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基因发育。2003年8月1日；17（15）：1829–1834年。
数字对象标识：10.1101/gad.110003
预防性维修识别码：项目经理196227
PMID：12869586

Rheb GTPase是TSC2 GAP活性的直接靶点，并调节mTOR信号

肯·伊诺基，1,4 李勇，1,4 田旭，三和关坤良1,2,5
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

结节性硬化综合征（TSC）是一种由基因突变引起的遗传病任何一个TSC1类或TSC2系统TSC1和TSC2基因产物形成功能复合物并抑制S6K和4EBP1的磷酸化。这些TSC1/TSC2的功能可能由mTOR介导。这里我们报告TSC2是一种针对Rheb（Ras家族GTPase）的GTPase激活蛋白（GAP）。Rheb公司刺激S6K和4EBP1的磷酸化。Rheb的这一功能被阻断雷帕霉素和显性阴性mTOR。Rheb刺激磷酸化并在调节S6K和4EBP1的反应中发挥重要作用营养素和细胞能量状态。我们的数据表明Rheb的行为TSC1/TSC2下游和mTOR上游调节细胞生长。

关键词：TSC2、Rheb、mTOR、S6K、GAP、结节性硬化综合征

结节性硬化综合征（TSC）以错构瘤形成为特征广泛的组织，是由要么是TSC1类或TSC2系统基因(Kwiatkowski 2003年). 最多严重的临床并发症是智力低下、癫痫和自闭症由脑部肿瘤生长引起(戈麦斯1991). 其他症状包括肾功能不全、皮肤病异常和心脏问题。任一种基因的杂合缺失TSC1类或TSC2系统产生相似表型并增加肿瘤发病率特别是在肾脏，而两者的纯合子缺失基因是胚胎致死的(Au等人。1998；小林等。2001). 遗传数据来自果蝇属显示TSC1和TSC2负调节细胞生长和细胞大小(高和潘2001；Potter等人，2001年；Tapon等人，2001年).

最近的研究已经证实TSC1/TSC2抑制核糖体S6激酶（S6K）和真核生物起始因子4E结合蛋白质（4EBP1），翻译的两个关键调节器(Goncharova等人，2002年；Inoki等人，2002年；Manning等人，2002年；Tee等人，2002年).S6K和4EBP1的磷酸化增强翻译(Gingras等人，1999年). 怎么TSC1/TSC2调节S6K和4EBP1的磷酸化是一个关键问题待回答。雷帕霉素（mTOR）的哺乳动物靶点是负责S6K和4EBP1的磷酸化(Brown等人，1995年；Hara等人，1998年). 最近研究表明TSC1/TSC2通过mTOR调节S6K和4EBP1的磷酸化(Gao等人2002年；Inoki等人。2002；Tee等人。2002). 与此模型一致的是TSC1和TSC2对细胞营养反应很重要，这需要mTOR的功能(Gao等人，2002年). 然而，它尚不清楚TSC1/TSC2如何抑制mTOR活性。

TSC2的C末端区域与Rap具有显著同源性GTPase激活蛋白（GAP）；这个1993年欧洲16号染色体结节性硬化联盟). 在事实上，TSC2对Rap1和Rab5的GAP活性此前已有报道(Wienecke等人，1995年；Xiao等人，1997年). 然而，报告的GAP活性极低，且具有功能重要性尚不清楚。Rheb是一种小GTPase，最初作为Ras同源物分离富含大脑(Yamagata等人。1994)并且得到了广泛的表达。Rheb拥有更高的序列与Ras的身份比与Rho家族成员的身份更重要。生物功能哺乳动物Rheb尚不清楚。相互矛盾的研究报告称，Rheb均抑制并激活Raf-MAP激酶途径(Clark等人，1997年；Yee和Worley 1997).有趣的是Rheb公司中的基因裂殖酵母蓬贝产生类似于营养缺乏的表型，表明Rheb可能参与营养信号传导(马赫等人，2000年).

在本报告中，我们提供了直接的生化数据，证明TSC2在体外对Rheb具有GAP活性。此外，我们还表明TSC2调节体内Rheb-GTP水平。我们表明Rheb的角色之一是刺激S6K和4EBP1的磷酸化TSC1/TSC2的细胞下游靶点。效应域和GTP结合对Rheb功能至关重要。Rheb刺激S6K的能力磷酸化需要mTOR的功能，表明mTOR发挥作用Rheb下游。与此一致的是，Rheb刺激丝氨酸残基2448上mTOR的磷酸化。此外，我们的数据支持Rheb在细胞对能量限制的反应中起着重要作用和营养缺乏。总之，本研究提供了一个模型，即Rheb是一个直接指向TSC2的下游目标，并在mTOR的上游进行调节翻译和细胞生长。

