本文中提到：

介绍

使用茎进行了许多研究细胞治疗肌肉相关疾病，其中肌肉组织的组织受到先天性的不利影响遗传性肌肉缺陷、肌肉质量损失、创伤或肿瘤移除(1——5)。以前的研究报告称肌干细胞衍生成肌细胞或肌原细胞移植肌肉损伤模型中的细胞(6——8).然而，研究人员面临的主要问题是很难获得所需数量的电池移植到因培养期而受伤的部位产生肌肉干细胞所必需的。几个小组已经报道了胚胎干细胞的分化和诱导多能干细胞分化为肌源性细胞(4,9,10).然而，ES和iPS细胞，包括畸胎瘤的形成和对通过免疫系统移植细胞。与这些细胞相比，间充质干细胞（MSCs），具有调节免疫系统不会形成畸胎瘤，可以从各种来源，包括骨髓(11)，脂肪组织(12)、脐带血(13)，羊水(14)，胎盘(15)、牙髓(16)扁桃体(17)和尿液(1)。由于这些原因，MSC被认为是有价值的细胞来源，可用于根据以下协议繁殖肌原细胞区别。几项研究检查了骨髓间充质干细胞转化成肌源性细胞已有报道使用MSCs衍生脂肪组织、骨髓、胎盘、羊水、，脐带血和尿液(1,2,11——14,18).

扁桃体是一种新发现的间充质干细胞来源可能有潜在的治疗应用。扁桃体衍生MSCs（T-MSCs）容易分化为中胚层细胞血统，包括脂肪、软骨和骨细胞，并转化为内胚层谱系，包括肝细胞(19——21)。T-MSC也表现出类似的情况骨髓源性MSCs的免疫抑制特性脂肪组织衍生MSCs(22,23)。扁桃体组织被丢弃手术后，从这些废弃的干细胞中分离出干细胞组织也是回收人体组织用于茎的宝贵手段细胞疗法(23,24).

骨骼肌（SKM）具有生长能力以应对工作量增加或在案件中自行修复受伤。肌肉的出生后生长、修复和维持纤维依赖于一群肌肉干细胞(25)位于基底下方肌肉纤维膜。然而，大面积肌肉损伤可能防止完全再生，特别是在功能方面恢复。与健康丧失相关的严重病变肌肉组织和纤维瘢痕组织的发育长期外周血导致不可逆性肌萎缩神经损伤就是再生的例子有限的(5)。作为替代方案损坏SKM的再生方法某些创伤或退行性疾病的最佳治疗疾病(26)，的移植T-MSC源性肌细胞是一种合适的方法限制受累肌肉萎缩的方法甚至导致心肌细胞再生，减少运动障碍。

在本研究中，我们证明T-MSCs可能分化为肌细胞在体外而且那个人成肌细胞和肌细胞的移植T-MSCs介导损伤后肌肉功能的恢复体内.免疫细胞化学，反向转录聚合酶链反应（RT-PCR）和western blot分析证实了T-MSC衍生肌细胞的发育在体外此外就地移植右侧腓肠肌部分切除小鼠的T-MSCs肌肉，导致肌肉功能增强，如步态所示评估（足迹分析）。这些结果表明，人类扁桃体是一种有希望的干细胞来源，而T-MSCs可能是用于促进SKM损伤后的再生。

材料和方法

道德声明

Ewha女性机构审查委员会韩国首尔大学九龙医院批准了本研究中使用的实验程序（批准号：。ECT-11-53-02）。每个人都获得了知情的书面同意患者和/或其法律代表在获得组织样本。动物护理和实验程序由Ewha机构动物护理和使用委员会批准女子大学医学院（ESM编号14-0285）以及所有实验是按照批准的指南进行的和法规，即韩国健康与福利，Ewha女性动物护理指南大学医学院和国家研究委员会（美国）实验动物护理和使用指南(27).

动物

七周龄雄性C57BL/6小鼠（n=40；体重，21–24克；韩国Eumseong Dae-Han Biolink Co，Ltd），温度为21±2°C在12小时光/暗循环下，湿度为55±5%，并配有食物和水随意用于所有实验。给小鼠喂食高压灭菌食物，并提供水随意.所有小鼠均按照上述指南。至少10只年龄匹配的小鼠用于每组。这些动物被一氧化碳杀死2吸入。

T-MSCs的分离

从扁桃体组织中分离出T-MSCs如前所述执行(17,28)。简而言之，扁桃体组织扁桃体切除术期间收集的患者，随后在Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）中切碎并消化含有210 U/ml I型胶原酶（均来自Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）和DNA酶（10µg/ml，Sigma-Aldrich，St。路易斯，密苏里州，美国）。细胞通过细胞后过滤器（BD Biosciences，San Jose，CA，USA），单核细胞由Ficoll-Paque（GE Healthcare，Chalfont St.Giles，英国）密度梯度离心。细胞培养4837°C时，在含有10%胎牛血清的低血糖DMEM中放置h（FBS；Invitrogen）和1%青霉素/链霉素（Sigma-Aldrich）含5%CO的加湿室2。接下来是去除非粘附细胞并在新鲜培养基。这些新培养的细胞扩增了3-5倍这一过程耗时约4周。

