几种分子途径限制了不同物种的寿命1包括受TOR（雷帕霉素靶点）激酶调控的蛋白。TOR感应营养和生长信号；高TOR活性有利于身体生长并限制寿命，而低TOR活性则有利于长寿2，三雷帕霉素特异性抑制哺乳动物TOR（MTOR）复合物MTORC1的活性，MTORC1调节信使RNA翻译2最近的研究表明，它可以延长小鼠的寿命4为了了解MTOR是如何调节寿命的，我们探讨了它在调节细胞衰老中的作用。细胞衰老通过阻止有恶性转化风险的细胞增殖来抑制癌症5衰老细胞随着年龄增长而积累，并表达复杂的衰老相关分泌表型（SASP）。SASP可以改变组织微环境6–11导致与年龄相关的疾病，具有讽刺意味的是，包括癌症8，12–16.
癌症的发病率随年龄呈指数增长，因此对许多复杂生物体的寿命构成了重大挑战。大多数与年龄有关的疾病通常会导致细胞和组织退化和功能丧失，而与之不同的是，癌细胞必须获得不同的功能，尽管是异常的，才能发展成致命的疾病。年龄相关性癌症和退化之间的一个联系可能是衰老细胞中MTOR驱动的炎症环境。
持续的炎症可导致或促成退行性疾病和癌症17–20此外，衰老组织的一个共同特征是低度慢性炎症，称为炎症显像21炎症的来源尚不清楚。它可能部分源于随着年龄的增长免疫稳态的下降21，22它也可能部分来源于衰老细胞，这些细胞在衰老组织中的频率越来越高23，24.
许多有丝分裂活性的细胞在DNA损伤、染色质破坏和强烈的有丝分裂信号（例如，由激活的癌基因提供的信号）等挑战后会产生衰老反应5，25除了由p53（也称为TP53）和p16驱动的永久性细胞周期阻滞外INK4a公司（也称为CDKN2A）肿瘤抑制剂26，衰老细胞的一个主要特征是分泌细胞因子、生长因子和蛋白酶6，7，9，10，14，27–33称为衰老相关分泌表型8，9（SASP）。
SASP在人和小鼠之间保守，包括炎症细胞因子，如白细胞介素（IL）6和IL8（也称为CXCL8）（参考文献6，8–10). SASP可以破坏正常组织结构和功能，并促进邻近细胞的恶性表型7，8，13，14，34此外，衰老细胞可以促进小鼠肿瘤生长8，13，14随着衰老细胞的增加35–37以及退行性和增生性病理部位38–46，SASP可能会助长煽动23，24，47此外，DNA损伤化学疗法可以在正常细胞和肿瘤细胞、培养细胞和体内9，30，33，48–50可能会加剧继发癌的发展和化疗的一些副作用。
我们的研究结果表明，MTOR驱动SASP，雷帕霉素通过靶向上游SASP调节器部分抑制SASP及其促进肿瘤生长的能力11IL1A，用于翻译抑制。因此，雷帕霉素衍生物（rapaloges）治疗的候选肿瘤可能不太包括那些增殖指数高的肿瘤，但那些DNA损伤信号和炎症高的肿瘤以及雷帕霉素可能会改善基因毒性化学疗法的炎症副作用。
结果
雷帕霉素降低SASP
为了验证MTOR活性与SASP相关的观点，我们将衰老的人类细胞暴露于选择性MTORC1复合抑制剂雷帕霉素。然后我们评估了促炎细胞因子IL6的分泌，IL6是小鼠和人类细胞中SASP的主要成分8，9酶联免疫吸附试验（ELISA）。
雷帕霉素显著降低3株正常人成纤维细胞（HCA2新生儿包皮、，; WI-38胎儿肺和PSC27成人前列腺，补充图1A)和2株永生但非肿瘤来源的人类乳腺上皮细胞系（MCF-10A和184A1，补充图1A)-均通过电离辐射（10Gy X射线照射）诱导衰老。这种减少具有剂量依赖性，在<10 nM时达到约80%的最大抑制(). 我们在随后的实验中使用了12.5 nM雷帕霉素。
雷帕霉素通过MTORC1降低SASP。(一)电离辐射暴露后，立即用指定浓度的雷帕霉素（Rapa；或作为对照的最高浓度的二甲基亚砜）处理非基因（NS）或电离辐射诱导衰老（IR；10 Gy）的HCA2成纤维细胞。7天后收集条件培养基，并通过ELISA分析IL6。非基因细胞分泌IL6的水平被任意设置为1。(b条)通过慢病毒介导的RAS或MKK6EE、2 mM丁酸钠（NaBu）3天、复制衰竭（Rep）或250 nM阿霉素24小时的过度表达（Doxo）诱导HCA2细胞衰老。治疗后给细胞注射12.5 nM雷帕霉素或二甲基亚砜（对照）。7天后收集条件培养基，并通过ELISA分析IL6。(c（c）)用抗体阵列分析非新生（NS）或衰老（电离辐射；Sen（IR））细胞经雷帕霉素或二甲基亚砜处理6天的条件培养基。使用DMSO处理细胞的平均信号作为基线。颜色强度表示对数2-折叠基线中的更改。高于基线的信号以黄色显示；低于基线的信号以蓝色显示。显示的是三个独立实验的平均值。(d日)两种不同的雷帕霉素治疗方案对衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞IL6分泌的影响，一种在照射后立即开始（d0）并持续13天，另一种在辐照后7天开始并继续6天。(e、 （f）)用二甲基亚砜或雷帕霉素处理衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞，并对DNA-SCAR标记物53BP1进行免疫染色。使用CellProfiler确定53BP1病灶的数量。所示为病灶>2 53BP1的细胞百分比(e（电子）)，以及每个细胞的平均焦点数(（f）). 显示NS细胞以进行比较。对于所有面板，除了c（c），所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份样品。有关原始数据，请参阅补充表4.