结果和讨论

TSC2刺激Rheb的GTP水解

TSC2的C末端区域包含一个假定的GAP域与RapGAP有显著同源性(这个1993年欧洲16号染色体结节性硬化联盟；Scheffzek等人，1998年).然而，推测的确切生理生化功能尚未证明TSC2 GAP域。有趣的是TSC相关突变发生在TSC2的C末端假定GAP结构域，指出GAP域对TSC2功能可能很重要(Jin等人，1996年；Momose等人，2002年；Kwiatkowski 2003年). 学习TSC2的生化功能，我们表达并纯化了TSC2输入大肠杆菌并测试了对Ras的GAP活性GTPases亚家族（Ras、Rap、TC21和Rheb）和Rho家族GTPases（Rac和Cdc42）。我们的体外试验未能检测到显著的GAP活性，而RasGAP1的阳性对照显示出对Ras的活性（数据没有如图所示）。值得注意的是，催化精氨酸残基对Rap GAP家族中的GAP活性在TSC2中不保守(图1A)，表明TSC2可能没有GAP活动(Scheffzek等人。1998). TSC2也可能具有GAP活动，但不同的精氨酸或完全不同的催化机制可能是已使用。

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TSC2对Rheb具有GAP活性。(A类)Rheb和TSC2是GTPase和GAP异常。催化活性位点精氨酸（粗体）在TSC2中不保守。Rheb含有精氨酸残基（粗体的残基）位于Ras密码子12对应的位置，其中含有甘氨酸。数字表示最后残留物的位置。(B类)免疫沉淀TSC1/TSC2刺激Rheb的GTP水解。增加的免疫沉淀TSC1/TSC2的量（微升）与GST-Rheb在室温下放置20分钟。释放游离32用放射性计数法测定磷。背景减去对照免疫沉淀的活性。基础GTPaseRheb的活性被任意设置为1。(C)与时间相关的GTPTSC1/TSC2刺激的Rheb水解。GTP水解测定于缺席(▪) 和存在(▵) TSC1/TSC2。(D类)两者都没有TSC2的N端和C端区域对Rheb具有GAP活性。两个截断的TSC2结构（TSC2N，氨基酸1-1007；TSC2C，氨基酸1008-1765）与TSC1共表达，并进行免疫沉淀和分析GAP体外活性。本试验中使用的HA-TSC2的量相等至1μL英寸B类。这些蛋白的表达水平为通过Western blot测定。(E类)TSC2（而非TSC1）具有GAP活性。转染HEK293细胞未经处理或用D-PBS、雷帕霉素（20nM）或LY294002（50μM）持续30分钟，如图所示。相对数量GAP分析中使用的TSC2通过Western blot测定，如下所示在下面每个酒吧。(F类)TSC1/TSC2降低Rheb-GTP水平体内。将Myc-Rheb转染HEK293细胞并用32磷酸。Myc-Rheb免疫沉淀，结合核苷酸洗脱并在纤维素板上溶解。与联合转染显示TSC1和TSC2。Myc-RacL61作为对照。比率GTP/GDP的计算公式为GTP计数/3除以GDP计数/2，和上所示顶部每条车道的。

为了进一步测试TSC2的GAP活性，我们将TSC2与HEK293细胞中的TSC1。TSC1/TSC2复合物通过免疫沉淀法和体外GAP活性用不同的小GTP酶。我们对Rheb做出了特别的努力，因为在S.pombe公司产生类似于营养饥饿的表型(马赫等人，2000年). 我们发现TSC1/TSC2复合物刺激了Rheb的GTP水解(图1B、C)但Ras没有。这个TSC2的GAP活性需要全长蛋白，因为N末端和包含GAP同源结构域的C末端区域，向Rheb显示的活动(图。一维). 排除在中检测到GAP活动的可能性TSC1/TSC2免疫沉淀是由于另一种共沉淀GAP，我们制造TSC2-R1701Q和TSC2-R170 3Q突变体，这些突变体在TSC患者中发现，以及检测到没有GAP活动（数据未显示）。因此，我们认为TSC2是Rheb间隙。TSC2C缺乏GAP活动可能是因为该要求TSC2 N末端区域的GAP活性残基或不正确TSC2C的折叠。TSC2刺激Rheb GTPase活性的能力是非常有趣，因为TSC2没有保守的活性位点精氨酸在其他相关的RapGAP和Rheb中发现了一种不寻常的GTPase(图1A). 几乎所有RasGTPases家族在等位基因中含有一个保守的甘氨酸残基Ras中的密码子12(罗伊和威卢姆森1993). 这种甘氨酸突变为几乎任何残基，包括在许多癌症中发现的缬氨酸激活Ras家族的GTPase。RasV12突变体已知对RasGAP下调有抵抗力(Trahey和McCormick 1987).有趣的是，Rheb在相应位置有精氨酸残基密码子12和具有比Ras低得多的基础GTPase活性（数据未显示）。然而，Rheb的GTPase活性可以通过TSC1/TSC2。因此，Rheb和TSC2是不寻常的GTPase和GAP，分别是。

确定TSC2、HA-TSC2的GAP活动是否需要TSC1仅在HEK293细胞中表达并免疫沉淀。沉淀物TSC2也可能免疫沉淀少量内源性TSC1，对Rheb表现出显著的GAP活性(图1E). 相反，免疫沉淀的TSC1对Rheb显示出非常低水平的GAP活性可能是内源性TSC2蛋白共沉淀所致。这些观察结果表明TSC1在体内稳定TSC2，但不是直接需要的GAP活动。在各种条件下，TSC1/TSC2也被免疫沉淀，包括雷帕霉素、LY294002和D-PBS的治疗，这些都是已知的抑制S6K和4EBP1的磷酸化。我们观察到这些治疗不会直接影响免疫沉淀TSC1/TSC2的GAP活性(图1E).

