mTOR调节MAPKAPK2翻译以控制衰老相关分泌表型

mTOR抑制作用影响SASP而不逆转衰老生长停滞

mTOR的抑制已被证明会损害衰老表型，但关于它是否也能逆转衰老生长停滞，存在相互矛盾的证据^22，28，29阻断IMR90 ER:RAS细胞中的mTOR信号转导导致SA-β-Gal阳性细胞减少，其他衰老标记物（如p16）水平降低^INK4a公司和第21页^CIP1a公司然而，mTOR抑制并不能挽救生长停滞(图2a，补充图S2a-c). 这可以用mTOR抑制引起的明确的抗增殖作用来解释^30，31事实上，雷帕霉素显著降低了IMR90 ER:RAS衰老细胞中Cyclin D3的水平(补充图S2d).

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图2

mTOR抑制在不逆转衰老生长停滞的情况下损害SASP

a。mTOR抑制导致SA-β-Gal活性降低，但细胞仍被抑制。4OHT诱导IMR90 ER:RAS细胞衰老。从第0天开始用指定的药物处理细胞。在诱导后第4天和第7天测量BrdU掺入，而在第7天测定SA-β-Gal活性。数据为平均值±标准差n个=6（BrdU）和n个=4（SA-β-Gal）独立实验。显示了SA-β-Gal活性染色的代表性图像。比例尺，40μm。b。衰老诱导后抑制mTOR可下调SA-β-Gal活性，但不会逆转生长停滞。4OHT处理7天可诱导IMR90 ER:RAS细胞衰老。在此阶段，用25 nM Torin1处理衰老细胞。在指定时间监测BrdU掺入，并在第13天测量SA-β-Gal活性。数据为平均值±标准差。n个=4个独立实验。显示了SA-β-Gal活性染色的代表性图像。比例尺，40μm。c。衰老诱导后mTOR的抑制下调SASP。IMR90 ER:RAS细胞按（b）处理。在4OHT诱导13天后（添加Torin1后6天），通过qRT-PCR监测所示SASP组分的表达。数据为平均值±标准差n个=3个独立实验。所有统计显著性均使用双尾Student’st吨-测试，***P<0.001；**P＜0.01*P<0.05；n.s，不重要。有关原始数据，请参阅补充表7.

在上述实验中，我们同时添加了mTOR抑制剂和4OHT(图2a). 为了排除SASP下调是细胞不分裂或通过mTOR抑制阻止细胞进入衰老的结果，我们进行了实验，其中我们仅在OIS建立后用mTOR抑制剂处理IMR90 ER:RAS细胞(图2b). 在这种情况下，Torin1介导的mTOR信号传导抑制(补充图S2e)也导致SASP下调，SA-β-Gal染色减少，但不能挽救细胞生长(图2b，c和补充图S2f). 因此，mTOR抑制可以将衰老生长停滞与SASP诱导分离开来。

4EBP对翻译启动的监管控制SASP

mTOR磷酸化几个下游效应器，其中4EBP是研究得最好的一个。4EBP控制全球翻译速率，但也对特定mRNA的翻译进行差异调节²⁰有趣的是，显性阴性4EBP1突变体（4EBP1-DN）的表达(补充图S3a)，抑制了对OIS和γ辐射的SASP反应(图3a-c和补充图S3a-b).

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图3

4EBP介导mTOR下游SASP的调节

交流。mTOR不能磷酸化的eIF4EBP1-4A磷酸化突变体（4EBP1-DN）的表达阻止了SASP的诱导。IMR90 ER:RAS细胞感染表达4EBP1 DN的载体（或空载体）。（a）用4OHT诱导7天后用qRT-PCR检测SASP基因的表达。数据为平均值±标准差n个=3个独立实验.（b）从SASP成分免疫染色（IL8、IL1α和IL1β）中获得的归一化强度值的倍数变化。数据为平均值±标准差n个=4个独立实验.（c）代表来自（b）的图像。比例尺，30μm。d。4OHT诱导7天后，按照方案中的指示处理IMR90 ER:RAS细胞。DAPI染色用于评估指定时间的细胞数量。数据为平均值±标准差。n个=6个独立实验。e、。4OHT诱导后7天，通过使用基于AHA的荧光测定法测量IMR90 ER:RAS细胞中的整体蛋白质合成率。如图所示，在添加100μM AHA之前，将细胞预处理2小时。30分钟后测量荧光强度，反映新合成的蛋白质（DAPI用作副染色）。（右）数据为平均值±标准差n个=4个独立实验.（左）显示了具有代表性的图像。比例尺，40μm。f、。Torin1对衰老细胞多聚体中SASP mRNA分布的影响。IMR90 ER:RAS细胞用4OHT孵育7天，然后用DMSO或250 nM Torin1处理3小时，然后再进行蔗糖梯度分馏和多聚体分析。生成的多糖体轮廓以及分数、单糖体和多糖体位置的示意图如所示补充图3c-d图中显示了主动翻译多糖体部分中所示mRNA的百分比。EEF2和RPS20转录物是mTOR的标准靶点。GAPDH对mTOR抑制不敏感。数据为平均值±标准差。n个=3个独立实验。所有统计显著性均使用双尾Student’st吨-测试，***P<0.001；**P<0.01*P＜0.05；n.s，不重要。有关原始数据，请参阅补充表7.