雷帕霉素还抑制其他刺激诱导衰老的人成纤维细胞分泌IL6()：致癌RASV12的异位表达（参考。51)，应激激活的p38MAPK激活剂MKK6EE（参考。15)，丁酸钠52，复制耗尽（另请参阅补充图1AIMR-90胎儿肺成纤维细胞）和阿霉素。在非基因成纤维细胞中，雷帕霉素轻度抑制IL6的低基础分泌(补充图1B).
为了确定雷帕霉素是否减少其他SASP因子的分泌，我们使用抗体阵列测量了120个分泌蛋白的水平。在阵列检测到的因子中，与增殖或静止的细胞相比，衰老时分泌的因子明显更高，雷帕霉素减少了12/34（35%）的分泌，包括几种促炎细胞因子、趋化因子和生长因子(). 几个SASP蛋白未受影响，表明雷帕霉素是一种选择性SASP调节剂。值得注意的是，所有雷帕霉素敏感的SASP因子之前都被确定为NF-κB（B细胞中κ轻多肽基因增强子的核因子）转录因子的靶点15.
在培养中，一旦细胞经历衰老诱导刺激，SASP需要4-5天才能发育9，53雷帕霉素不仅在同步衰老刺激（如电离辐射）后立即添加，而且还降低了IL6的分泌()SASP完全发育后（例如电离辐射诱导衰老后7天；). 因此，雷帕霉素抑制SASP的建立和维持。
SASP的维持需要持续的DNA-损伤反应（DDR）信号，该信号来自稳定的核病灶，称为DNA-SCARS（染色质改变增强衰老的DNA片段）53，54为了测试雷帕霉素通过干扰DDR信号抑制SASP的可能性，我们评估了其对持续53BP1病灶的影响，这是DNA-SCARS的一个特征(). 雷帕霉素没有显著改变衰老HCA2中53BP1病灶的数量()或PSC27细胞(补充图1C、D)表明其作用于DDR信号的下游。
为了证实雷帕霉素对SASP的影响是MTOR依赖性的，我们使用短发夹RNA（shRNA）耗尽MTORC1组分猛禽（也称为RPTOR）的细胞。shRNA对抗猛禽，但不对抗GFP（对照；补充图2A)，衰老细胞严重抑制IL6分泌(). 同样，shRNA介导的MTOR耗竭使衰老相关的IL6分泌减少了90%以上(和补充图2B).
SASP生产依赖于MTOR。(一)HCA2细胞感染表达GFP shRNA的慢病毒（对照）或三种不同的靶向猛禽的shRNA之一。然后照射细胞；7天后，收集条件培养基并用ELISA分析IL6。(b条)HCA2细胞感染表达GFP shRNA的慢病毒（对照）或三种不同靶向MTOR的shRNA之一。然后照射细胞；7天后，收集条件培养基并用ELISA分析IL6。(c（c）)在PSC27细胞的条件培养基中，通过ELISA定量IL8，其中S6K被siRNA耗尽，或4EBP1通过转染4EBP1-编码质粒过度表达。显示用雷帕霉素（Rapa）处理的细胞进行比较。(d日)在电离辐射诱导衰老后，通过western blotting分析转染S6K siRNA或trans-4EBP1或雷帕霉素处理的PSC27细胞的蛋白提取物中指示的SASP因子。未处理的斑点原始扫描如所示补充图9(e（电子）)通过western blotting分析非基因（NS）或衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞（经雷帕霉素处理或未经处理）的提取物中的指示蛋白质。β-actin作为负荷控制。未处理的斑点原始扫描如所示补充图9。对于一–c（c），所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份样品。对于d日和e（电子）所示为两个独立生物复制的一个代表；每个复制都需要同时检测多个杂交位点。有关原始数据，请参阅补充表4.
ELISA证实雷帕霉素抑制了另一种显著的SASP成分IL8的分泌()，由衰老细胞(). 同样，shRNA-介导的MTORC1靶点S6K（也称为RPS6KB）的缺失，其磷酸化刺激翻译，以及MTORC1目标4EBP1（也称为EIF4 EBP1）的过度表达，其磷酸化可缓解翻译抑制，抑制IL8分泌(). 此外，western blot分析表明S6K1缺失或4EBP1过度表达显著降低了几种SASP蛋白的表达(). 与4EBP1臂相比，雷帕霉素更有效地抑制MTOR通路的S6K臂55; 然而，结合S6K缺失和4EBP1过度表达的加性效应表明，MTOR的4EBP1-臂也可以被用来降低SASP(). 在协议中，ATP-竞争性MTOR抑制剂PP242（参考。56)比雷帕霉素更有力地抑制SASP(补充图2C).