成脂、成骨和成软骨T-MSCs的分化

诱导T-MSCs中胚层分化如前所述(17)经过小的修改。简言之，诱导脂肪生成分化后，将T-MSCs培养在市面上可买到的成脂培养基（Invitrogen）3周。随后，单元格用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗两次，固定在4%多聚甲醛（PFA）在室温下放置15分钟，然后清洗用PBS和2%油红O（Sigma-Aldrich）染色1小时室温。再次用PBS清洗T-MSC细胞内脂滴在显微镜下可见（IX2-SLP；日本东京奥林巴斯）。为了量化脂质积累，用100%异丙醇洗脱沉积在细胞中的油红O持续10分钟，测量洗脱液的吸光度使用ELISA微孔板阅读器在540 nm波长下（BN03269，VersaMax；Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞）。

为了诱导成骨分化，T-MSCs在市售成骨培养基中培养（Invitrogen）治疗3周。之后，将细胞清洗两次带PBS，室温下在4%PFA中固定15分钟用2%茜素红S（Sigma-Aldrich）染色1小时后用细胞外基质PBS再冲洗细胞2次钙化在相控显微镜下可见（IX2-SLP；奥林巴斯）。为了量化钙沉积，细胞被与10%氯化十六烷基吡啶孵育10分钟以提取茜素红S。收集洗脱液并测定吸光度使用ELISA微孔板读取器在570nm的波长下测量（BN03269，VersaMax；分子器件）。

为了诱导软骨分化，T-MSCs在市售中刺激了3周软骨生成诱导培养基（Invitrogen）。此后，细胞用PBS冲洗，并在室内用4%PFA固定15分钟温度。清洗后，细胞用1%Alcian染色蓝色（Sigma-Aldrich）在室温下保持1小时，过量染料被去除了。随后，用0.1再次冲洗细胞N HCl，软骨生成细胞在相控显微镜（IX2-SLP；奥林巴斯）。为了量化Alcian蓝染色强度，细胞被溶解400µ1%十二烷基硫酸钠。在波长下读取吸光度605纳米。

肌源性分化

诱导肌源性分化T-MSCs，3–4×106细胞被放置在15厘米的培养皿中在补充有10%FBS的低血糖DMEM中。在1-3天时细胞自发聚集形成球体50–100µm英寸直径。球体形成后，介质被替换为补充DMEM/营养混合物F-12（DMEM/F-12；Invitrogen）转化生长因子-β（TGF-β；R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州，美国），非必需氨基酸（NEAA；Invitrogen）和胰岛素-转铁蛋白-硒（ITS；Gibco Life Technologies，再延长4天，以便允许分化为成肌细胞。T-MSC从球体中成长当被转移到上述胶原蛋白涂层的盘子中时成肌细胞分化培养基中，形成玫瑰花瓣样扩散。为了诱导终末分化为肌细胞，成肌细胞在成肌诱导培养基中培养2周由含10 ng/ml类胰岛素的低血糖DMEM组成生长因子1（IGF1；研发系统）和2%FBS(图2D).

图2 肌源性分化示意图来自人扁桃体来源的间充质干细胞（T-MSCs）。（A） 未分化的T-MSCs被诱导形成（B）球在皮氏培养皿上直径约为50–100µm。（C） T-MSC在转移到胶原蛋白涂层培养皿在替换培养基中形成玫瑰状蔓延。（D） 将接种的细胞培养2周在成肌诱导培养基中，其形态发生改变；他们相互融合以产生新生的肌管。原始放大倍数，×40。lgDMEM，低血糖DMEM；美国国家航空航天局，非必需氨基酸；ITS，胰岛素-转铁蛋白-硒。