为了排除mTOR抑制通过非特异性阻断翻译影响SASP，我们比较了Torin1和环己酰胺（CHX，其阻断翻译延伸）的作用。而用Torin1治疗的衰老细胞仍然被抑制(图3d)，CHX治疗导致细胞快速死亡。这些结果(图3d)表明衰老过程中mTOR抑制所引起的影响不是由于整体翻译关闭。为了研究mTOR抑制如何影响衰老过程中的蛋白质合成速率，我们利用蛋氨酸类似物L-叠氮高丙氨酸（AHA）的定量荧光分析³²OIS期间全球翻译率增加，与之前的研究一致²⁰，Torin1治疗大大减少从头开始蛋白质合成。然而，总的翻译仍然可以与非基因细胞的翻译相比较。相反，CHX几乎完全停止蛋白质合成(图3e).

上述结果表明，mTOR和4EBP1可能通过调节特定mRNA的翻译来控制SASP。为了研究这一点，我们从用Torin1或载体处理3小时的衰老细胞中分离核糖体(补充图S3c). 我们评估了mRNA在多聚体和非多聚体（单体）组分中的分布(图3f和补充图S3d，e). 在用Torin1处理的细胞中，典型mTOR靶点（如EEF2或RPS20）的mRNA分布几乎完全转移到“单体”、非翻译部分(图3f). 家政基因如GAPDH的mRNA并非如此(图3f). 所分析的大多数SASP组分mRNA的多聚体关联性略有下降(图3f和补充图S3e)与Torin1对翻译的总体影响一致。在分析的SASP组分中，编码IL8和IL1α的mRNAs在Torin1治疗后多糖体相关性下降最大(图3f). 然而，在OIS急性mTOR抑制下，所有SASP组分的60%以上的mRNA仍与多聚体相关(图3f和补充图S3e)，表明mTOR可能会调节其他靶点的翻译以控制SASP。

mTOR通过控制MAPKAPK2号机组

通过使用激酶底物富集分析（KSEA）分析磷酸蛋白质组数据³³)，我们发现MAPKAPK2/MK2激酶活性在衰老过程中增加，但在mTOR抑制后下降(图4a和补充表S3). MAPKAPK2/MK2位于p38αMAPK的下游³⁴已知SASP调节器¹²免疫印迹证实，mTOR抑制后MAPKAPK2磷酸化减弱，但也显示MAPKAPK 2水平降低，p38αMAPK水平降低(图4b). 然而，p38α活性不受mTOR抑制的影响，如底物ATF2磷酸化不变所示，HSP27（MAPKAPK2底物）磷酸化显著降低(图4b). p38α和MAPKAPK2相互作用，相互控制其稳定性³⁴MAPKAPK2的降低可以解释p38α水平的降低。

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图4

mTOR通过控制MAPKAPK2翻译调节SASP

a。磷酸蛋白质组分析表明，mTOR信号控制MAPKAPK2激酶活性。IMR90 ER:RAS细胞与二甲基亚砜或4OHT和指示药物孵育7天，然后进一步处理以进行MS分析。热图显示了衰老期间KSEA算法计算的不同激酶的底物基团的富集，以及对mTOR抑制的响应。（详见方法）。显示了3个独立实验的平均值。R、 雷帕霉素；T、 托林1；N、 NVPBEZ-235。b。IMR90 ER:RAS细胞按指示处理7天。用所示抗体进行免疫印迹。c。协会MAPKAPK2号机组急性mTOR抑制后，含有多聚体的mRNA显著降低。图表显示了MAPKAPK2号机组和地图14（编码p38αMAPK）与多聚体相关的mRNA(n个=3）IMR90 ER:RAS细胞用4OHT培养7天，然后用DMSO或250 nM Torin1处理（3小时）。d。IMR90 ER:RAS细胞按指示处理7天。的表达式MAPKAPK2号机组和地图14通过qRT-PCR进行评估(n个=3)e、。mTOR抑制强烈损害从头开始MAPKAPK2的翻译。4OHT处理7天后，IMR90 ER:RAS细胞按方案处理。含有AHA的蛋白质被生物素化，并使用链霉亲和素珠进一步纯化。的表达式从头开始用所示抗体（右）和定量（左）通过免疫印迹分析合成的蛋白质(n个=3).f、。IMR90 ER:RAS细胞感染4EBP1-DN。加入4OHT后7天，通过免疫印迹法测定4EBP1、MAPKAPK2和p38α的表达g、。用100nM MK2抑制剂III处理IMR90 ER:RAS细胞。4OHT诱导7天后，用qRT-PCR监测所示SASP成分的表达(n个=3). 所有统计显著性均使用双尾Student’st吨-测试，***P<0.001；**P<0.01*P<0.05；n.s，不重要。所有误差条表示平均值±标准差。n个表示独立实验的数量。对于b、 e（电子）和（f）给出了3个独立实验的典型图像。未处理的印迹原始扫描显示在补充图9。有关原始数据，请参阅补充表7.