S6K和4EBP1在驱动SASP中的积极作用表明，SASP可能在mRNA结构水平上受到翻译调控。EIF4A1解旋酶对分解稳定的二级mRNA结构很重要，受EIF4B和EIF4E调节，后者又受磷酸化调节57，58Western blot分析表明，雷帕霉素降低了EIF4B磷酸化，增加了EIF4 E磷酸化(). 此外，尽管ERK（也称为MAPK1）和S6K都是EIF4B的上游，但雷帕霉素仅降低S6K磷酸化。雷帕霉素还部分降低了4EBP1磷酸化，可能隔离EIF4E。总之，这些结果表明雷帕霉素破坏了衰老细胞中的解旋酶机制，导致具有稳定二级结构的mRNA翻译减少。
雷帕霉素通过减少IL1A的产生降低NF-κB活性
尽管MTORC1主要调节翻译，但大多数SASP蛋白在mRNA丰度水平上调6–10令人惊讶的是，定量PCR（qPCR）显示雷帕霉素降低了衰老HCA2细胞中六种雷帕霉素敏感SASP蛋白的转录水平()在衰老的PSC27细胞中有10个这样的转录物(补充图3A). 编码两种雷帕霉素不敏感蛋白和两种非SASP分泌蛋白的mRNA未受影响，表明雷帕霉素不会不加区别地减少编码分泌蛋白的转录物。重要的是，雷帕霉素在电离辐射暴露后的第2天就降低了mRNA水平()这表明它在SASP开发的早期起作用。
雷帕霉素抑制NF-κB转录活性。(一)二甲基亚砜或雷帕霉素（Rapa）处理的衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞在电离辐射照射8天后通过qPCR定量SASP因子的转录。在不含雷帕霉素的无血清培养基中培养细胞24小时。对于热图，使用来自非新生（NS）、衰老（电离辐射；Sen（IR））DMSO和雷帕霉素处理的HCA2细胞的平均信号作为基线（有关数字，请参阅补充表1). 颜色强度表示对数2-折叠基线中的更改。高于基线的信号以黄色显示；低于基线的信号以蓝色显示。(b条)二甲基亚砜或雷帕霉素处理的衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞的SASP因子转录物在电离辐射暴露2天后通过qPCR定量。对于热图，使用非基因、衰老的DMSO和雷帕霉素处理的细胞的平均信号作为基线（有关数字，请参阅补充表2). 颜色强度表示对数2-从基线开始的折叠变化。高于基线的信号以黄色显示；低于基线的信号以蓝色显示。(c（c）)从表达NF-κB-荧光素酶报告子结构的非新生（NS）和衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞制备细胞提取物。用二甲基亚砜（对照）或雷帕霉素处理细胞7天，并如前所述分析荧光素酶活性11，15。非新生荧光素酶活性设置为1。对于一和b条，显示了三个独立实验的平均值。对于c（c），所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份样品。有关原始数据，请参阅补充表4.
由于NF-κB刺激许多SASP基因的转录6，11，15，我们测试了雷帕霉素降低衰老细胞NF-κB活性的可能性。我们用携带NF-κB荧光素酶报告子的慢病毒感染HCA2细胞，并测量雷帕霉素对报告子活性的影响。雷帕霉素使NF-κB活性降低约80%(和补充图3B). 由于雷帕霉素主要通过抑制MTORC1来抑制翻译，这些结果表明雷帕霉素通过间接机制抑制NF-κB活性和SASP mRNA。
关于雷帕霉素如何调节SASP基因转录的线索来自于它对mRNA水平的影响的一个显著例外：编码促炎细胞因子IL1A的mRNA仅受到雷帕霉素的轻微影响(和补充图3A).
NF-κB和IL1A组成一个正反馈环，最终刺激编码炎症细胞因子的几个基因的转录24IL1A与细胞表面结合，不由衰老细胞分泌；然而，它在衰老细胞表面的丰度显著增加，在建立和维持SASP中起着关键作用（参考文献。11). 雷帕霉素，尽管在IL1A级转录水平，显著降低衰老细胞表面IL1A蛋白水平(和补充图4A). 最后，shRNA-介导的衰老细胞IL1A缺失抑制IL6分泌，类似于雷帕霉素引起的抑制(和补充图4B). 因此，MTORC1抑制似乎通过干扰IL1A-NF-κB反馈回路来抑制选定SASP成分的分泌。
雷帕霉素抑制IL1A信号。(一)HCA2细胞被表达针对GFP（对照）或猛禽shRNAs的慢病毒感染。用FITC-标记抗体通过流式细胞术分析电离辐射暴露后用雷帕霉素（Rapa）或二甲基亚砜处理10天的衰老（电离辐射；Sen（IR））细胞的细胞表面IL1A。荧光信号被前向散射信号分割，以解释细胞大小的变化；记录10000例流式细胞术事件。所示为两个独立实验之一的结果。(b条)HCA2细胞感染表达GFP shRNA的慢病毒或IL1A级shRNA经二甲基亚砜（D）或雷帕霉素（R）照射后处理；7天后收集条件培养基并用ELISA分析IL6。(c（c）)从二甲基亚砜和雷帕霉素处理的衰老细胞中提取蛋白质，并在电离辐射暴露后的指定时间间隔内通过免疫印迹分析IRAK1、IκBα、磷酸化S6和S6。将重组（r）IL1A蛋白添加到用雷帕霉素（右车道）处理的衰老（电离辐射）样品中。未处理的斑点原始扫描如所示补充图9所示为两个独立的生物复制体之一；每个复制都需要多个印迹，同时对其进行探测。(d日)用二甲基亚砜或雷帕霉素处理非新生（NS）和衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞6 d，然后在无血清培养基中添加rIL1A 24 h。收集条件培养基并用ELISA分析IL6。对于b条和d日，所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份样品。有关原始数据，请参阅补充表4.
与这个想法一致，雷帕霉素降低了衰老细胞中的IL1A信号。IL1A以并列方式结合其细胞表面受体（IL1R1），启动信号级联反应，最终降解IRAK1（白细胞介素-1受体相关激酶1）和IκBα（也称为NFKBIA，B细胞抑制剂α的κ轻多肽基因增强子的核因子），使NF-κB核转位24我们分析了在没有或存在雷帕霉素的情况下电离辐射衰老的细胞中IRAK1和IκBα蛋白水平。在没有雷帕霉素的情况下，电离辐射降低了IRAK1和IκBα，表明IL1R1信号传导活跃()，如预期11在雷帕霉素的存在下，IRAK1和IκBα蛋白水平保持升高()，表示IL1R1信号阻塞。在雷帕霉素处理的细胞中，添加重组IL1A（rIL1A）挽救了IL1R1信号传导和IL6分泌(). 因此，雷帕霉素作用于IL1R1的上游，IL1R1下游的信号通路保持完整。此外，核糖体蛋白S6（S6K的底物）的磷酸化在rIL1A处理下保持较低水平，表明rIL1A恢复IL6分泌不是由于MTORC1活性的重新激活().