逆转录聚合酶链反应

使用RNeasy迷你套件（美国马里兰州日耳曼镇齐根）。互补DNA使用SuperScript II（Invitrogen）和oligo-（dT）20引物在42°C下培养1小时，然后在72°C下孵育持续15分钟。使用预混试剂盒（韩国大田Bioneer）条件：95°C初始变性5分钟，然后35分钟在95°C下变性30秒，在45–60°C下退火45秒，72°C下延伸44秒产品在1.5%琼脂糖凝胶上分离，并通过溴化乙锭染色。前进和后退的顺序使用的引物如下：Krüppel-like factor 4(Klf4公司)正向，5′-CCCGATCAGATGCAGCCAGACAGTC-3′和反向，5′-ctgctgggctcctcctcatcg-3′；雷克斯1向前，5′-CAGATCCTAAACAGCTCGCA-3′和背面，5′-GCGTAGCAAATTAAAGCC-3′；激活素正向，5′-AGAGCGACCTCACAGCCGTGCGG-3′和反向，5′-CCGAGGTAGGCCGTTGACCGACCT-3′；配对框7(第7页)正向，5′-CACTGTGACCGAAGCACTGT-3′和反向，5′-GTCAGTTCCACAT-3′；肌生成因子6(我的6)正向，5′-AGGAACCCACGAAAAGT-3′和反向，5′-TTGAAACATGGCACAAAAAGA-3′；肌生成素向前，5′-GTCTCGCCGGGCATCCTTG-3′和背面，5′-GAGCTGGGCATACACGGGG-3′；肌营养不良蛋白向前，5′-ACCACCTCTGACCCTACACG-3′和背面，5′-GCAATGTCCTCAGCAA-3′；和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）正向，5′-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3′和反向，5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

免疫细胞化学

盖玻片上生长的细胞固定在4%（v/v）PFA（Sigma-Aldrich）在室温下15分钟或在室温下过夜4°C。在PBS中漂洗后，将固定的细胞透化用2%牛血清白蛋白阻断非特异性表位（博沃根生物制品公司，澳大利亚维多利亚州东凯勒），0.1%吐温-20/PBS，然后在稀释的初级培养基中培养抗体在室温下1小时或在4°C下过夜。以下在PBS中清洗3次，样品在室内培养1小时二级抗体在PBS中稀释的温度。制备的然后使用Vectashield安装介质安装样品含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；载体美国加利福尼亚州伯灵盖姆实验室）和图像是在荧光显微镜（Nikon Corp.，日本东京）。这个抗体的制造商和目录号（分类号）使用的药物如下：小鼠抗CD34（分类号SC-74499；SantaCruz Biotechnology，Inc.，美国德克萨斯州达拉斯），兔抗Pax7（Cat。编号：ab187339；英国剑桥Abcam），小鼠抗结蛋白（分类号：。D1033；Sigma-Aldrich），兔抗肌营养不良蛋白（分类号ab15277；Abcam），小鼠抗肌球蛋白重链（MHC，目录号MAB4470；研发系统），兔抗α-肌动蛋白（分类号PA5-17308；ThermoFisher Scientific，Scoresby，VIC，澳大利亚），兔抗肿瘤素I型1（TNNI1；分类号NBP1-90923；Novus Biologicals，利特尔顿，CO，美国），小鼠抗肌生成素（类别号ab1835；Abcam）（初级抗体）和四甲基罗丹明（TRITC）偶联Alexa-568山羊抗鼠IgG（分类号A-11031），异硫氰酸荧光素（FITC）-缀合的Alexa-568山羊抗小鼠IgG（目录号A-11004），和TRITC结合的Alexa-568山羊抗兔IgG（分类号。A-11011）（均来自Life Technologies）（二级抗体）。

蛋白质印迹分析

蛋白质浓度使用Bradford分析试剂（美国加利福尼亚州Hercules生物实验室）在Pro-Prep缓冲液（iNtRON生物技术，韩国Seongnam）补充磷酸酶抑制剂鸡尾酒解决方案（Dawinbio，Hanam，韩国）。细胞用冰镇PBS并暴露于补充有磷酸酶抑制剂鸡尾酒溶液在冰上放置30分钟。通过12000×g离心去除不溶物质4°C下10分钟。蛋白质（30–80µg） 被隔开了7.5–13.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到聚偏氟乙烯或硝化纤维素上膜（Millipore，Billerica，MA，USA）。这些膜是用含0.1%的Tris缓冲盐水中的5%脱脂牛奶封住吐温-20（TBST）在室温下放置2小时。这些污点当时是在4°C下与一级抗体孵育过夜。抗体用于蛋白质印迹分析的是兔抗α-肌动蛋白（Cat.no。PA5-17308）（均来自赛默飞世尔科技公司），小鼠抗结蛋白（目录号D1033）和小鼠抗α-SMA（目录号A2547）（均来自Sigma-Aldrich），兔抗TNNI1（分类号NBP1-90923；Novus生物制品）和小鼠抗肌生成素（类别号ab1835；Abcam）。这个用TBST清洗斑点3次5分钟，然后培养用辣根过氧化物酶标记的二级抗体在室温。山羊抗鼠IgG（1:2500，分类号SC-2005；Santa Cruz Biotechnology）和山羊抗兔IgG（1:2500，Cat。编号7074；使用Cell Signaling Technology，Beverley，MA，USA）作为次级抗体。经过额外清洗后，信号使用WESTSAVE Gold western印迹检测试剂盒（Young InFrontier有限公司，韩国首尔）。蛋白质信号是通过将膜暴露在发光图像中进行可视化分析仪（LAS-3000；日本东京富士胶片公司）。的级别每种蛋白的表达均归一化为GAPDH的表达（Sigma-Aldrich）。使用ImageJ软件对结果进行量化（1.48 V；Wayne Rasband，NIH，美国）。

