从人胚胎和诱导的多能干细胞中获得运动神经元：实验方法和临床前景

摘要

运动神经元是位于中枢神经系统特定区域的细胞，例如大脑皮层（上部运动神经元）、脑干和脊髓（下部运动神经元），它们维持对自愿行为的控制。运动神经元主要受到广泛的神经系统疾病的影响，通常被称为运动神经元疾病（MNDs）：这些疾病的症状与肌肉萎缩和瘫痪有关，导致死亡。目前没有有效的治疗方法。干细胞衍生的运动神经元在MND和脊髓损伤的疾病建模、药物筛选和治疗方法开发方面是一种很有前途的研究工具。将人类多能干细胞（人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干电池（hiPSCs））定向分化为特定谱系是将这些细胞广泛用于早期人类发育研究和潜在临床应用的第一个关键步骤。诱导多能干细胞（iPSCs）可以通过用特定因子重新编程，从患者自身的体细胞（例如成纤维细胞）中生成。它们可以被视为胚胎干细胞样细胞，可以表达干细胞标记物，并有能力产生所有三个胚层，绕过了伦理问题。因此，hiPSC构成了运动神经元的一个诱人的替代来源。这些运动神经元可能是一个很好的研究工具，为研究人类早期大脑发育和神经退行性变过程中的病理机制创造了一个模型。患者特异性iPSC也可能为自体细胞替代治疗提供前提，而不会产生相关的免疫排斥风险。在这里，我们回顾了最新报道的将人胚胎干细胞或多能干细胞分化为功能性运动神经元的方法，并概述了其潜在的临床应用。

介绍

运动神经元（MN）是控制自愿行为的分化细胞，主要受广泛的神经疾病影响，通常被称为运动神经元疾病（MNDs）。MND可能会出现一系列由肌肉无力/萎缩引起的症状，并导致死亡[1]. 目前，这些疾病没有有效的治疗方法。

每年，每10万人中约有2例新发MND，这些疾病的流行率约为每10万名患者中5至7例[2]. MND通常在男性中比女性更常见，发病率为2:1[3]. MND患者的预期寿命变化很大：对于大约一半的这些疾病，死亡发生在症状出现后3至5年，但有些人可能活了10年以上，而在其他情况下，疾病可能会迅速进展。解释这种差异的原因仍然不太清楚。

MND可根据主要受疾病过程影响的MN亚群进行分类，包括脊髓性肌萎缩（SMA）、进行性肌萎缩、脊髓延髓性肌萎缩或肯尼迪病，以及涉及低MN的遗传性运动神经病。其中，SMA是儿童期最常见的疾病[4]. SMA是一种常染色体隐性遗传病：大多数SMA患者在SMN1型基因（存活运动神经元1），导致低α-MN选择性变性。这个SMN2型基因，一个表面活性剂1同源，补偿SMN1蛋白的异常生成，其表达水平与疾病严重程度相关[5]. 病理学涉及脊髓MN，导致其退化并最终死亡。

上MN在原发性侧索硬化症、遗传性痉挛性截瘫和伴有1型呼吸窘迫的脊髓性肌萎缩中更易发生[6].

最后，可以报告影响上下MN人群的疾病过程，如肌萎缩侧索硬化症（ALS）。ALS大多为散发性（SALS），家族型ALS（FALS）占10%[7].C9或72在大多数FALS病例中观察到扩张[8]，但许多其他基因也参与了ALS的发病机制，如Tar-DNA结合蛋白43(TDP-43型)，与肉瘤蛋白融合(保险丝) [9]和超氧化物歧化酶(SOD1标准) [10]. ALS发病率为每年每10万人1至2例，发病年龄约为50至60岁：症状在诊断后2至5年内从瘫痪发展到死亡[7].

ALS和MND发病的病理机制基本未知。这一过程中似乎涉及许多因素，环境因素和遗传因素的贡献各不相同[11].

干细胞衍生的MN在疾病建模、药物筛选和MND和脊髓损伤治疗方法开发方面是一种很有前景的研究工具[12,13]. 它们可以替代濒死的细胞，并为中枢神经系统（CNS）提供营养支持[12].