雷帕霉素通过抑制IL1A翻译调节SASP
由于雷帕霉素降低细胞表面结合的IL1A水平和随后的IL1R1信号，导致NF-κB降低SASP基因转录，IL1A可能是雷帕霉素抑制翻译的关键靶点。为了测试这种可能性，我们使用多糖体分馏测定了mRNA翻译效率，该分馏测量了与多核糖体相关的mRNA的比例。雷帕霉素显著降低了第1a类信使核糖核酸()，在较小程度上IL1B、IL6和IL8号机组mRNA(和补充图5A、B)，在衰老细胞中。相反，它对编码MCP-4（单核细胞趋化蛋白-4/CCL13）的mRNA的翻译效率几乎没有影响，而MCP-4的分泌对雷帕霉素不敏感()和α-微管蛋白（TUBA1A），一种非SASP基因(). 因此，雷帕霉素特异性地降低了翻译效率。
雷帕霉素抑制IL1A翻译。(一)用雷帕霉素（Rapa）或二甲基亚砜（DMSO）处理衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞7天，然后在无血清培养基中处理1天，然后收集细胞，并收集mRNA进行方法中所述的多聚体分析。对以下各组分进行qPCRIL1A、IL6、CCL13、TUBA1A、IL1B、IL8、TIMP1、IL3和IL5号机组mRNA（显示了一个有代表性的实验）。分数1-7：游离RNA；8–12:40–60S；13–20：多聚体。(b条)用于确定翻译分数的多聚体剖面；显示了代表性的多聚体痕迹。NS，非遗传。(c（c）)使用UCSC基因组浏览器序列，分析IL1A级该基因用于确定潜在的转录起始位点。(d日)潜在转录起始位点（TSS）及其5'UTR显示于各种来源，包括基于5'RACE的测定（参见c（c）). 转录起始位点序列以大写字母开始，嘧啶以红色显示(e（电子）)IL1A级mRNA最小自由能结构是使用从维也纳大学RNAfold网络服务获得的默认参数确定的(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNfold.cgi). 规模代表组织熵。检测到起始密码子上游存在高度稳定的结构。进行了一次5'比赛。对于一和b条所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份细胞培养样本。有关原始数据，请参阅补充表4.
MTORC1可以通过5'UTR末端寡嘧啶束调节翻译。生物信息学，加上克隆/cDNA末端的实验性5’快速扩增（RACE），确定了主要转录起始位点，但没有末端寡嘧啶序列()-在IL1A级信使核糖核酸。然而，结构预测揭示了起始密码子下游高度稳定的二级结构，这与高效翻译该mRNA对解旋酶活性的强烈要求一致(). 这一发现令人惊讶，因为解旋酶活性的翻译调控通常对5'UTR（参考57).
雷帕霉素不能逆转细胞衰老
雷帕霉素敏感的SASP组分IL6和IL8可以增强肿瘤诱导的衰老细胞的生长阻滞6，10雷帕霉素可以抑制某些永生细胞的衰老停滞59在这里使用的原始人类细胞中，雷帕霉素并没有逆转电离辐射引起的阻滞，也没有诱导增殖细胞的衰老阻滞。它确实降低了强烈表达衰老相关β-半乳糖苷酶的细胞百分比9，35（SA-β-半乳糖；和补充图6A)但在给予雷帕霉素28天和2周后（电离辐射照射后42天）计数时，衰老细胞的数量没有变化；). 同样，无论是在电离辐射暴露之前还是之后添加雷帕霉素，都不会改变衰老HCA2或PSC27细胞的低水平DNA合成或集落形成(和补充图6B、C). 此外，雷帕霉素不能阻止致癌RAS引起的阻滞().
雷帕霉素不能逆转细胞衰老。(一)用二甲基亚砜或雷帕霉素（Rapa）处理衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞6天，通过光学显微镜（右侧）和计数（左侧）测定表达SA-β-gal的细胞百分比。(b条)细胞在电离辐射照射后用雷帕霉素或二甲基亚砜处理28天，清洗，并在无药培养基中培养14天，然后测定细胞数量。(c（c）)HCA2细胞，非衰老（NS）或通过电离辐射暴露而衰老，并用DMSO或雷帕霉素处理6天，用BrdU脉冲24小时，并通过荧光显微镜测定掺入BrdU的部分。(d日)克隆形成实验比较了雷帕霉素或PP242（500 nM）慢性治疗对非新生（NS）和衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞的影响。在电离辐射暴露前后的指定时间，对细胞进行电镀并添加药物，并培养细胞10–14天（显示了一个代表性实验）。(e（电子）)HCA2细胞被携带致癌RAS的对照慢病毒（L3P）或慢病毒感染。细胞在药物中生长三天（急性），然后释放或连续治疗10–14天（慢性），然后进行克隆形成染色。(（f）)HCA2细胞与携带shRNAs的RAS和慢病毒共同感染，以耗尽指示蛋白。成绩单IL6（IL6）通过qPCR定量。(g、 小时)HCA2细胞被携带shRNAs的慢病毒感染，以耗尽指示的蛋白质。对致癌RAS诱导衰老的感染细胞进行克隆形成分析(克)或电离辐射(小时)（显示了一个具有代表性的实验）。(我)用携带抗GFP（对照）或猛禽shRNAs的慢病毒感染HCA2细胞，用10Gy电离辐射（IR）或250nM阿霉素（Doxo）诱导或不诱导（NS）衰老24小时，并用二甲基亚砜或雷帕霉素处理。细胞培养10–14天，并使用结晶紫进行克隆形成染色（显示了一个具有代表性的实验）。(j个)细胞被视为我诱导衰老7天后，收集条件培养液并用ELISA分析IL6。对于一–c、 （f）和j个所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份细胞培养样本。对于d、 e、g–我所示为一次重复的具有代表性的克隆形成实验。有关原始数据，请参阅补充表4.