有趣的是，全球核糖体分析表明mTOR可以控制MAPKAPK2的翻译^20，35相应地MAPKAPK2号机组mRNA（但不是地图14或上游激酶MKK6型)在OIS中急性mTOR抑制后，与多糖体结合显著下降(图4c，补充图S4a). 由于的成绩单水平MAPKAPK2号机组或地图14当mTOR信号被阻断时（编码p38α）保持不变(图4d)我们的结果表明，mTOR在衰老过程中特异性调节MAPKAPK2的翻译。

为了证实这一点，我们通过给予AHA-生物素脉冲，然后进行链霉亲和素下拉和免疫印迹来分析MAPKAPK2的翻译(图4e和补充图S4b). 急性mTOR抑制降低从头开始MAPKAPK2（~80%）的合成与mTOR标准靶的合成相似。相反，从头开始不同SASP组分（IL8、IL1β和MMP1）的翻译仅减少25-35%，与家政基因（如GAPDH和βACTIN）的效果相当(图4e). 这些差异效应与CHX治疗相反，CHX治疗同样抑制从头开始所有分析蛋白质的合成(图4e).

为了进一步研究mTOR是否控制MAPKAPK2翻译，我们在OIS期间监测了MAPKAPK 2的表达和mTOR信号传导。RAS诱导快速激活PI3K/AKT和mTOR信号，由于之前报告的负反馈回路激活，在48小时-72小时后信号下降³⁶, (补充图S4c). 值得注意的是，MAPKAPK2蛋白水平和mTOR信号在整个分析的时间过程中显著相关(补充图S4c). 此外，4EBP1-DN的过度表达强烈下调了MAPKAPK2蛋白水平(图4f)MAPKAPK2的药理抑制或敲除阻止了SASP的诱导(图4g，补充图S4d). 总之，我们的结果表明mTOR通过4EBP1介导的对SASP的调控MAPKAPK2号机组翻译。

MAPKAPK2磷酸化ZFP36L1/BRF1调节SASP

磷酸蛋白质组学证实，在OIS期间，已知的MAPKAPK2底物ZFP36L1在丝氨酸54（S54）处磷酸化。重要的是，这种磷酸化在mTOR抑制时受损(补充图S5a和补充表S3). ZFP36L1（也称为Tis11b或BRF1）是一种锌指蛋白，通过结合3'UTR中富含AU的元素（ARE）来破坏mRNA的稳定性³⁷.ZFP36L1针对几种细胞因子的mRNA进行降解³⁸在S54、S92和S203通过MAPKAPK2磷酸化ZFP36L1抑制其与mRNA的结合³⁹同时稳定ZFP36L1⁴⁰在OIS期间，mTOR抑制对ZFP36L1磷酸化的影响通过抗ZFP36L（检测到衰老细胞中的带移位）和磷酸特异性pZFP36L2的抗体得到证实^S203型抗体⁴¹(图5a). 重要的是，OIS期间ZFP36L1的磷酸化对MAPKAPK2的抑制敏感(图5b和补充图S5b). mTOR的抑制也影响ZFP36L1蛋白水平(图5a，补充图S5c)可能是磷酸化调节的蛋白酶体降解的结果⁴⁰作为ZFP36L1型mTOR抑制后翻译没有改变(补充图S5d)

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图5

MAPKAPK2磷酸化ZFP36L1以调节SASP

a。通过使用ZFP36L1抗体和pZFP36L1的免疫印迹分析OIS期间mTOR抑制对ZFP36L磷酸化的影响^S203型抗体⁴¹.p，磷酸化；u、 未磷酸化。b。用MK2抑制剂III（20、100和200 nM）处理的IMR90 ER:RAS细胞中ZFP36L1磷酸化的免疫印迹分析。首席执行官。IMR90 ER:RAS细胞感染ZFP36L1 wt或突变型（ZFP36L2）^{S54A、S92、S203}，ZFP36L1^静音)MAPKAPK2预测不会磷酸化。（c） ZFP36L1的免疫印迹分析。（d） （左）添加4OHT后14天通过CV染色评估对细胞增殖的影响。（右）BrdU公司(n个=7）和SA-β-Gal活性(n个=4）通过IF.比例尺（40μm）进行监测。（e） ●●●●。通过qRT-PCR评估SASP组分的表达(n个=5).f、。指示的IMR90 ER:RAS细胞在没有FBS的情况下用DMSO或4OHT处理。6天后，收集CM并处理MS。热图代表ZFP36L1的全局效应^静音关于已识别的分泌因子（详见方法）。给出了3个独立的实验。g、。文氏图表示mTOR抑制剂、shmTOR和ZFP36L1下调的SASP因子之间的重叠^静音表达。小时。平均ARE得分⁴²关于shmTOR和mTOR抑制剂通常下调的18个SASP因子（参见补充图1d)已计算（红线）。图中表示10的ARE得分分布⁵18 mRNA的随机组合。一、。IMR90 ER:RAS细胞被2个靶向ZFP36L1的shRNAs感染，并按指示进行治疗。（左）ZFP36L1表达的免疫印迹分析。（右）通过qRT-PCR评估雷帕霉素治疗对SASP的影响(n个=3). 使用以下公式计算统计显著性：(d、 e（电子）和记者：学生的t吨-测试）(克：超几何试验）(小时：排列测试）。***P<0.001；**P<0.01*P<0.05；n.s，不重要。误差线表示平均值±标准差。n个表示独立实验的数量。对于a-d公司和我，数据代表3个（c，d，i）或4个（a，b）独立实验。除非另有说明，否则用4OHT诱导IMR90 ER:RAS细胞7天。有关未处理的斑点原始扫描，请参阅补充图9。有关原始数据，请参阅补充表7.