就后者而言，干细胞可能支持内源性细胞通过提供神经营养因子和清除有毒分解代谢产物来调节患病微环境。

特别是在神经退行性变的情况下，细胞置换产生的潜在积极影响与预先构建的宿主系统的复杂性有关。为了有效地替换丢失的细胞，移植的细胞应该整合到宿主电路中，并建立适当的连接，最终通过抑制性白质到达远距离目标。到目前为止，有几种移植策略侧重于更容易实现的“旁分泌”效应[14]其中，移植细胞通过分泌扩散因子发挥治疗作用。几项研究报告了干细胞在不同神经疾病模型（即帕金森氏病、中风和亨廷顿氏病）中因营养调节神经退化环境而产生的治疗效果[15]. 除此之外，干细胞还可以被设计成在疾病部位分泌选定的分子[16]; 利用慢病毒修饰的人神经前体细胞（hNPC）分泌胶质细胞衍生神经营养因子（GDNF），使其在ALS动物模型中正确整合。移植到脊髓后SOD1标准（G93A）大鼠，观察到细胞向疾病部位的显著迁移以及GDNF的有效传递。在疾病的早期和晚期，MNs在嵌合区域内得到了相当大的保存[17]. 类似地，hNPC被修饰成在刺激时释放GDNF；细胞被移植到啮齿类动物模型的纹状体中，能够存活并有效表达GDNF，为进一步研究帕金森氏病动物模型铺平了道路[18].

近年来，在干细胞领域取得了一些进展，涉及重编程和分化方法。干细胞可以定义为在保持形成三个胚层细胞（外胚层、内胚层和中胚层谱系）的能力的同时无限期复制的能力。干细胞的几种类型反映了可衍生的多种细胞类型以及获得干细胞的方式。

人类胚胎干细胞（Human embryonic stem cells，hESCs）来源于胚泡的内部细胞团，具有多潜能，可以维持在体外在很长一段时间内具有稳定的遗传背景，为生物和临床应用提供专门的人类细胞来源[19,20]. 将人胚胎干细胞定向分化为特定谱系是在早期人类发育研究以及潜在的未来临床应用中广泛应用人胚胎干公司的第一个关键步骤。然而，它们的使用可能会引发伦理问题，治疗应用可能意味着负面反应的风险，例如免疫反应或肿瘤的发展或两者兼而有之[21].

诱导多能干细胞（iPSCs）可以通过用特定因子重新编程从患者的体细胞中获得[22]. 它们可以被认为是胚胎干细胞（ESC）样细胞，可以表达干细胞标记物，并有能力产生所有三个胚层，绕过了伦理问题。特定的人源性iPSC为细胞替代治疗提供了前提，而不会产生相关的免疫排斥风险。因此，人类诱导的多能干细胞（hiPSCs）是MN分化的一个诱人的替代来源。已报道了不同的iPSC推导方法。病毒方法（通常是最有效的方法）存在与内源性基因随机激活/失活相关的主要风险。非整合方法（即蛋白质、RNA、信使核糖核酸和携带重编程因子的质粒）已被开发出来，以绕过这一问题，促进向临床实践的过渡[23].

在过去的几十年中，越来越多的人致力于将干细胞定向分化为神经元谱系。来自几项研究的数据表明，ESCs和iPSC具有反应性在体外引导神经规范的相同发展刺激体内并且能够产生具有特定形态和分子特征的分化神经元细胞。获得完全分化的细胞对简化模型至关重要在体外为生理发育和疾病发病机制的复杂过程搭建平台，最终目的是找到治疗孤儿疾病的方法。

这对于那些病理学尤其重要，例如MND，从人类患者中获取受影响的相关细胞可能是一项挑战。事实上，一些关于产生人类疾病特异性细胞的首批报道实例与MND有关[24,25]. 为了有效地将iPSC转化为大规模临床前研究，需要解决许多问题；其中包括评估标准化的有效分化方案和同质参数，以评估获得的细胞表型。就脊椎神经干细胞而言，世界各地都在努力寻找快速高效的分化方法。