尽管shRNA介导的IL6、RELA（NF-κB的一个亚单位）、IL1A或猛禽的耗竭都减少了IL6的分泌()，只有IL6耗竭部分阻止了RAS（但不是电离辐射）诱导的衰老生长停滞(). 同样，雷帕霉素或猛禽耗竭也不能逆转阿霉素诱导的衰老(和补充图6D). 因此，MTORC抑制抑制包括IL6和IL8在内的选定SASP因子的表达和分泌，但不干扰衰老生长停滞。虽然IL6和IL8的表达加强了肿瘤诱导的衰老阻滞6，10只有IL6的缺失，而不是RELA、IL1A或猛禽的缺失，阻止了RAS诱导的衰老停滞。这种现象的原因尚不清楚。我们推测，RELA、IL1A或猛禽耗竭不仅抑制IL6的表达，还抑制由衰老细胞表达和分泌的生长刺激因子的表达，如两性调节蛋白（AREG）和CXCL17，9这一假设尚未得到验证。最后，雷帕霉素不能阻止6Gy或8Gy电离辐射诱导HCA2细胞衰老生长停滞(补充图6E). 然而，在另一种初生新生儿包皮人成纤维细胞株BJ中，有一小部分（<1%）细胞在5 Gy时绕过了衰老阻滞，表明雷帕霉素阻止衰老生长阻滞的能力存在微小的细胞株差异(补充图6F).
雷帕霉素对分泌表型的持续作用
如果雷帕霉素通过阻止IL1A–NF-κB反馈回路的建立来抑制SASP，那么雷帕霉素的短暂治疗可能会在药物移除后的一段时间内抑制SASP。在培养基中，电离辐射后立即将HCA2细胞单次暴露于雷帕霉素24小时，7天后IL6分泌抑制约80%()，与连续治疗7天后出现的抑制相似(). 虽然雷帕霉素从培养基中去除后的延迟效应可能是由于细胞内滞留，但去除后2天和6天，细胞相关雷帕霉素分别下降了~80%和>90%(). 有趣的是，在S6磷酸化2的基础上，MTOR通路仍然受到部分抑制，在雷帕霉素去除6天后，抑制程度较小(). 然而，最终，循环被重新建立。雷帕霉素停药后IL6分泌抑制和SA-β-gal活性缓慢恢复，停药后3周达到未处理细胞水平().
雷帕霉素对SASP的持续作用。(一)电离辐射暴露后立即用雷帕霉素（Rapa）处理HCA2细胞1天，6天后收集条件培养基并通过ELISA分析IL6分泌；所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份细胞培养样本。(b条)急性治疗后1、3、7、15和31天（电离辐射暴露后立即单次1天剂量），测量非新生（NS）和衰老（电离辐射；Sen（IR））HCA2细胞中雷帕霉素的含量。雷帕霉素是由德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心生物精神病学实验室服务部采用高效液相色谱法测定的。收集了六份样品，并将其分为两组，每组两份。(c（c）)使用急性治疗后1、3、7和15天提取的蛋白质对磷酸化S6和S6进行蛋白质印迹分析（如一)HCA2细胞与雷帕霉素（显示一个或两个代表性实验）。未处理的印迹原始扫描显示在补充图9(d日)雷帕霉素治疗后第7、13、19和25天X射线照射（IR）衰老HCA2细胞分泌IL6，相对于非新生（NS）分泌；所示为两个独立实验的一个代表，每个实验都有三份细胞培养样本。(e（电子）)用二甲基亚砜和雷帕霉素处理后7天或25天，通过光学显微镜测定非衰老和衰老细胞中的SA-β-gal活性（显示了两个代表性独立实验中的一个代表性实验）。有关原始数据，请参阅补充表4.
我们认为雷帕霉素通过翻译抑制选择性地靶向SASP启动细胞因子IL1A，从而抑制激活NF-κB的信号级联的建立和许多编码SASP因子的基因的转录(补充图7).
雷帕霉素抑制衰老细胞刺激细胞增殖和肿瘤发生的能力体内
SASP因子可促进癌细胞增殖和培养中的其他恶性表型7–9，13值得注意的是，雷帕霉素显著降低了衰老PSC27细胞条件培养基对几个永生化、转化或转移前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭作用的刺激(和补充图8A). 此外，衰老的成纤维细胞可以通过癌前上皮细胞促进肿瘤形成，并且可以通过小鼠异种移植中的恶性上皮细胞刺激肿瘤生长8，13，14.确定MTOR对SASP致瘤作用的贡献体内我们移植了PC3前列腺肿瘤细胞，在培养基中加入或不加入电离辐射诱导衰老的PSC27成纤维细胞。在移植前，肿瘤细胞和成纤维细胞在培养基中用雷帕霉素或载体分别处理8天。皮下植入8周后，仅由PC3细胞组成的移植物平均直径为129 mm三雷帕霉素对肿瘤生长没有显著影响(; 比较车道1和2）。由肿瘤细胞和照射过的PSC27成纤维细胞组成的移植物大得多，平均589 mm三(通道1与通道5），而移植物由肿瘤细胞和经辐射的成纤维细胞与雷帕霉素联合治疗体外植入前平均296mm三（小49.7%；P（P）<0.01;，车道5对6；补充图8B、C).
雷帕霉素抑制衰老细胞的致瘤活性。(a、 b条)BPH1、M12和PC3前列腺癌细胞迁移百分比(一)和入侵(b条)通过与经雷帕霉素（Rapa）或载体（对照）处理的辐照PSC27成纤维细胞的条件培养基共培养确定。在两个实验中均使用人宫颈癌细胞系HeLa作为阳性对照。(c（c）)所示前列腺上皮细胞与来自PSC27人前列腺成纤维细胞的条件培养基孵育，非基因（NS）或辐射诱导衰老（Sen（IR）），未经处理或用雷帕霉素处理。3天后测定上皮细胞数量。(d日)PC3前列腺癌细胞皮下植入非新生（PSC27-NS）或衰老（电离辐射；PSC27-Sen（IR））前列腺成纤维细胞，这些成纤维细胞在DMSO或雷帕霉素培养基中预处理8天。按照方法（平均值±s.e.m。，n个=8只动物）。(e（电子）)在米托蒽醌暴露72小时后，用MTT法测定前列腺癌细胞的存活率50在来自用雷帕霉素或载体共同处理的非衰老（PSC27-NS）或衰老（PSC27-Sen（IR））PSC27成纤维细胞的条件培养基存在下，每个细胞系的剂量。(（f）)体内雷帕霉素对化疗耐药的影响通过向SCID小鼠体内注射PC3癌细胞（含或不含PSC27前列腺成纤维细胞），然后用米托蒽醌或载体治疗，再联合应用雷帕霉素或载体。在8周治疗期后测定肿瘤体积（平均值±s.e.m。，n个=10只动物）。对于一–c（c）和e（电子）所示为三个独立实验的一个代表，每个实验都有三份细胞培养样本。对于d日和（f），一个标准t吨-用于确定P（P）值。有关原始数据，请参阅补充表4.