接下来，我们表达ZFP36L1wt或不可磷酸化的突变型（ZFP36L1^{S54A、S92A、S203A}，ZFP36L1^静音)在IMR90 ER:RAS单元中(图5c和补充图S5d). ZFP36L1型^静音表现为组成活性突变体，抵抗MAPKAPK2的失活。ZFP36L1型^静音表达阻止了SASP的诱导，但它也拯救了细胞增殖并抑制了衰老(图5d-e，补充图S5e-f). ZFP36L1属于RNA-结合蛋白家族，也包括TTP和ZFP36L2。有趣的是，ZFP36L2的表达^MUT公司，以及在较小程度上的TTP^MUT公司SASP诱导也受到影响(补充图S5g-i). 虽然我们仅在OIS期间发现了ZFP36L1磷酸化(补充表S3)，我们不能排除TTP或ZFP36L2在SASP监管中的类似作用。蛋白质组学分析表明ZFP36L1^静音下调大多数SASP（60/89，图5f，补充表S2). mTOR抑制和ZFP36L1下调（但不上调）的因子之间存在显著重叠^静音表达式(图5g，补充图S5j，k)，强调了ZFP36L1在mTOR调节SASP中的作用。此外，mTOR抑制或ZFP36L1下调的因子^静音在其3'UTR中表达的ARE多于预期或高于mTOR上调的因子(图5h，补充图S5l)，使用ARE得分预测⁴²最后，在mTOR抑制下，ZFP36L1被敲除的细胞抑制SASP的效率较低(图5i)表明ZFP36L1通过mTOR介导SASP调节。

ZFP36L1是SASP的直接调节器

表达ZFP36L1的IMR90 ER:RAS细胞的基因集富集分析^静音证实除抑制SASP外，ZFP36L1^静音还能防止衰老(补充图S6a). 与ZFP36L1靶向3'UTR中富含AU-丰富元素的mRNA一致，ZFP36L的下调作用更强^静音与ARE得分较高相关(图6a). 为了研究ZFP36L1是否直接调节SASP，我们生成了一个多西环素诱导的ZFP36L2^静音构建，并在OIS建立后诱导其表达(图6b). ARE评分高的基因（如IL8或IL1β）早在ZFP36L1后6h就被强烈下调^静音归纳法，暗示一个直接事件。ARE评分较低的基因（如MMP3或MMP10）下调至少需要24-48小时，表明存在次要影响，而SASP组分的表达不受ZFP36L1的影响^静音（如TIMP1）未更改(图6c，补充图S6c). 使用该系统，在ZFP36L1后24小时还观察到BrdU掺入量增加^静音诱导(补充图S6d).

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图6

ZFP36L1是SASP的直接调节器

a。所示基因的下调（以对数表示₂当比较表达ZFP36L1的IMR90 ER:RAS细胞时^静音与对照组相比，IMR90 ER:RAS来自3个独立实验获得的RNA-Seq数据。基因ARE得分⁴²如图所示。b。（左）c-d所示实验方案。（右）FLAG-ZFP36L1的表达^静音在指定时间用强力霉素（200ng/ml）治疗后通过免疫印迹监测。TRE，四环素反应元件。c-d。IMR90 ER:RAS感染TRE-FLAG-ZFP36L1^静音（或空向量）和反向交易动因（rtTA-M3）。添加4OHT六天后，ZFP36L1的表达^静音用指定剂量的强力霉素诱导。在指定时间通过qRT-PCR监测指定转录物的表达。e（电子）-g、。IMR90 ER:RAS表达TRE-FLAG-ZFP36L1^静音（或空向量）进一步感染了编码p21编码序列的向量（或空矢量）。用4OHT孵育6天后，ZFP36L1的表达^静音用200ng/ml多西环素诱导72h（e）。FLAG-ZFP36L1的表达^静音免疫印迹分析p21。数据代表3个独立实验（f）在添加4OHT后14天（添加多西环素后8天）通过CV染色评估对细胞增殖的影响。图像是4个独立实验的代表。（g） 通过qRT-PCR分析所示SASP成分的表达(n个=3个独立实验）小时。在衰老细胞中，mTOR信号通过4EBP1促进MK2的翻译。Ras激活触发信号级联，导致MK2磷酸化（通过p38MAPK）。一旦磷酸化，MK2磷酸化并灭活ZFP36L1。如果mTOR信号被阻止，MK2的转换将受到严重影响。因此，磷酸化MK2池不足以灭活ZFP36L1。激活时，ZFP36L1与许多SASP组件的3'UTR结合并促进其降解。使用双尾Student’st吨-测试，***P<0.001；**P<0.01*P<0.05；n.s，不重要。误差线代表平均值±标准差b-d、，数据代表了两个独立的实验。未处理的印迹原始扫描显示在补充图9。有关原始数据，请参阅补充表7.