在本综述中，我们将首先描述管理MN规范的基本步骤体内; 从这些研究中获得的数据指导了实验性分化方案的评估在体外我们将重点关注来源于hESCs和iPSCs的MN分化；我们将回顾最常用的神经诱导方法。神经诱导是通过神经花环和类胚体（EB）形成获得神经前体的第一个关键步骤。然后，为了快速和高效，可以使用不同的协议来区分神经祖细胞。我们将概述最新发布的方法，以及获得MN的不同评估方法。最后，我们将考虑hiPSC/ESC衍生MN的潜在临床应用，重点关注MND建模和治疗，注意在将有前景的临床前数据转化为临床应用之前我们需要解决的生物学挑战。

运动神经元发育

在胚胎发生过程中，蛋白质形态原和生长因子的局部产生和分泌调节着模式和细胞命运。神经发生是整个神经系统产生的发育过程；它从外胚层斑块开始，外胚层血小板自身折叠，形成神经管。神经管沿着口-尾轴和背-腹轴生长，在此过程中，相邻细胞分泌的形态发生因子和信号分子诱导细胞分化（图1) [26]. 形态因子诱导细胞内途径的激活，通过特定转录因子的激活，引起导致细胞分化的特定基因表达。特别是，脊髓MN命运的规范由三个步骤决定：神经化、尾状化和腹侧化[27].

图1

神经管形成过程中形态因子作用的示意图 体内 .颜色梯度表示每个形态发生素的表达水平。在神经管的背侧部分（浅绿色）可以发现高浓度的骨形态发生蛋白（BMP）：其水平沿腹侧部分降低。相比之下，声波刺猬（Shh）更集中在腹部（橙色），但在背部不表达。成纤维细胞生长因子（FGF）在神经管的前部（紫色）和后部（深绿色）高度表达。后部（浅蓝色）的维甲酸（RA）表达水平降低，此处可以发现高浓度的FGF和Wnt。MN，运动神经元。

术语神经化是指外胚层细胞向表皮或神经命运的分化。该规格受属于转化生长因子β（TGF-β）超家族的骨形态发生蛋白（BMP）的影响[28]. 因此，神经诱导是通过抑制BMP和TGF-β/SMAD信号来启动的[29]. 视黄酸（RA）使脊椎MN沿嘴-尾轴分化[30]诱导神经化和尾化以及Wnt和成纤维细胞生长因子（FGF）信号[31]促进前部或嘴侧模式[32]. 腹侧模式由声波刺猬（Shh）控制，它指导脊髓神经前体细胞的腹侧化[33]而背侧图案则由BMP家族成员控制[34].

BMP因子选择性地位于背神经管的“顶板”区域。其他生长因子由最腹面区域（“底板”）特异表达。顶板产生中间神经元，而底板区域是发育中神经元的起源地。神经管的背腹轴由Wnt形态发生信号梯度建立：高浓度Wnt决定背侧区域，而Shh信号决定腹侧区域[35]. Wnt蛋白也参与脊髓内前后方向的轴突引导[36].

了解调节MN发育的途径和特定形态因子对复制至关重要在体外其中一些生理步骤是为了从人类iPSC和ESC开始获得丰富的MN种群。目前，有许多方案利用形态发生剂或合成激动剂来促进MN规范[37,38].

人多能干细胞产生运动神经元

已经执行了不同的MN区分方法（表1); 在这里，我们总结了最近发表的一些最重要的方案，以获得从人类多能干细胞（hESCs和hiPSCs）分化而来的高纯度MNs群体。

表1人胚胎运动神经元诱导和多能干细胞诱导的实验方案

神经诱导

术语神经诱导是指从多能干细胞衍生的神经祖细胞的形成。有几种方法可以促进神经诱导；大多数包括神经玫瑰花结和EB形成（图2).