SASP可以在基因毒性化疗后产生耐药性和肿瘤细胞存活率60为了确定雷帕霉素是否抑制SASP效应，我们测量了化疗药物米托蒽醌治疗后前列腺癌细胞的生存能力。我们用来自PSC27前列腺成纤维细胞的条件培养基培养经米托蒽醌处理的肿瘤细胞，该成纤维细胞在雷帕霉素存在或不存在的情况下通过电离辐射诱导衰老。来自衰老成纤维细胞的条件培养基显著减弱了米托蒽醌引起的前列腺癌细胞活性的丧失，当肿瘤细胞暴露于经雷帕霉素治疗的衰老成纤维组织的条件培养液中时，这种化学保护作用被取消(和补充图8A).
重要的是，雷帕霉素产生了耐药性体内我们将PC3细胞皮下注射到SCID小鼠体内，无论是否有老化（电离辐射诱导的）PSC27成纤维细胞。与中描述的实验相反，我们每两周用米托蒽醌治疗动物三次，而不是用分离细胞，每隔一天用或不用雷帕霉素。与单独使用米托蒽醌相比，雷帕霉素以无单药作用的剂量给药，可使PC3异种移植物的生长减少30%(，车道2与车道4）。这一结果可能归因于直接的肿瘤细胞效应和/或微环境因子的调节，包括SASP(和补充图8D–F). 重要的是，PC3细胞和共同注射的PSC27成纤维细胞产生的肿瘤大得多（与第1和第5栏相比），与单独使用米托蒽醌相比，联合使用雷帕霉素和米托蒽酮可使肿瘤生长减少49%(P（P）< 0.01;第6车道对第8车道；补充图8D–F).
讨论
我们的研究结果表明，雷帕霉素可能延缓衰老和延长寿命，包括通过选择性抑制SASP的机制抑制癌症进展。SASP是导致无菌炎症的有力候选药物，无菌炎症是衰老和许多与年龄相关的病理学的标志。此外，衰老细胞在基因毒性抗癌治疗后积累9，49，50，61从而可能导致或促成经常遵循此类疗法的治疗耐药性和癌症复发。我们发现SASP受MTOR途径调节，并被雷帕霉素抑制，这为制定合理策略以减少基因毒性暴露和正常衰老过程的有害影响提供了潜在的基础(补充图8G). 此外，我们的数据表明，减少SASP的干预措施不需要持续治疗；相反，间歇治疗可能会带来巨大的益处。
MTOR抑制剂在临床上用于防止器官移植排斥和再狭窄，并作为有前景的抗癌治疗62–64MTOR抑制剂被认为通过阻止TOR驱动的对营养物质和有丝分裂原的增殖反应而起作用。我们的数据表明另一种可能性，至少在哺乳动物中是这样的：MTOR抑制剂可能减少由衰老细胞和SASP引起的炎症。SASP包括有效的炎症细胞因子，如IL6、IL8和单核细胞趋化蛋白24，47，可以改变组织环境31，34也能吸引先天免疫细胞65值得注意的是，MTOR抑制已被证明可以延长不会自发致癌的物种（如线虫）以及自发致癌物种（如小鼠）的寿命66.
虽然雷帕霉素和其他MTOR抑制剂在器官移植患者的临床上用作免疫抑制剂（以减少T细胞成熟度），但它们最近被用作抗癌治疗的高级试验62–64，67雷帕霉素的免疫抑制作用可能局限于某些生理状态，因为它可以提高小鼠在某些感染中的生存能力68因此，免疫细胞和衰老细胞在分泌细胞因子和其他因子方面对MTOR抑制的反应可能不同。
总之，我们的研究发现，抑制SASP是雷帕霉素抑制包括癌症在内的年龄相关疾病的机制。了解如何控制SASP以及如何预防SASP，可以为制定合理的策略提供基础，以减少基因毒素暴露和正常衰老过程中的有害影响。
方法
细胞和细胞培养
成纤维细胞在DMEM和10%胎牛血清（FBS）中的3%氧气中培养，但PSC27除外，PSC27在PSC完全培养基（80%MCDB131（Invitrogen）中培养，补充10%FCS、非必需氨基酸、胰岛素、地塞米松、转铁蛋白、硒和20%AmnioMax（Life Technologies）），如前所述7，9人前列腺癌细胞系DU145、PC3和LNCaP是来源于前列腺癌转移的致瘤前列腺癌细胞株；细胞取自美国型培养物收集中心（ATTC），在RPMI 1640和5%FBS中培养。BPH1细胞是一种非肿瘤性上皮细胞系，来源于良性增生的非恶性前列腺组织，由SV40-LT抗原永生化，并在DMEM和10%FBS中进行培养，如前所述69M12人前列腺癌细胞来源于良性前列腺上皮，用SV40 T抗原永生化并传代体内生成转移性亚系M12。如前所述，在添加表皮生长因子（EGF）、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白和硒的RPMI 1640中培养M12细胞70永生化乳腺上皮细胞MCF-10A从ATTC中获得，在DMEM和10%FBS中培养，永生化乳房上皮细胞184A1从M.Stampfer（美国劳伦斯伯克利国家实验室）获得，在DMAM和10%FBS中培养（参考文献13，70). 根据来自Lonza的MycoAlert试剂盒的测定，所有细胞在实验之前和期间均无支原体。
试剂
靶向S6K的siRNA和编码靶向GFP、MTOR、猛禽和IL1A的shRNA的慢病毒是从开放生物系统获得的，如补充表14EBP1构建体是从GeneCopoire获得的（pReceiverM68-4EBP1）。用于免疫印迹的抗体在补充表4用于HCA2细胞免疫荧光的抗53BP1抗体来自Bethyl Laboratories（A300-272A），并以1:500稀释度使用；用于前列腺成纤维细胞免疫荧光的抗53BP1抗体来自Abcam（ab36823），并以1:500的稀释度使用。前列腺成纤维细胞使用的抗磷酸H2AX（S139）抗体来自Abcam（ab2893），并以1:1000稀释使用。重组IL1A（200-LA）是通过研发获得的。