ZFP36L1已被证明靶向CDKN1A mRNA（p21编码^CIP1级)⁴³事实上，ZFP36L1^静音OIS期间的诱导导致CDKN1A早期强烈下调，但其他CDKI（如p16^INK4a公司，图6d). 这可以解释ZFP36L1^静音拯救生长停滞。确定ZFP36L1的影响^静音在SASP上，我们表达了一个缺乏UTR的CDKN1A mRNA，它对ZFP36L1具有抵抗力^静音–介导的下调。值得注意的是，p21的恢复^CIP1级水平降低了ZFP36L1的能力^静音挽救衰老表型(图6e-f，补充图S6e-f)但不是它下调SASP的能力(图6g). 因此，ZFP36L1^静音作为涉及mTOR、4EBP1和MAPKAPK2的直接途径的一部分调节SASP(图6h).

mTOR/ZFP36L1通路控制SASP的促肿瘤作用

由于抑制mTOR仅抑制SASP成分的一个子集，因此我们从其促肿瘤能力开始，研究这是否足以影响衰老的旁分泌效应。衰老成纤维细胞的SASP可以促进EMT，增加上皮癌细胞的致瘤潜能^三，5虽然衰老成纤维细胞条件培养液（CM）在T47D乳腺癌细胞中诱导EMT，但mTOR被耗尽或抑制的IMR90 ER:RAS的CM没有(图7a，补充图S7a-b). 通过表达4EBP1 DN或ZFP36L1也观察到类似的结果^静音(图7a). 重要的是，表达ZFP36L1的细胞的CM^静音非降解CDKN1A也不能促进EMT(补充图S7c). 类似地，尽管经历辐射诱导衰老的成纤维细胞CM增强了鳞癌5PT细胞系、mTOR水平降低的成纤维纤维细胞或表达ZFP36L1的成纤维母细胞的侵袭性^静音没有这么做的能力(图7b). 在裸鼠体内，将5PT癌细胞与辐照过的衰老成纤维细胞联合注射可导致肿瘤生长增加(图7c). 相反，与表达ZFP36L1的辐照成纤维细胞联合注射^静音或针对mTOR的shRNAs未能促进肿瘤生长(图7c).

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图7

mTOR/ZFP36L1通路调节SASP的促肿瘤作用

a。对于方案中所示的所有条件（左上图），在4OHT诱导7天后收集IMR90 ER:RAS的条件培养基（CM）。乳腺上皮性肿瘤T47D细胞在该CM中培养，48小时后通过IF监测E-Cadherin的表达n个=4个独立实验。显示了归一化强度值的折叠变化（底部）和代表性图片（顶部）。执行学生的T检验，将所示细胞与其各自的对照进行比较。***P<0.001；**P＜0.01；不另作说明，不重要。比例尺，40μm。b条mTOR敲除和ZFP36L1的表达^静音防止CM从衰老细胞诱导肿瘤细胞侵袭的能力。用所示质粒感染HFFF2成纤维细胞并进行照射（5Gy）。8天后收集条件培养基，测试其诱导5PT鳞癌细胞侵袭的能力。数据为平均值±标准差n个=4个独立实验（shMTOR）和n个=7个独立实验（ZFP36L1^{重量/静音}) . 进行Student的T检验，将指示条件与对照进行比较。***P<0.001；*P<0.05；不另作说明，不重要。c。mTOR敲除和ZFP36L1的表达^静音减弱SASP的原癌作用体内试验。将感染了指定载体的辐照（衰老）或未辐照（非衰老）HFFF2成纤维细胞与部分免疫功能受损的5PT鳞癌细胞共同注射抹布1^−/−老鼠。5-6周后测量肿瘤体积。Student的T检验用于比较注射有辐射和无辐射成纤维细胞的小鼠在每种情况下的表现。n个=每组5只小鼠。给出的数据为平均值±标准差***P<0.001；*P<0.05；不另作说明，不重要。有关原始数据，请参阅补充表7.

化学化合物和处理

药物筛选中使用的化合物和浓度总结如下补充表S4除非另有说明，否则在诱导当天或照射后立即添加10nM雷帕霉素（Tocris）、25nM Torin1（Tocrus）、0.5nM NVPBEZ-235（LC实验室）和100nM MK2抑制剂III（Calbiochem）以及125nM 4-羟基他莫西芬（4OHT）。在复制衰老实验中，细胞在分析前处理1周。在所有病例中，每48小时重新添加一次药物。

质粒

pLNC-ER:RAS已在前面描述^7，MSC病毒GFP-4EBP1-4A（4EBP1-DN）从Hans-Guido Wendel（MSKCC，NY）获得，随后在MSCVpuro逆转录病毒载体中亚克隆。Genscript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）合成了pBabepuro ZFP36L1wt、Flag-ZFP36L1wt、ZFP36L 1Mut、Flage-ZFP365L2wt、Flag-TTPwt和Flag-TTPmut。为了产生强力霉素诱导的Flag-ZFP36L1Mut转基因，我们从pBabepuro Flag-Z FP36L1 Mut中进行PCR扩增，以包括BstBI和XbaI限制位点（Fw:5-CGTTCGAAGCCATGGACTACAAGAGCG-3′，Rv:5-GCTCTAGGCTTTAGTCATCTGAGAGAGAAGTC-3′），然后我们将其亚克隆到修改的pLenti CMVtight eGFP Puro（w771-1）从Addgene获得。基于pGIPZ的靶向mTOR的shRNA载体来自SIGMA。使用MSCVpuro p21 CDS作为模板（Fw:CGGATCCGCCATGTCAGAACCGGCT，Rv:GCGTCGACGGCTTAGGGCTCCTCTTG）PCR扩增p21编码序列，并亚克隆到pWZLBlast主链中。对于ZFP36L1和MAPKAPK2 miR-E shRNAs的从头生成，97-mer寡核苷酸编码各自的shRNAs⁴⁸用引物miRE-Xho-fw和miRE-EcoOligo-rev进行PCR扩增，并克隆到pRRL慢病毒载体中。使用的RNAi序列列于补充表S5b.