骨髓间充质干细胞的小鼠移植

手术是在一般情况下进行的使用舒泰50混合物进行麻醉（法国卡罗斯，维巴克）和Rompun（拜耳韩国、首尔、韩国），比例为3:1，腹腔注射1 ml/kg。建立模型肌切除术，我们切除了0.5×1.0cm的部分（40–60mg）为了制造缺陷，如前所述(5)。这个是通过撕裂右侧肌肉的外侧来完成的用9号手术刀。诱导肌肉48小时后受伤，1×106PBS中的T-MSCs/T-MSC衍生心肌细胞（100µl个）或单独PBS（100µl、 用作车辆）肌肉注射到受损部位的中点腓肠肌。PBS处理的小鼠作为车辆处理组（车辆）。一组正常（未受伤）小鼠也用作控件。共有5组，其中8组小鼠/组：正常组、损伤组、车辆治疗组、T-MSC注射组和T-MSC-myocyte注射组。为了在48小时、7天、，移植后4周和8周。

免疫组织化学

对于免疫组织化学，小鼠腓肠肌肌肉被固定在10%的甲醛中。大约24小时后在4°C下固定h后，在室内PBS中清洗肌肉温度。清洗后的肌肉在分级乙醇中脱水系列，在二甲苯中清除，并嵌入石蜡中。街区被切成5块-µm厚系列截面。这个将切片组织置于显微镜载玻片上。非特定在0.1%Triton®声波风廓线仪中使用3%牛血清白蛋白阻断表位X-100/PBS，然后用适当的初级培养基培养抗体在室温下持续1h。在0.1%的条件下进行3次洗涤Triton X-100/PBS，样品与次级抗体在室温或4°C下放置1小时过夜。这个使用含DAPI（Vector Laboratories）和图像是在荧光显微镜（尼康公司）。制造商和所用抗体的目录编号如下：兔子抗肌营养不良蛋白（分类号ab15277；Abcam）、小鼠抗α-SMA（分类号。编号：A2547；Sigma-Aldrich）、兔抗TNNI1（目录号NBP1-90923；Novus Biologicals）（初级抗体），Alexa-568山羊抗小鼠IgG（分类号A-11031）和Alexa-568山羊抗兔IgG。编号A-11057）（均来自Life Technologies）（次要抗体）。

脚印步态评估分析

每只老鼠的每只后脚的底部涂上无毒墨水，老鼠可以行走穿过白纸上的小隧道。步幅长度（距离如前所述测量两个后爪印之间）(29,30)之后1、2、3、4和8周移植。正常小鼠的步长，受伤组、车辆治疗组和T-MSC-myocyte移植组然后使用未配对的邓肯测试进行比较。

形态学评估再生

获得了损伤组小鼠腓肠肌和移植组使用相机（Galaxy Note 2 SHV-E250S摄像机；三星、首尔、韩国）并存储为800万像素背光传感器。评估标准形态再生是指伤口充满了肌肉。

统计分析

结果以平均值±标准表示平均误差（SEM）。进行了统计比较使用Duncan的测试和GraphPad Prism软件5.01软件公司（美国加利福尼亚州圣地亚哥）组间差异。考虑到P值<0.01–0.05以显示统计上的显著差异。所有的实验至少进行了3次。

结果

来源于T-MSCs的肌源性细胞

此前有报道称，T-MSC拥有MSC的特点(17,21)。在我们的研究中，发现T-MSCs分化为3种不同的细胞类型，即脂肪细胞，骨细胞和软骨细胞(图。1)。为了诱导肌源性分化，T-MSCs(图2A)被允许形成球体约50–100µ培养皿上直径为m(图2B)。T-MSC从再植时将球体转移到胶原蛋白涂层的培养皿中介质，形成玫瑰花状排列(图2C)。培养被镀细胞持续2周，以便最终分化为心肌细胞(图2D)。培养单元格在体外在低血糖DMEM中持续2周含有10 ng/ml IGF1和2%FBS改变了成肌细胞；他们相互融合产生新生肌管(图2D).在每个步骤中对4张幻灯片进行定量分析在肌源性分化过程中，Pax7和分别计数α-肌动蛋白阳性细胞。

图1 分化的建立扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）向中胚层谱系。T-MSCs容易分化为（A）脂肪细胞、（B）成骨细胞和（C）软骨细胞，由油红O、茜素红S染色和阿尔西安蓝，分别是。