衰老诱导与评估
除非另有说明，否则如前所述，细胞通过暴露于X射线或γ射线形式的10Gy电离辐射而衰老8，9，15，53，54简单地说，增殖细胞被照射一段时间，以释放10Gy电离辐射；对照细胞（模拟辐照）放置在辐照器中，间隔相同，但保持未辐照状态。或者，通过复制衰竭、慢病毒传递的致癌RAS或MKK6EE的表达或与二丁酸钠（2 mM）孵育1天或阿霉素（250 nM）孵育3天来诱导细胞衰老。7至10天后，对细胞的衰老标志物进行评分，包括生长状态（克隆形成测定或BrdU掺入）、SA-β-gal活性和持续DNA损伤灶的存在。按照图中的图例进行克隆分析。使用商业试剂盒（BD Biosciences）评估BrdU掺入。如前所述进行SA-β-gal染色9使用商业套件（BioVision）。如上所述，通过免疫染色53BP1或γH2AX病灶来评估DNA损伤病灶。对于DNA损伤灶和SAβ-gal阳性，显示了随机场。使用开源软件CellProfiler对BrdU掺入和DNA损伤灶进行量化(http://www.cellprofiler.org). SA-β-半乳糖染色通过光学显微镜和一名不了解处理方法的研究人员进行量化。
RNA分离和PCR
在Trizol（Invitrogen）中对细胞培养物进行均质，并使用RNeasy Kit（Qiagen）分离总RNA。使用MessageAmp RNA扩增试剂盒（Ambion）对RNA进行定量和扩增。对于前列腺成纤维细胞，cDNA通过逆转录生成，并使用Applied Biosystems 7700序列检测器进行三次定量PCR分析，其中cDNA约为5 ng，1µM指定引物对和SYBR Green PCR主混合（Applied biosystem）。或者，对于所有其他成纤维细胞，使用细胞到CT试剂盒（Ambion）从总RNA中生成cDNA，并根据制造商的说明，使用罗氏通用探针库（UPL）进行三次实时定量PCR。UPL的所有引物序列或引物探针组合列于补充表3将每个基因的平均周期阈值（Ct）归一化为同一样本中RPL13A或微管蛋白的水平（δCt）。未配对的两个样本t吨-试验用于确定各治疗组间平均δCt值的差异。采用增量增量Ct法计算折叠变化（折叠=2ddCt）。
蛋白质印迹分析和免疫荧光
如前所述进行蛋白质印迹和免疫荧光7，9，53，54简而言之，为了进行western blot分析，培养的细胞在SDS样品缓冲液（50 mM Tris HCl，pH6.8，100 mM二硫苏糖醇，2%SDS，10%甘油）中溶解，蛋白质在4–12%的预制聚丙烯酰胺凝胶（NuPAGE；Life Technologies）上通过电泳分离，并转移到硝化纤维素膜。使用PBS-T中5%的非脂肪乳封闭细胞膜，然后用第补充表2清洗后，将膜与二级抗体孵育，然后再次清洗。根据供应商的说明，使用增强型化学发光检测试剂盒（Pierce或GE Healthcare）检测信号。对于免疫荧光，细胞在室载玻片中培养和处理，在中性10%福尔马林中固定，并用含有0.5%Triton X-100的PBS渗透。洗涤后，使用含有1%BSA和4%血清的PBS封闭载玻片，所述血清来自与用于检测的第二抗体相对应的物种。清洗后，将载玻片与一级抗体一起孵育，再次清洗，与二级抗体一起孵化，并安装含有DAPI的慢制金（分子探针）（以观察细胞核）。通过荧光显微镜观察细胞，并使用Spotfire软件（诊断仪器）获取图像进行分析。
NF-κB转录检测
如前所述，在NF-κB结合位点的控制下，使用包含萤火虫荧光素酶基因的报告构建物来测定NF-kb B转录活性11，15简单地说，将报告构建物与包含雷尼利亚荧光素酶在CMV启动子的控制下，均使用慢病毒载体。在选择病毒感染后，细胞要么保持为非基因型，要么被电离辐射诱导衰老；然后用载体或雷帕霉素处理细胞，如文中所述。治疗7天后，对细胞进行裂解，并使用光度计和商业试剂盒（Promega）以及萤火虫或昆虫的底物对裂解产物进行荧光素酶活性分析雷尼利亚荧光素酶，根据供应商的说明。萤火虫萤光素酶活性被标准化为细胞数量或雷尼利亚萤光素酶活性。
抗体阵列
通过清洗约2×10制备抗体阵列分析的条件培养基6细胞用PBS培养2至3次，在无血清培养基中培养24小时。将条件培养基收集在离心管中，并对留在培养皿上的细胞进行计数，以使条件培养基的体积归一化为细胞数量。条件培养基通过简单离心澄清，用无血清培养基稀释至1.5×10的浓度6每1.2 ml细胞，并按上述方法应用于抗体阵列（Raybiotech；AAH-CYT-G1000-8）9，15以及供应商的建议。使用GenePix 4200A专业微阵列扫描仪检测信号，并使用LI-COR Odyssey软件进行分析。按照图例中的说明对信号进行平均和显示。
ELISA公司
通过在上述无血清培养基中培养细胞24小时制备条件培养基；为了正常化，对培养皿上残留的细胞进行计数。将条件培养基稀释至含有等量细胞，然后使用AlphaLISA IL-6免疫分析试剂盒和试剂，按照制造商描述的程序进行分析（Perkin Elmer；AL223F）。