BrdU掺入、结晶紫染色和衰老相关β-半乳糖苷酶染色

这些方法以前曾在其他地方描述过^{6，46，47，49}.

条件培养基（CM）

指示的电池（2.5×10⁶)在10cm培养皿中播种，并在含有0.5%FBS的DMEM中用125 nM 4OHT培养7天。然后收集CM，在4000 g下离心，并通过0.2μm孔过滤器过滤。将所得CM与DMEM 40%FBS按3:1的比例混合，生成含有10%FBS的CM。当从用化合物处理的细胞中收集CM时，将细胞与药物孵育至第4天，此时，用PBS彻底清洗细胞并更换培养基。细胞在接下来的3天内保持无药物状态，直到CM收集。

基因表达分析

使用Trizol试剂（Invitrogen）和RNeasy分离试剂盒（Qiagen）提取总RNA。使用SuperScript II逆转录酶（Invitrogen）、dNTP和随机六聚体生成DNA。PCR反应在实时PCR检测系统（BioRad）中进行，使用Power SYBR Green Master Mix或TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems）。表达归一化为核糖体蛋白S14(RPS14型)在人类细胞提取物和小鼠组织中表达18S核糖体RNA或GAPDH。使用的引物组和TaqMan探针列于补充表S5a对小鼠组织样品进行称重并在液氮中研磨成细粉末。然后按照上述方法提取和处理RNA。

RNA-Seq号

根据制造商的协议，使用Illumina Truseq mRNA链文库制备试剂盒（Illuminia Inc.San Diego，USA）从500 ng总RNA中制备RNA-Seq文库。在生物分析仪HS DNA芯片上检查文库质量，并通过Qubit测量估计浓度。文库以等摩尔数量汇集，并使用配对末端100 bp读取在Hiseq2500上进行测序。每个样本至少有4000万个通过过滤器的读数，并使用标准程序进行处理。

侵入性分析

Transwell侵入试验使用8μm孔径的聚碳酸酯Transwell过滤器（Costar）进行，该过滤器涂有在α-MEM中以1:2稀释的Matrigel。迁移到下腔的细胞在上腔电镀3天后进行胰蛋白酶消化，并在Casy计数器（德国Sharfe System GmbH）上计数。

免疫荧光和高含量分析

如前所述执行IF⁵⁰使用中列出的抗体和稀释液补充表S6使用自动高通量显微镜（IN Cell Analyzer 2000，GE Healthcare）进行图像采集。每个样品每重复至少采集1000个细胞。如其他地方所述，使用IN Cell Investigator软件（3.2版；GE Healthcare）进行高含量分析（HCA）^{6，47，50，51}简单地说，细胞核的DAPI染色用于识别细胞。使用top-hat分割法分割细胞核，指定最小细胞核面积为100μm²为了确定细胞面积，使用衣领分割方法，在DAPI染色周围有1μm的边界，或者使用多尺度top-hat检测给定染色的细胞质强度。每个细胞都被分配了所研究的特定蛋白质的核强度值（以及适用时的细胞强度值）。生成样本中所有细胞强度值的直方图，用于设置阈值过滤器，以确定阳性和阴性表达细胞。或者，通过将二级抗体的强度（背景强度）减去原始强度值，获得给定染色的标准化强度值。使用归一化强度值计算不同条件下褶皱的变化。误差线和P值来自独立的生物复制。分析中使用的抗体经稳健对照（shRNAs、过度表达或药物抑制）验证，以评估其特异性。使用GraphPad软件Prism®（6.0b版）对IF数据进行统计分析。

从头开始蛋白质合成实验

根据制造商的协议，使用Click-iT 2-氨基-6-羟基氨基嘌呤（AHA）Alexa Fluor 488蛋白质合成HCS分析（Invitrogen）检测全局蛋白质合成。简单地说，IRM90 ER:RAS细胞在没有或存在4OHT的情况下生长7天，然后用指示的药物预处理2小时（最后30分钟在无L-蛋氨酸的培养基中，以耗尽蛋氨酸储备）。此时，介质中添加了100μM Click-iT标记的AHA。30分钟后清洗细胞并固定。在用Click-iT-reactive Alexa Fluor 488染料和DAPI染色孵育后，按照前面描述的方法采集图像并进行分析，以进行免疫荧光和高含量分析。通过从原始强度值中减去未在AHA存在下生长的细胞（但用Click-iT-reactive Alexa Fluor 488染料培养的细胞）的强度值，获得所代表的强度值。为了分析特定蛋白质的新生合成，我们还使用Click-iT AHA。（Invitrogen）IMR90 ER:RAS细胞用4OHT培养7天，然后用250 nM Torin1、10μg/ml CHX或DMSO预处理2小时（最后30分钟在无L-蛋氨酸的培养基中，以耗尽蛋氨酸储备）。此时将50μM AHA添加到培养基中，并将细胞保存在培养基中4h，然后立即在1%SDS、50mM Tris-HCl缓冲液中溶解。量化后，根据制造商的协议，使用Click-iT蛋白质分析检测试剂盒（生物素-炔烃）处理每种条件下600μg的蛋白质。将AHA生物素化后的样品装入Sephadex SpinTrap G-25柱（GE Helathcare），以去除游离生物素。然后，将样品稀释至0.5%SDS，并进一步用链霉亲和素珠进行免疫沉淀，以纯化生物素化的(从头开始合成）蛋白质。样品用Laemli缓冲液洗脱并进行Western Blotting。作为对照，我们使用了未处理细胞的提取物，其中包含AHA，但未与生物素炔烃孵育。