T-MSCs表达肌肉相关基因诱导肌源性分化的条件

我们进行了RT-PCR以确定T-MSC是否能够表达肌源性标记并经历肌源性区别在体外肌肉发生伴随着诱导肌源性标记物，包括肌生成素和肌营养不良蛋白，以牺牲多能性耦合基因为代价(31——33)表明T-MSC分化为肌细胞。特别是，我们发现第7页和我的6在肌生成中起作用通过调节肌肉前体细胞增殖(34)，已在中表达未分化T-MSC(图。3A级)。这些结果表明T-MSCs具有以下特征肌源性前体细胞。多能者mRNA表达水平标记，即Klf4、Rex1、和激活素是未分化T-MSCs和成肌细胞上调具有比肌源性细胞更强的增殖能力。西部印迹分析显示结蛋白和α-SMA的表达水平较高分化阶段(图。3B公司; 车道b和c）。α-肌动蛋白的表达在分化的所有阶段(图。3B公司)。骨骼肌生成标记物TNNI1和肌生成素在成肌细胞和肌细胞中相似(图3B; 车道b和c）。符合这些结果，多核结构的免疫染色显示存在结蛋白、α-肌动蛋白、TNNI1和肌生成素(图4)。这些结果表明T-MSCs具有肌源性前体细胞的特性并且具有很强的肌生成能力区别。

图3 肌源性标记物的检测扁桃体源性间充质干细胞（T-MSC）源性肌源性细胞。（A） mRNA表达水平的测定多能性和肌源性标记物。mRNA是从（lane a）中分离出来的未分化的T-MSC，（泳道b）培养的T-MSC衍生的成肌细胞以玫瑰花状扩展球的形式在替换介质中，以及（车道c）终末分化的T-MSC衍生心肌细胞和经RT-PCR检测。（B） 肌源性的蛋白质表达水平肌源性诱导过程中T-MSCs的标记物（通道a，T-MSCs；b巷，T-MSC衍生成肌细胞；车道c，T-MSC衍生肌细胞）。GAPDH的水平作为负荷对照进行测量。使用ImageJ软件量化带强度。数据包括一式三份实验的平均值±SEM。*P<0.05**P<0.01。Klf4，类似Krüppel因子4；Pax7，配对框7；Myf6，肌生成因子6；α-SMA，α-平滑肌肌动蛋白；TNNI1，肌钙蛋白I 1型；GAPDH、，3-磷酸甘油醛脱氢酶。

图4 免疫细胞化学检测肌源性标记物。肌肉相关蛋白的表达扁桃体来源的间充质干细胞（T-MSCs）成肌诱导过程（T-MSCs；T-MSC-derived myoblasts；T-MSC衍生心肌细胞）通过免疫染色进行评估肌源性卫星细胞抗体（a组，CD34；红色），前体[面板b，成对方框7（Pax7）；绿色]，差异化肌原细胞[面板c，结蛋白（红色）；面板d，肌营养不良蛋白（绿色）；小组e，肌球蛋白重链（MHC；红色）]，骨骼肌生成细胞[面板f，α-肌动蛋白（绿色）；面板g，肌钙蛋白I 1型（TNNI1；绿色）；面板h，肌生成素（红色）]。细胞被复染带DAPI（蓝色）。样品在荧光下进行分析使用适当的过滤器进行显微镜检查。（A） 未分化T-MSC表达（a组）CD34和（b组）Pax7，但没有其他标记物肌源性细胞。（B） 分化成成肌细胞后，80-90%的细胞表达（c组）结蛋白，（d组）肌营养不良蛋白，和（小组e）MHC和20-50%的细胞表达骨骼肌（SKM）标记包括（面板f）α-肌动蛋白，（面板g）TNNI1，和（面板h）肌生成素。（图a）CD34和（图b）Pax7没有在分化过程的任何阶段表达T-MSC衍生的成肌细胞转化为T-MSC派生的心肌细胞。（C）T-MSC衍生的心肌细胞表达增加（面板c至h）肌源性和SKM细胞标记物与T-MSC衍生的成肌细胞并形成多核肌管。FITC，荧光素异硫氰酸盐；TRITC，四甲基罗丹明异硫氰酸盐。原始放大倍数，×200。