图2

从人类胚胎和诱导的多能干细胞中产生人类运动神经元。运动神经元生成的示意图在体外如图所示。多能干细胞-人类胚胎干细胞（hESC）和人类诱导多能干电池（hiPSC）分化的第一步是在粘附条件下获得悬浮或神经玫瑰花结中的类胚体（EB）。这些神经前体可以通过不同的多阶段实验方案在MN中成功区分（具有特定特征）。hESC或iPSC衍生的MN是一种很有前途的建模和研究研究工具在体外人类MN疾病的病理机制。这些MN也可能成为自体细胞替换的一个诱人来源。RA，维甲酸；嘘，声音刺猬。

神经玫瑰花结可被视为神经干细胞在适当的发育信号作用下沿神经元和胶质细胞系表现出高增殖潜能和广泛分化能力的阶段[48]. 神经花结由其特定的细胞结构、基因表达和外源性生长需求定义。为了产生神经花环，人胚胎干细胞和多能干细胞通常接种在聚赖氨酸/层粘连蛋白涂层的培养皿中，并在粘附条件下保持。细胞通常被置于补充N2和B27的神经基础培养基中，以促进有丝分裂后神经元的生长和长期存活。该培养基可额外添加小鼠/人类重组Noggin[37,46]或多索啡肽，用作BMP信号的抑制剂，以增强神经诱导[29,38,46]. 或者，干细胞可以在基质饲养器上培养[49]或转移到改良的TeSR1培养基中，直到细胞粘附并出现玫瑰花结结构[50].

莱因哈特及其同事[29]报道了仅使用小分子生成hNPC。这些神经祖细胞不需要人工选择，它们也能够分化为神经管谱系，包括MN。作者还假设Wnt与Shh结合可能有助于维持神经前体。使用多索吗啡和SB43152通过抑制BMP和TGF-β信号传导促进神经诱导。为了刺激典型的Wnt信号，将GSK3β抑制剂CHIR99021添加到细胞培养基中，并使用嘌呤吗啡胺刺激Shh通路。

近年来，许多研究小组已经开发了专注于EB形成的方案，以将干细胞分化为MN。EB是在悬浮培养物中自发生长的三维细胞聚集体，自组装。为了形成EB，iPSCs或ESCs从小鼠胚胎饲养层成纤维细胞中分离出来，并培养到超低粘附培养皿上。细胞培养基类似于用于人胚胎干细胞培养的培养基，补充有TGF-β和BMP抑制剂。介质通常含有诺金或小分子替代物，如Y-27632[51]为了提高细胞存活率，SB435142和LDN193189促进神经诱导[39]和FGF以促进增长。

一些作者采用了两种方法的组合：在悬浮环境中培养EB，然后将聚集体分离并接种在层粘连蛋白/脊髓灰质炎涂层板上，形成神经花环[25,43].

运动神经元生成

由于发育生物学的文化背景，我们知道MN分化在体外似乎总结了脊髓发育的生理过程。2002年，Wichterle及其同事[27]首先利用RA和Shh通过EB形成来分化小鼠ESCs；啮齿动物ESC的MN分化协议后来也被修改，以促进hESCs的MN承诺。Wada和同事[46]通过神经花环形成将hESCs分化为MNs：用1μM RA和500 ng/mL Shh处理hESCs衍生的神经前体，产生大量的TubulinβIII⁺，血红蛋白9⁺，岛屿1⁺和胆碱乙酰转移酶阳性（ChAT⁺)神经元。显示MN标记如Islet 1、Hb9和Olig2的转录上调。终末分化神经元突触阳性，电生理活性。在与C2C12肌管细胞的培养中，MN能够重建神经肌肉连接。总的来说，这些数据表明，人胚胎干细胞可以分化为表达特定分子标记的MN，并且具有与生理发育MN相似的功能特性。多年来，许多报道的方案测试了关键信号分子的不同有效浓度，从1 nM到1μM的RA和50到500 ng/mL的Shh[25,39,40,45].

