较高强度的细胞质分布，但突变蛋白的过表达主要以细胞质聚集体的形式存在。棒材=70µm。插图：HEK293T细胞上P56S-VAPB过度表达产生的细胞质内含物细节。(B类)VAPB在表达多能性标记Nanog的WT和ALS8-iPSC上显示核周染色。棒=50µm。(C)hESCs也表达VAPB。

**图3。**
运动神经元分化。(A类)运动神经元祖细胞Islet-1标记物在作为EB分化4周后的神经外胚层细胞中的表达。棒材=12µm。(B类)成熟的EB切片显示出强大的神经元分化，表现为存在表达有丝分裂后神经元标记物Map2的细胞。棒材=10µm。(C)表达成熟神经元标记物Map2的细胞也在细胞核中表达TDP-43（插图）。棒材=20µm。(D类)运动神经元样细胞表达GFP的实时图像*血红蛋白9*启动子。棒材=100µm。(E类)控制和(F类)当与C2C12成肌细胞共同培养时，ALS8-iPSC衍生的运动神经元可以在神经肌肉接头处结合α-银环蛇毒素。(**G公司**)核周VAPB在GFP阳性运动神经元上的分布来自一个对照iPSC克隆和(**H（H）**)来自ALS8。棒材=20µm。

**图4。**
MG132处理后VAPB染色。(A类)MG132处理的成纤维细胞增加了泛素点状染色的数量（箭头所示）。棒材=25µm。(B类)VAPB的核周分布在对照和ALS8来源的iPSC之间相似*血红蛋白9*：：MG132治疗后GFP运动神经元。棒材=10µm。(C)二甲基亚砜或MG132处理后VAPB蛋白稳定性的western blot代表性数据。MG132泳道中较高的泛素染色显示蛋白酶体受到抑制。(D类)图表显示了两名个体对照组和两个家族的两名ALS8患者治疗后VAPB蛋白量的平均值。

**图5。**
ALS8衍生运动神经元VAPB蛋白水平降低。(A类和B类)与对照组（Con）相比，ALS8样品上iPSC线路上的VAPB水平降低。(C)ALS8细胞分化过程中VAPB水平降低。(D类)VAPB在对照的运动神经元分化过程中增加，但在ALS8 iPSC中没有增加。n个=3个独立实验。

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