肌源性标记物的检测体外免疫染色

为了确定球和T-MSC，并测量MSCs分化为SKM细胞，我们将球体移植到盖玻片，以便分化为成肌细胞和骨骼肌成肌细胞及其在成肌细胞中的顺序培养分化培养基(图2).然后固定这些细胞并用抗体标记肌源性卫星细胞的标志物（CD34）、前体（Pax7），分化成肌细胞（结蛋白、肌营养不良蛋白和MHC）和骨骼肌成肌细胞（α-肌动蛋白、TNNI1和肌生成素）。尽管CD34（红色）和Pax7（绿色）在未分化的T-MSC公司(图4A，面板a和b），肌源性细胞和骨骼肌细胞的标记物均不存在。这些结果表明，T-MSCs具有预先存在的肌源性特点。分化成成肌细胞后，80-90%细胞表达结蛋白（红色）、肌营养不良蛋白（绿色）和MHC（红色）(图4B、面板c至e和图5)和20-50%的细胞表达的SKM标记物[（α-肌动蛋白（绿色）、TNNI1（绿色）和肌生成素（红色）](图4B，面板f到h和图5)。相比之下，肌源性卫星细胞和前体细胞标记物CD34和Pax7在分化过程中不表达T-MSC衍生成肌细胞转化为T-MSC派生肌细胞(图4B和C面板a和b）。此外，T-MSC衍生的心肌细胞表现出增加肌源性和SKM标记的表达与T-MSC衍生的成肌细胞或未分化的T-MSC(图4A-C，面板c至h）。

图5 免疫荧光定量染色证实在成肌过程中分化，肌源性标记的表达，表明T-MSCs形成成肌细胞的分化潜能。数据包括平均值±SEM。对于每个条件，使用4张幻灯片量化。图表示来自3个独立实验。

肌原性内发生的变化体外分化过程中的细胞群体

证明T-MSCs在骨骼方面的潜力肌源性分化，Pax7的数量+和α-辅肌动蛋白+每个阶段的细胞数微分过程(图6).Pax7的比例+肌原细胞间的细胞分化前卫星细胞和前体细胞占39.9%，而Pax7的比例+其中的单元格T-MSC衍生的成肌细胞和肌细胞<1%(图6A和B)。此外，百分比含有SKM结构蛋白的细胞，α-辅肌动蛋白+成肌细胞中分别为5.2和34.5%心肌细胞。然而α-辅肌动蛋白+未分化T-MSCs中的细胞为<1%(图6A和B).

图6 肌源性细胞的衍生人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）。（A） 成肌蛋白在骨髓间充质干细胞增殖过程中的表达通过免疫染色评价肌原性诱导抗配对盒蛋白7（Pax7；绿色）或α-肌动蛋白的抗体（绿色）。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染。这个使用荧光显微镜对样品进行分析适当的过滤器。（B） 免疫荧光定量证实在肌源性分化过程中Pax7和α-肌动蛋白的表达减少或增加，分别表明T-MSCs向形成肌细胞。数据为平均值±SEM。对于每种情况，4幻灯片用于量化。图表示平均值三个独立实验的多次测试，*P＜0.05。异硫氰酸荧光素。原件放大倍数，×200。

T-MSC参与SKM再生活泼地

我们分析了T-MSC植入对为了评估小鼠2天内受损肌肉的再生，移植后1周、4周和8周。肌肉受伤小鼠和PBS注射（车用治疗）对照小鼠在2天到4周时，α-SMA（绿色）没有表达(图7A、B、E、F、I和J);然而，α-SMA在8周时表达水平较低(图7M和N)移植后。A类1–8周时，在肌肉中观察到α-SMA的高表达注射T-MSC衍生心肌细胞的小鼠(图7H、L和P)，而表达式4-8周时，T-MSC注射肌肉中α-SMA的含量较低(图7K和O)移植后。肌营养不良蛋白表达最低（红色）在受伤小鼠和治疗车辆的肌肉中老鼠(图7A、B、E、F、I、J、M和N个)而肌营养不良蛋白的表达早在2移植后第天在小鼠肌肉中注射T-MSCs和T-MSC衍生心肌细胞(图7C、D、G、H、L、O和P)。肌萎缩蛋白是一种位于肌膜之间的蛋白质，支持肌肉纤维强度和肌营养不良蛋白的缺乏会减少肌肉刚度，刚度(35)。这些结果证明T-MSC衍生的心肌细胞增强了产生新形成的肌纤维，表达α-SMA和移植后1周的肌营养不良蛋白。此外人SKM肌钙蛋白基因TNNI1（红色）的表达是移植后随着再生增加过程(图8C、D、G、H、K、L、O和P)。特别是，TNNI1的染色更强烈用T-MSC衍生的心肌细胞移植后观察到与T-MSC(图8D、H、L和对)。与α-SMA和肌营养不良蛋白类似，TNNI1的表达量最小在受伤者和接受车辆治疗者的肌肉中表达老鼠(图8A、B、E、F、I、J、M和N个).