辐照

为了通过电离辐射诱导SASP诱导，对指示的细胞进行γ辐照（5Gy），并在指示的时间进行分析。

免疫印迹

如前所述对细胞系的蛋白质提取物进行处理和分析⁴⁷组织被移除并在添加了完整蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂（1 mM原钒酸钠、5 mM氟化钠和2 mMβ-甘油磷酸）的裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1%w/v Triton X-100）中均质。使用的抗体和稀释液列于补充表S6对-ZFP36L1^S203型抗体之前已经描述过⁴¹使用ImageJ定量免疫印迹。

多聚体中mRNA分布的分析

IMR90 ER:RAS成纤维细胞（10⁶)在10厘米的培养皿（16个培养皿）中播种，并用125 nM 4OHT培养6天。然后用载体（8个平板）或250 nM Torin1（8个板子）处理细胞2小时10分钟，然后裂解，用100μg/ml环己酰胺处理细胞，在4°C下用冰镇PBS加100μg/ml环己酰胺洗涤，然后在多聚体裂解缓冲液（0.3 M NaCl，15 mM MgCl）中裂解₂，15 mM Tris-HCl（pH 7.6），1%Triton X-100，0.1 U/μL RNAsin（Promega），100μg/ml环己酰胺，1μg/ml肝素，）在4°C下。在4°C下以10000 rpm离心细胞10 min，所得上清液分层于5 mL连续蔗糖梯度上（在0.3M NaCl中加入15-50%蔗糖，在15 mM MgCl中添加蔗糖_2,15 mM Tris-HCl（pH 8）、100μg/ml环己酰胺、1μg/ml肝素、0.1 U/μL RNA酶）。梯度在4°C的SW41-Ti转子中以39000 rpm离心2小时，然后使用Teledyne ISCO密度梯度分馏系统在254 nm处进行连续监测。收集0.5 mL组分（每个样品20个组分），并用3体积的Trizol LS试剂（Invitrogen）萃取。将得到的20个组分（每个样品）合并成10个连续组分，并使用RNeasy分离试剂盒（Qiagen）提取RNA。按照上述方法制备cDNA并进行PCR反应。每个部分中的mRNA数量以样本中总mRNA的百分比绘制。

分泌体特征

每个条件（4×10）将所示细胞接种在两个10 cm培养皿中⁶每皿细胞数）或125 nM 4OHT的无酚红DMEM（无FBS）。6天后，收集CM，在4000g下离心，并通过0.2um孔过滤器过滤。然后，使用维瓦斯宾20 5000 MWCO，通过5000g离心，通过超滤将产生的培养基CM浓缩约100-200次。在此阶段，通过Pierce 660 nm蛋白质分析试剂（Pierce 1861426）测定蛋白质浓度。将每个样品中100μg的蛋白质还原，分别用硫代苏糖醇和碘乙酰胺烷基化，然后在37°C下用固定化胰蛋白酶消化过夜。使用反相固相萃取（RP-SPE）脱盐样品，并使用含有0.1%甲酸的50%乙腈从色谱柱中洗脱胰蛋白酶肽。肽在高速真空离心机中冻干，然后在0.1%三氟乙酸中溶解，然后使用Ultimate 300 RSLC仪器自动加载到Acclaim PepMap 100捕集柱（100μm×2 cm）上。肽在Acclaim PepMap RSLC分析柱（75μm×25 cm）上分离，并直接洗脱到LTQ-Orbitrap Velosmass光谱仪（ThermoFisher）的纳米电喷雾源中。。使用5-15%流动相B（80%乙腈+0.1%甲酸；流动相a 98%水、2%乙腈、0.1%甲酸）的120分钟梯度进行分离。质谱仪在前10个CID采集的数据相关采集模式下运行。

磷蛋白质组分析

如前所述进行磷酸蛋白质组学⁵²经过一些修改⁵³3个10cm培养皿接种IMR90 ER:RAS细胞（2×10⁶每个板）。4OHT诱导7天后，在含有磷酸酶抑制剂的尿素裂解缓冲液（8 M尿素，20 mM HEPES）中对细胞进行裂解，稀释至<2M尿素后，在37°C下用固定化胰蛋白酶消化400μg蛋白质过夜。按照制造商的说明，使用RP-SPE在1cc Oasis卡式瓶（Waters Corp.）中对产生的肽进行脱盐，但肽洗脱使用1mL 2M乙醇酸、50%乙腈、5%三氟乙酸。用50μL TiO对洗脱后的肽进行加标₂（50%浆液），然后通过离心收集并用洗涤溶液（2M乙醇酸、50%乙腈、5%三氟乙酸）洗涤三次。从TiO中洗脱磷酸肽₂使用氢氧化铵并在高速真空离心机中干燥，直至分析。根据蛋白质组分析，样品通过纳米液相色谱溶解和分离，但采用10大MSA（多级活化）方法增加中性丢失磷酸蛋白质组数据采集的覆盖率。

蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据分析

使用马斯科特蒸馏器（v2.3.0）将原始文件转换为峰值列表（马斯科特通用格式），并使用马斯科服务器（v2.3.01）根据SwissProt Uniprot数据库（2012_03_10）搜索，该数据库仅限于相关分类法。MS扫描耐受性的质量窗口为10 ppm，MS/MS为600 mmu。允许半胱氨酸的氨基甲酰化固定修饰和蛋氨酸和谷氨酰胺氧化为焦谷氨酸转化的可变修饰。对于磷酸蛋白质组数据，还包括磷酸（S/T/Y）的其他变量修饰。吉祥物结果文件使用内部编写的Perl脚本进行解析，该脚本使用Matrix Science提供的吉祥物解析器文件。接受肽作为阳性鉴定的阈值设定为0.05分。然后，Pescal被用于自动构建实验中识别的所有肽的XIC，如前所述对所有样本进行比较^25，54通过将每个肽强度除以样品内所有肽强度的总和来对数据进行归一化。通过平均样品组内肽的归一化强度并除以对照组，计算折叠变化。在使用非配对t检验计算显著性之前，对折叠变化进行对数转换。使用Benjamini-Hochberg程序对多重测试的结果p值进行校正。

激酶底物富集分析

KSEA的执行如前所述³³简单地说，用VBA编写的脚本用于将已识别的磷酸化位点链接到磷酸化位点数据库中列出的那些位点⁵⁵并通过将所有折叠变化的平均值减去属于预定义激酶底物基团的平均值来计算富集值。使用Z检验计算富集显著性。

热图和ARE得分

分泌蛋白的鉴定如前所述⁶仅对RAS表达细胞中增加的分泌因子进行了进一步分析。然后使用R中的“标度”函数对蛋白质测量值进行平均归一化，并使用多实验查看器（MeV）将其视为热图。使用排列测试计算观察到的ARE核的显著性。将观察到的ARE核平均值与置换生成的平均值分布进行比较（置换数=100000）。p值估计为模拟平均值的相对频率大于该组观察到的平均are得分。通过超几何检验计算组间重叠的显著性。

体内肝细胞衰老实验

制备5 mg/ml雷帕霉素100%乙醇原液。该储备溶液首先在无菌10%PEG400/8%乙醇和等量无菌10%吐温80中稀释，最终浓度为10mg/100ml。雷帕霉素（1mg/kg）每3天口服一次。治疗从第−3天或+3天开始，一直持续到动物被神圣化。第0天尾静脉注射转座子型Nras表达质粒和睡眠美人13转座子表达质粒⁴⁴已执行。在第3、6、9或12天（取决于实验），处死动物并收集肝脏。样品固定并进行IHC/IF分析。简言之，石蜡切片脱蜡后，将玻片封住，在8°C下与一级抗体孵育过夜，清洗，在室温下与适当的二级抗体培养1小时，清洗，安装并密封。在每个小鼠肝脏的两个肝切片上对五个高倍视野进行计数（200X，每个视野>200个计数细胞）。没有使用统计方法预先确定样本量。对于所有动物实验，仅使用C57BL/6背景中的小鼠（随机组中的性别分布相等）。使用16-20周龄小鼠。对于在尾静脉注射流体动力之前用载体或雷帕霉素处理小鼠的实验，使用了14只载体处理的小鼠和13只雷帕霉素治疗的小鼠。在尾静脉注射水动力后3天用载体或雷帕霉素处理小鼠的实验中，每组使用4只小鼠（载体或雷巴霉素）。在实验和结果评估期间，研究人员并没有盲目地进行分配。所有小鼠均按照亥姆霍兹感染研究中心和汉诺威医学院的机构指南保持在无病原体条件下。实验已经得到德国法律当局的批准。

雷帕霉素治疗的老年小鼠样本

本项目中使用的老鼠之前有描述⁵⁶简而言之，所有小鼠都是UM-HET3，是CByB6F1母亲和C3D2F1父亲的后代。从9个月大开始，将包封的雷帕霉素以每百万分之14的剂量（根据非包封雷帕霉素的等效质量计算）注入小鼠体内。14 ppm的剂量先前已被证明可以在9个月或20个月大时开始延长寿命^21，57。本研究中使用的每个供体在被处死时均为22个月大。没有使用统计方法预先确定样本量。本报告仅分析了雌性小鼠的肝脏。小鼠被平等地随机分为不同的治疗组。在实验和结果评估期间，研究人员并没有盲目地进行分配。这些实验是按照国家老龄干预测试计划研究所和密歇根大学的指导方针进行的。

免疫组织化学

用所示抗体对肝脏切片（2μm）进行染色（固定在4%多聚甲醛和石蜡包埋中）。使用IVIEW DAB检测试剂盒（Ventana）或Bond MAX（徕卡），在NEXES免疫组织化学机器人（Ventana Instruments）上进行Ventna缓冲液培养和染色。为了量化染色，使用SCN400玻片扫描仪（徕卡）扫描玻片，并使用组织IA图像分析软件（徕卡Slidepath）进行分析。

我们感谢T.Rodríguez、A.Nebreda、R.Agami、M.Gaestel、D.Engelberg、G.Wendel、J Campisi、C.Moroni、C.Speck、A.Day和G.Peters为本项目提供的试剂、有益的意见和贡献。R.Miller由NIH Grant U01-AG022303资助。来自MRC的核心支持资助了J.Gil实验室的研究。N Herranz获得了EMBO奖学金的资助。