另一个需要调节的关键变量是添加小分子以进行分化的时间。胡和张[43]报告了一项从分化为MNs的hESCs开始的方案：细胞在hESC培养基中培养4天，然后在神经分化培养基中进行培养。第二周，通过人工筛选，可以分离出附着在培养皿表面并具有神经上皮玫瑰花结特征的聚集体。作者报告称，第10天早期神经上皮细胞Olig2阳性对RA的反应更灵敏；因此，在第10天的研究方案中增加了RA。这些Olig2表达细胞在第五周分化为脊髓运动神经元，并表达转录因子，如Hb9和Islet1。他们报告说，优化后的方案通常会从原始人类胚胎干细胞后代中产生50%以上表达Hb9的运动神经元。

另一个需要考虑的变量是人类干细胞分化为尾侧/吻侧亚型的自然习惯，从而产生内侧/外侧柱和颅骨MN。同样，诱导脊髓MN广泛范围内特定神经元亚型发育的选择性分化信号需要进一步研究广泛应用于在体外研究和细胞疗法。通过操纵Hox基因网络来确定柱状和池状MN身份，可能是选择性调节前体细胞分化为特定MN亚型的基础。最近，阿莫罗佐及其同事[39]系统比较了三种平滑激动剂的腹侧化活性，使用标准的RA/Shh方案，包括全反式RA和改良Sonic hedgehog（Shh-C25II）蛋白，作为hESCs分化为MNs的基准。为了评估MN数量，他们依赖于HUES3 Hb9:GFP报告株，该报告株包含一个在MN特异性Hb9启动子控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因。在Hb9启动子限制性片段的转录控制下，用携带新霉素抗性盒和GFP编码序列的质粒电穿孔HUES3细胞。通过这种方式，在MN特异性报告基因Hb9的控制下，构建干细胞以表达GFP。此策略允许研究培养中的细胞形态和分化及其追踪体内然而，必须考虑到该标记物不能提供运动神经元亚型的任何信息，并且由于GFP的半衰期较长，GFP的荧光可能会给出假阳性结果。GFP极少⁺在缺乏外源性Shh激动剂的情况下观察到细胞。重组Shh和人特异性Smo激动剂均产生小于10%的GFP⁺细胞。相比之下，单用Smo激动剂（SAG）就增加了16% ± 4%GFP⁺细胞和单独的purmorphamine诱导22% ± 6%. RNA-seq分析显示，与仅经Shh处理的细胞相比，经SAG和嘌呤吗啡处理的细胞中脊髓MN标记物和胆碱能基因表达丰富。这项工作利用了非病毒的分化方案，其特点也是相对较高的速度和效率。同样重要的是，阿莫罗索和他的同事们[39]在选择和验证特异性标记库以评估细胞表型方面做出了巨大努力：发现Hb9和ISL1在大约一半的细胞中交替表达，并不总是像最初认为的那样共同表达。此外，这种从hESCs开始的分化方法导致了表达FOXP1的MNs的产生（68% ± 4%），这是肢体肌肉神经支配外侧运动柱神经元的标志。该区域子规范对于疾病建模研究可能很重要。

据报道，许多其他分化混合物的共同目标是获得高度富集的脊髓运动神经元群：用B27补充RA和Shh[43,46]，cAMP[37,40,45]、肝素、脑源性神经营养因子（BDNF）和抗坏血酸[37,40,45]. 洛佩斯·冈萨雷斯及其同事[52]分析了黄体酮和17β-雌二醇对HBG3 ESCs MN分化的影响。在EB期MN分化期间，孕酮治疗联合RA和Shh诱导的MN比例高于单独RA/Sh[52].

iPSC使用的发现和确立为该领域提供了进一步的进展；通过使用hiPSCs，已经有可能产生携带特定遗传变异组合的MN，从而导致单个患者的神经退行性变。Corti及其同事已经完成了从SMA患者衍生iPSC开始的多阶段MN分化协议[25]. 对于MN的产生，来自SMA患者的iPSCs在补充N2和肝素的神经元培养基中生长。10天后，添加RA（0.1μM）进行尾化，第17天，将后分化的神经外胚层细胞簇重新悬浮在与RA（0.1微米）和Shh（100至200 ng/mL）相同的培养基中一周。在第24天，添加BDNF、GDNF和胰岛素样生长因子-1以使MN成熟。衍生的人MNs以特异性标志物的表达为特征，并具有SMA疾病的病理特征。