图7 人类的再生潜力扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）移植到切除脊髓的C57BL/6小鼠。肌肉受伤48小时后，注射T-MSCs或T-MSC衍生肌细胞肌肉注射到损伤部位的中点腓肠肌。DAPI染色（蓝色），α免疫染色平滑肌肌动蛋白（α-SMA；绿色）、肌营养不良蛋白（红色）；对于α光滑肌肉肌动蛋白（α-SMA；绿色）、肌营养不良蛋白（红色）；黄色-范围颜色表示α-SMA和肌营养不良蛋白的合并图像。原始放大倍数，×400。

图8 骨骼肌（SKM）再生人扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSCs）移植成肌细胞切除的C57BL/6小鼠。肌肉损伤后，T-MSCs或肌肉注射T-MSC衍生肌源性细胞分别在第2天和第1、4和8周获取活检标本移植后。SKM再生的代表性图片显示肌钙蛋白I 1型（TNNI1；红色）和DAPI（蓝色）染色受伤车辆治疗小鼠的组织切片（溶媒）和T-MSC-和T-MSC肌细胞注射组。原件放大倍数，×400。

减少运动障碍T-MSC衍生心肌细胞移植于患有急性心肌梗死的小鼠腓肠肌部分切除术

确定是否植入T-MSC衍生成肌细胞或肌细胞改善肌肉功能受伤后，我们测量了随后小鼠的步长右腓肠肌部分切除术T-MSC衍生的肌源性细胞移植。步态评估为通过足迹分析进行，如材料中所述以及移植后1、2、3、4和8周的方法(图9)。跨距在受伤和注射PBS后明显减少骨髓切除术后1周的（车辆治疗）小鼠。步伐注射T-MSC衍生心肌细胞的小鼠的长度为移植后2、3、4和8周显著增加（P<0.01）。没有这样的步幅改善在受伤/车辆治疗的动物中观察到。这些结果表明T-MSC衍生肌源性细胞的植入通过部分切除骨髓提高小鼠的功能能力右腓肠肌。

图9 通过足迹评估步态分析。（A） 显示了足迹分析中测量的参数，用虚线表示前进的方向。正常（n=8）和受伤（n=6）、假手术（n=9）和肌细胞注射小鼠（n=8）在第1、2、3、4和8周时进行评估移植后测量步长（cm）。（B）直方图表示正常人、，受伤小鼠、车辆治疗小鼠以及注射T-MSC衍生的肌细胞。图表示倍数的平均值来自三个独立实验的测试，*P<0.05，**P<0.01。TP，移植。

通过植入T-MSC衍生肌源细胞

我们分析了T-MSC移植对小鼠的影响以确定它是否引发移植术后10周损伤的右侧肌肉。这个受伤小鼠和车辆治疗小鼠的肌肉(图10B和C)显示的迹象10周时受伤，而1周时损伤严重受伤的老鼠(图10A)。由相比之下，植入小鼠没有明显的损伤迹象(图10D–F)10周时移植后。独特的腓肠肌形状T-MSC注射小鼠的肌肉质量恢复(图10D); 的步长由于未增强T-MSC注射小鼠的免疫染色中的再生。这些形状的变化腓肠肌证实了免疫染色结果以及步态评估分析，证明T-MSC来源的肌源性细胞促进SKM的再生。

图10 腓肠肌的形态学小鼠肌肉。肌肉的形状随之改变植入。照片显示受伤小鼠的肌肉（A） 移植后1周和（B）10周。照片显示（C）车辆处理小鼠的肌肉，（D）扁桃体衍生间充质干细胞（T-MSC）注射小鼠（E）T-MSC衍生成肌细胞注射小鼠和（F）T-MSC派生成肌细胞移植后10周肌瘤注射小鼠。

讨论

来自老年人的成人干细胞增殖、迁移和分泌细胞因子或生长因子比来自年轻个体的干细胞(18,36)。因此，有必要从其他来源获得细胞，如扁桃体从年轻人身上移除，随后丢弃的。最近的研究也表明，T-MSCs没有只容易分化为中胚层组织细胞，包括脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞(17,21)也能进入肝细胞(20)、内皮细胞(24)和皮肤成纤维细胞(37)。T-MSCs可能分化为细胞在所有3个胚层中，即内胚层、中胚层和外胚层。在本研究中，我们证明未分化的T-MSCs具有肌卫星细胞的先存特征与高分化为骨骼肌细胞的能力。对于这些原因，我们认为T-MSCs是一种更合适的细胞来源与其他类型的MSC。