细胞表面结合IL1A的检测
使用FITC-结合IL1A抗体（研发部的FAB200F）检测细胞表面结合IL1A，并使用FACSaria流式细胞仪（BD）和前述软件通过流式细胞术进行分析11简单地说，2–3×105用PBS洗涤细胞，用EDTA/PBS（不含胰蛋白酶）从培养皿中分离细胞，并通过温和离心收集。用含有0.5%BSA的冷PBS清洗细胞颗粒，用含有人类非特异性IgG的PBS封闭，并用FITC-结合抗体（10µl/105单元格）。用PBS洗涤两次后，将细胞悬浮在PBS中进行流式细胞术分析。
多聚体分析
收集前，细胞在无血清的DMEM中培养20分钟，DMEM含有雷帕霉素或二甲基亚砜（DMSO），补充50µg ml−1环己酰亚胺。然后在溶解缓冲液（300 mM NaCl、50 mM Tris HCl pH 8.0、10 mM MgCl）中溶解细胞2，1 mM EGTA，200µg ml−1肝素，400 U ml−1RNasin，1 mM苯甲基磺酰基氟化物，0.2 mg ml−1环己酰亚胺，1%Triton X-100），通过刮入1.5ml离心管收集并置于冰上。在16000℃下通过离心澄清裂解产物克静置10分钟，并加载到蔗糖梯度上。对于每个样品，从3个培养皿中提取裂解物，每个培养皿含有约5×106，被合并。梯度在超离心管（Beckman）中组装，由溶解在高盐分解缓冲液中的蔗糖组成（HSRB:140 mM NaCl，25 mM Tris HCl pH 8.0，10 mM MgCl2)和连续五层，每层分别含有1.67 ml HSRB和蔗糖，浓度分别为50%、40%、30%、20%和10%w/v。梯度用Parafilm密封，在室温下培养2小时，并在−80°C下储存过夜。加载前，将梯度在4°C下解冻1小时。细胞裂解物被加载到梯度上，以245000转的速度旋转克在4°C下保存2小时，并存放在冰上。离心后，收集20个级分，每个级分含有0.55ml和1.5ml TRI-LS试剂（Sigma），并在液氮中冷冻。监测254nm处的光密度（OD），以验证梯度质量。OD轨迹的代表性示例如图所示。
多聚体RNA纯化及qPCR分析
梯度组分在冰上解冻，并补充200 ng荧光素酶mRNA（Promega）以控制RNA回收效率。用200µl 1-溴-3-氯丙烷萃取每个组分。将1毫升水相转移到含有25µg糖原（Ambion）的试管中，并使用1 ml异丙醇沉淀。通过离心收集沉淀物后，将沉淀在75%乙醇中洗涤。将颗粒悬浮在200µl水中，使用RNEasy MinElute柱（Qiagen）纯化，并悬浮在50–100µl无RNAse水中。如上所述，使用罗氏通用探针库进行qPCR反应。为了控制RNA回收，根据荧光素酶mRNA的Ct值校正Ct值。对于每个基因，每个片段中的转录水平根据来自相同梯度的所有片段的总信号进一步标准化，并表示为总信号的百分比。根据OD（254 nm）轨迹上的峰位置，分数1-12被指定为非翻译，分数13-20被指定为翻译。
肿瘤细胞迁移、侵袭、增殖和致瘤性
使用Transwells（Cultrex 24孔细胞迁移分析板）在培养基中评估肿瘤细胞迁移和侵袭性，Transwell包含未涂层（用于迁移分析）或涂层（用于侵袭分析）的多孔（8µm孔径）膜用0.5倍的基底膜提取物溶液和井底指定的调节介质。24小时后，根据供应商的建议，对多孔膜底部迁移或侵入的细胞进行染色，并通过吸光度进行定量。采用MTT法测定上皮细胞增殖。对于小鼠的致瘤性分析，如前所述进行细胞制备和肿瘤体积评估8，13简单地说，我们准备了10个6成纤维细胞，照射（10Gy）或模拟照射，用二甲基亚砜或雷帕霉素处理8天。我们将这些成纤维细胞与106肿瘤细胞，并将混合细胞悬浮液皮下注射到12周龄雄性SCID小鼠体内。每周通过超声波评估异种移植的生长情况。8周后，这些动物被安乐死。切除后，肿瘤体积(V（V）)再次按照上述方法进行测量。或者，将肿瘤细胞注射到动物体内，如文本和图图例所述，这些动物接受或不接受米托蒽醌或雷帕霉素治疗，并按照上述方法评估肿瘤体积。巴克衰老研究所和弗雷德·哈钦森癌症研究中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并批准了所有动物协议和程序。
统计分析
所有显示误差条的数据均以平均值±标准误差表示。平均值差异的显著性由双尾Student’st吨除非另有说明，否则均假设为正态分布。P（P）<0.05被认为是显著的。所有计算均使用GraphPad Prism软件进行。每个细胞培养实验至少独立复制两次。对于每个实验，样品和复制品的数量在图例中显示。动物治疗实验和随后的数据收集未采用随机或盲法。每个条件下使用8到10只小鼠体内实验；实验做了一次。SA-β-半乳糖定量采用盲法。没有动物被排除在分析之外。样本大小是在先前实验的基础上选择的；没有使用统计方法预先确定样本量。这些实验不是随机的，除非另有说明，否则研究人员在实验和结果评估过程中没有失明。全部体内实验是在相同年龄和性别的动物上进行的，因此假设方差相等。