这项研究为干细胞的潜在应用提供了重要数据在体外作为一种可行的治疗方法。就前者而言，生成的MN呈现出成熟谱系和脊髓MN承诺的特征，如HB9/ISLET1和SMI32。这个在体外分化方案产生混合细胞群，包括非运动神经元细胞。为了进一步分离和纯化MN，开发了一种基于梯度离心的物理策略，以获得丰富的MN种群[25]. 此外，与野生型细胞相比，SMA-iPSC衍生的MN显示出较短的轴突长度、较小的生长锥，并且形成神经肌肉连接的能力受损，这是MN疾病的特征。关于后者，已通过非病毒非整合方法获得了重新编程的细胞，这可能适用于未来的人类治疗。一旦将重组细胞移植到小鼠模型中，就没有出现排斥反应的主要迹象，而是记录了适当的移植，甚至部分挽救了患病表型。

同样，从ALS患者的hiPSC开始，采用不同的方法诱导MN。萨琳和同事[45]通过使用富含RA的神经分化培养基悬浮培养iPSCs 6天，从ALS患者中生成iPSC-derived MNs，以形成EB。第17天，用添加RA和嘌呤吗啡胺的神经诱导培养基处理细胞8天。然后分离EB，将单个细胞置于含有B27、RA、吗啡胺、db-cAMP、抗坏血酸、BDNF和GDNF的培养基中培养2至7周。衍生的MN概括了ALS疾病的特征，可用于研究细胞退化过程和测试新的治疗化合物。

衍生运动神经元评估

在区分具有不同实验协议变量的MN方面，越来越多的专家强调了对衍生MN进行持续评估的必要性。在再生医学或MND中开发人类干细胞衍生的MN在体外建模时，首先需要评估它们的适当差异，评估它们是否具有与MN相同的特征体内从人类ESC和iPSC系开始的有效MN分化可以通过评估MN的特征来评估体内（即标记表达、形态和功能特性）（图2). 作者证明，hESC和hiPSC衍生的MNs的特征是表达先前在人类MNs中评估的相同特异标记体内[25–27]. 事实上，MN有丝分裂后标志物如Hb9、HoxC8、ChAT和SMI-32的表达是通过免疫细胞化学分析评估的，MN祖细胞标志物如Pax6、Nestin、Olig2和Islet1/2的表达以及泛神经标志物如β-微管蛋白和抗微管相关蛋白2的表达也是如此[25,29,39,42,45].

卡伦巴亚拉姆及其同事[44]证明通过神经花环和EB形成获得的MNs表达MN祖细胞标记（即Olig2和Nkx6.1），并且还显示成熟标记如β-微管蛋白、ChAT和Islet1的富集。为了以无偏见的方式进一步表征这些标记的表达，作者通常进行Western blot、PCR定量逆转录PCR和逆转录PCR以及全转录测序或RNA-seq，以检测脊髓MN标记（Islet1、Islet2和Hb9）以及CHAT、CHT1、VACHT、CHRNA3、，CHRNA4和CHRNB2，表示胆碱能特性[27,39].

在几项研究中，由MN特异性报告者操纵干细胞以表达GFP。Hb9活性的特异性报告子编码成熟MN特异表达的转录因子，由于其相对较高的特异性和经评估的染色，因此最常用。

Hb9驱动的GFP报告子通常被转染到干细胞中，从而鉴定Hb9转录活性的MNs。这种技术有助于培养和细胞追踪中的细胞研究体内Hb9:GFP干细胞可以研究其细胞形态成熟（即分支和突起生长）以及随时间增加的体面积[29,39,44]. 其他作者开发了Olig2:GFP系，将增强型GFP盒插入hESCs的Olig2位点，以靶向MN祖细胞[53]. 电生理分析（包括钙成像和全细胞膜片钳）表明，干细胞衍生的MN在培养中随着时间的延长而变得电活性，并对谷氨酸激动剂产生反应[27,34,38,39,49]. 高泽及其同事[37]观察到与干细胞分化的MN成熟相关的电生理变化，包括输入电阻降低和动作电位放电频率增加。此外，这些细胞还表现出脊髓MN的两个独特特征体内：尖峰频率适应和回弹动作电位触发[37].