TGF-β深刻影响间充质来源的多种细胞类型，包括前脂肪细胞(38,39)，成骨细胞(40)和成肌细胞(41)。在以前关于培养的研究中成肌细胞TGF-β抑制肌肉特异性基因，以及无肌管形成影响细胞增殖(42,43)。由于这些发现研究中，仅向培养基中添加1 ng/ml TGF-β，以便诱导细胞分化为成肌细胞(图2C)。脊椎动物时期胚胎发生，中胚层祖细胞产生不同的间充质谱系，包括骨骼肌细胞、骨细胞、，软骨细胞和脂肪细胞。承诺及后续MSC向特定谱系的分化受到调控通过几个细胞外信号的协同作用例如IGF1，由脂肪细胞和肌细胞共享可以促进一种或另一种细胞类型的产生(44)。胰岛素也可能与IGF1结合受体和IGF1可能与胰岛素受体结合；此外，SKM中存在IGF1/胰岛素杂交受体。然而，胰岛素在葡萄糖稳态中尤其重要，而IGF1主要参与肌肉生长(45)。IGF1的系统管理导致肌肉蛋白质含量增加和蛋白质减少退化，退化(46)。这个IGF1对肌成纤维细胞增殖的刺激作用细胞外基质的沉积可能会干扰这种生长因子即使在高浓度下也能促进肌肉损伤后的愈合(47)。在本研究中，10 ng/ml的IGF1为用于肌原诱导培养基中，以诱导终末肌源性分化(图。二维).

为了诱导T-MSCs向肌源性分化，分化程序的两个步骤，分化为成肌细胞和肌细胞被用于不同的培养基，分别是。肌生成标记物的表达，如肌生成素，肌营养不良蛋白、α-肌动蛋白和TNNI1表明培养物中T-MSC的比例致力于肌源分化途径。T-MSC衍生成肌细胞融合形成部分肌管在体外作为T-MSC衍生品之前均显示表达肌源性标记（作为成肌细胞）在将其并入肌管后，我们假设肌管内外均存在感应信号。在此外，当这些细胞被移植时，它们支持肌肉发生的完整过程，允许肌纤维。移植后，只有一小部分T-MSC衍生物表达人类特异性标记物，如人类细胞核（HN；数据未显示）。缺少HN的原因大多数T-MSC衍生物中的表达仍然存在不清楚的。

检查肌肉再生过程以可控和可复制的方式，有必要开发一种肌肉损伤的实验模型(26)。使用各种损伤的实验模型，包括肌毒性注射代理人(9)，挤压伤(48)，缺血(12)，失神经(49)和肌肉营养不良(13)，展示了SKM的再生能力，与精确方法无关用来诱发最初的伤害(50)。在本研究中，我们进行了手术切除骨髓以建立新型SKM损伤小鼠模型以模拟严重的肌肉萎缩。

本研究证明，T-MSC衍生肌原细胞能够修复受损的SKM组织再生肌肉。缺陷已修复或逐渐发生重塑，因此原始缺陷区域移植后10周难以确定。然而，在移植了T-MSC衍生细胞(图10D–F)移植后10周。在另一项研究中，使用MyoD转导的人羊水干细胞移植到小鼠受伤的胫骨前肌肌肉组织面积比受伤者大未经治疗的小鼠或PBS注射的对照小鼠(14)。此外，Merritt等(51)证明了支持肌肉和血管的肌肉细胞外基质再生；但是，功能没有完全恢复42天后(51)。在我们的研究表明，T-MSC衍生的移植肌源性细胞促进受损SKM的再生。然而，需要进一步研究以确定功能恢复也会发生还需要测量肌纤维以完全确定功能结果。

许多研究利用了ES/iPS细胞和促进SKM再生的肌肉干细胞治疗(4,6,7,9,10).尽管ES/iPS细胞有潜力，但它们与固有的局限性，包括组织相容性和伦理担忧。此外，虽然肌肉干细胞可以从成年和产前组织，可能是收获是有限的。因此，成人干细胞，如MSC干细胞治疗的合适细胞来源，可以使用促进受损SKM的再生。在许多研究中，来自骨髓、脂肪组织、胎盘、，羊水、脐血和尿液显示出潜力促进SKM再生(1,11——14,18)。然而，再生程度当使用这些细胞时获得的损伤可能不足或损坏严重(1,11——14,18)。因此，T-MSC可能是由于其可用性和肌源性，是绝佳的选择分化能力。我们的数据表明，T-MSC具有8周时高效SKM再生能力显著步态评估显示移植后测试。

总之，在本研究中，我们证明了成肌细胞可能来源于人类T-MSCs并能分化转化为肌细胞在体外。这种肌源性分化是伴随着诱导步伐加快的能力步态评估显示的SKM损伤小鼠的长度测试。T-MSCs具有成肌潜能，因此可能促进肌肉生长通过任一直接再生从头开始肌肉分化或旁分泌机制。功能T-MSC衍生肌源性细胞的改良作用如下在治疗人体SKM损伤和其他退行性疾病造成的损害，包括先天性缺陷、创伤或肿瘤切除。

致谢

本研究得到了来自韩国卫生部卫生技术研发项目和福利，大韩民国和Ewha Womans 2014年RP-Grant大学。

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