体内形态学分析可以包括通过注射干细胞衍生MNs（通常为Hb9:GFP）进行异种移植⁺很容易追踪）到动物模型中。多能干细胞衍生的MN表现出将轴突通过腹侧（有时是背侧）根投射到中枢神经系统外的能力，并在移植到发育中鸡的脊髓时遵循适当的神经通路[39]或老鼠[25,29]. 此外，Corti及其同事[25]结果表明，植入的GFP-MNs共同表达泛神经特异性标记物和ChAT，与骨骼肌形成新的神经肌肉接头，一旦移植到SMA模型小鼠中，可诱导神经肌肉表型和存活率的改善。

临床观点

疾病建模

疾病建模代表了人类干细胞衍生MNs应用的一种有趣的可能性：随着对干细胞分化标准化方案的优化，已经可以大量生产人类MNs来解释在体外基本疾病过程。干细胞也可以被操纵以表达与MND相关的突变基因[54,55].

使用特定因子的重编程方法的发现以及第一批患者特异性hiPSC株的衍生为这一方向迈出了进一步。

iPSC可用于衍生人类MN在体外从而解决有关神经元分化和功能改变的具体问题，这些改变可能导致疾病的发展，如ALS、SMA和许多其他疾病。重建的可能性在体外一个可靠的人类疾病模型是有价值的，因为已经有许多治疗方法的例子，它们在动物模型中相对有效，但不幸的是，对患者来说效果并不好[7].

Burkhardt及其同事[41]从大量健康对照组和ALS患者中重组成纤维细胞为iPSC，并将其分化为MN。作者报告称，来自三名SALS患者的MN具有从头开始TDP-43这些聚集物总结了iPSCs来源的三名患者之一死后组织的病理特征。然后，作者通过在低MN和高衍生MN中使用TDP-43聚集终点进行高含量化学筛选，以鉴定美国食品和药物管理局批准的小分子调节剂。

Corti和同事[25]用非病毒方法从SMA患者中生成iPSCs，使细胞不含载体和转基因序列。然后通过涉及RA和Shh的多阶段分化方案将SMA iPSC分化为MN。SMA-ipSC产生的MN具有特定的疾病相关特征，提示选择性MN变性，例如MN存活率和大小减少，轴突生长和神经肌肉接头形成减少。通过外显子7中单核苷酸的稳定遗传修饰生成SMN2的寡核苷酸，导致SMN2编码区的修饰。因此，外显子7被拯救，导致全长SMN2的产生增加。对来自纠正和未治疗SMA-ipSC的MN的表型进行了比较：用寡核苷酸进行基因纠正挽救了SMA-MN的神经病理学特征，并与SMN表达相关。评估了SMA-iPSC MNs与治疗后SMA-ipCS MNs的转录差异，揭示了参与RNA代谢、MN发育和轴突导向的基因子集的变化。

到目前为止，已经从患有各种神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病）的患者中产生了各种iPSC系[56–58]. 患者源性干细胞可能是使用可靠动物模型鉴定和测试神经疾病治疗化合物的最佳补充方法之一。

人类运动神经元的治疗性移植

神经退行性疾病的细胞治疗通过引入功能细胞来拯救受损神经组织的功能。将hESC衍生的MN移植到发育中的鸡胚中，可以正确植入，维持运动神经元的特性，并在中枢神经系统外长距离延长轴突，达到适当的外周肌肉靶点[49]. 将其移植到成年大鼠脊髓中，导致神经植入，包括大量带有ChAT萌芽的人类MN⁺纤维。这些数据表明，hESC衍生的MN可能能够通过成年脊髓向腹根投射，类似于鸡胚脊髓，即使时间尺度不同。这项研究为体内hESC衍生MN的存活，这是未来临床前应用的关键要求。

hiPSCs与hESCs相似，为hESCs开发的实验策略可以应用于多能干细胞，而无需进行重大修改。此外，据hESCs报告，hiPSC在供体和受体之间的免疫相容性方面没有问题[57]. 因此，它们被研究为一种有希望的自体细胞来源，用于神经疾病的移植治疗。SMA患者的iPSC（SMA-ipCS）是通过使用非病毒、非整合的会厌载体生成的：SMN2型基因被转化为SMN1型-基于单链寡核苷酸使用策略的like基因[25].体内移植到转基因SMA小鼠的脊髓中后的实验表明，iPSC衍生的MNs可以存活并整合到SMA小鼠的脊髓中，并改善SMA I型表型。移植SMA小鼠的存活率（约50%）高于经车用治疗的小鼠，这种有益效果与经治疗的SMA-iPSC MNs相比更为相关[25].

在有效地将细胞介导的方法应用于临床之前，临床治疗的这些吸引人的前提必须受到关键问题的影响。重要关注点与良好生产规范（GMP）下细胞的生成和制备有关。已经证明，ESCs可以在不使用动物源试剂（外源性试剂）的情况下生成；然而，患者特异性iPSC的衍生通常需要不在无异种条件下进行的重新编程方法。用病毒方法产生的iPSCs存在与内源性基因随机激活/失活相关的主要风险。非整合方法（即蛋白质、RNAs、mRNAs和携带重编程因子的质粒）已得到改进，以绕过这一担忧，并促进向临床的过渡[23]. 待移植的神经干细胞也可以通过直接重编程（诱导神经干细胞或iNSC）获得：与iPSC的生成相比，实验方案提供的通路更少，从而减少了不同质量检查点的必要性[59]. 另一方面，iNSC是一种相当新的干细胞来源，因此，生成方法仍需标准化，并对获得的表型进行精确评估[59]. 一般来说，应该实施针对特定谱系的分化协议，包括严格的数据同质化和标准化方法，以实现可复制性。市面上有几种无氙培养基制剂，以及GMP喂料器[23]. 需要严格评估分化表型，通常结合不同的评估方法来限制最终的非特异性染色。事实上，临床翻译后，追踪和评估移植细胞状态的GMP优化技术是必要的。最后，获得的细胞应进行标准化质量控制，以评估其生存能力、无菌性和适当的细胞形态（即核型分析、特异性标记评估和无外源污染）[23].

使用自体细胞（如iPSCs）可以绕过与宿主免疫注射相关的担忧。然而，仍需进行严格评估iPSC免疫原性的研究，结果可能因细胞制备方案而异。

细胞疗法的临床应用前景必须基于之前的问题进行校准：未来治疗的前提很好，但需要通过标准化进行彻底测试在体外首先进行研究，然后进行严格评估的人体临床试验。

尽管有许多方面需要澄清，当然也值得进一步研究（即移植MNs的生存、整合和投射轴突的能力，以远距离神经支配适当的外周靶点），这些初步结果为未来人类多能干细胞可能为SMA和其他MND的治疗性移植提供健康MNs来源开辟了道路。

结论

人类多能干细胞治疗神经退行性疾病的潜力巨大。干细胞可以通过几种不同的方式引入临床应用，例如疾病建模、药物筛选和细胞替代治疗。

非病毒干细胞重编程方法的开发和优化将使临床医生绕过与随机病毒整合相关的担忧。使用自体患者细胞也可以缓解与宿主免疫注射相关的问题。关于分化细胞的生产，高效评估方案至关重要，以便大规模生产用于质量控制评估。最近发表的一项研究报告了iPSC在20天内产生MN[60]. 考虑到未来的临床应用，有必要将生产效率和快速性与持续关注GMP条件下的工作、开发无氙介质和进行仔细的质量控制评估结合起来。干细胞研究的最新进展为在体外产生大量不同类型的神经细胞并用于神经系统的修复。近年来，在获取和理解MN方面取得了进展；然而，仍有一些方面需要研究。其中，MN发育的分子标志和不同亚型的规范体内仅部分已知。对于生产MN的不同方法，广泛的应用需要精确考虑细胞板和培养的实验条件。此外，还应克服诸如确保临床安全的挑战。尽管解决所有这些问题可能需要相当长的时间，但建立和优化人类干细胞分化协议以开发基于hiPSC的临床应用可能是治疗神经退行性疾病的关键。