TSC2对Rheb GTP水平的影响也在体内测定。这个通过体内标记法测定Rheb的核苷酸结合状态32磷酸。有趣的是，Rheb的基础GTP水平较高(图1F). 高GTP水平野生型Rheb与它在某一位置含有精氨酸相一致相当于Ras的密码子12(图。1安培). TSC1/TSC2的表达降低了共转染Rheb～10倍(图。1楼). 作为对照，TSC2的N末端结构域的表达对Rheb的GTP水平无显著影响。这些数据提供了体内证明TSC2是Rheb GAP的证据。

Rheb刺激S6K和4EBP1的磷酸化

如果Rheb是TSC2的关键下游目标，Rheb应刺激S6K和4EBP1的磷酸化。诱导的野生型Rheb的表达S6K磷酸化的急剧增加和4EBP1的迁移转移(图2A). Rheb也增加了转染HEK293细胞内源性S6K的磷酸化。在相反，Rheb没有刺激ERK磷酸化（数据未显示）。这个野生型Rheb的高活性与其主要为GTP相一致绑定(图1F). Rheb也以剂量依赖的方式刺激S6K磷酸化(图2B).

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Rheb刺激S6K和4EBP1的磷酸化。(A类)Rheb公司刺激S6K和4EBP1的磷酸化。HA-S6K和Flag-4EBP1分别为在有或无Myc-Rheb（100 ng）的情况下转染到HEK293细胞。S6K的磷酸化通过磷酸特异性抗体pS6K（T389）测定，而4EBP1的磷酸化是由迁移率变化决定的(上面的面板）。还测定了内源性S6K的磷酸化作用(降低面板）。(B类)Rheb刺激S6K磷酸化以剂量依赖的方式。HA-S6K（15 ng）与0，2，5，20，50和100 ng Myc-Rheb。(C)Rheb的效应域是需要刺激S6K磷酸化。HA-S6K与野生型Rheb（100 ng）、RhebL64（40 ng）、Reheb-5A（200 ng）和RhebN20（300ng）。还显示了Rheb突变体的相对表达。(D类)不同GTPases刺激S6K磷酸化。构成活跃Cdc42、Rap1、Rab5、RhoA和野生型Rheb的突变体（每个100 ng）（40 ng）用于刺激S6K的磷酸化。(E类)TSC2，但不是TSC1，抑制S6K磷酸化。HA-S6K与Myc-TSC1或HA-TSC2。测定了S6K的磷酸化。

Rheb效应域中38到42之间的5个残基发生突变生成Rheb5A的丙氨酸。我们发现效应域的突变完全消除了Rheb刺激S6K磷酸化的能力(图2C). 我们还测试了组成活性Rheb（RhebL64），并观察到RhebL 64是大约比野生型活跃两到三倍(图2C). 试图创造一个显性-阴性突变体，我们制造了一个RhebN20。令人惊讶的是，RhebN20不显示任何显性负效应，也不刺激S6K(图2C). A类似RasN17的显性负突变体能有效阻断Ras功能通过Ras鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF；Lowy and Willumsen 1993年). 这个观察表明，Rheb可能不需要GEF，因为它的基础很高GTP级别，需要GTP绑定来刺激S6K磷酸化。

为了确定Rheb的特异性，检测了其他几种GTPase，包括Cdc42、Rap1、RhoA和Rab5。这些成分活性突变体GTPases不能刺激S6K磷酸化(图2D). 这些结果证明Rheb对刺激S6K磷酸化具有特异性。我们测试了TSC1或TSC2单独对S6K磷酸化的影响。TSC2的表达，而不是TSC1，显著降低了共同转染的S6K(图3E),这与TSC2单独具有GAP活性的事实一致。TSC2的能力但TSC1不抑制S6K表明TSC2是TSC1/TSC2复合物，而TSC1可能具有调节功能，例如定位和稳定。此外，这些观察结果表明TSC2抑制内源性Rheb降低S6K磷酸化，因此支持Rheb在S6K监管中的重要性。

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TSC1/TSC2抑制体内Rheb功能。(A类)TSC1/TSC2抑制Rheb诱导S6K磷酸化的能力。(B类)TSC1/TSC2抑制Rheb诱导4EBP1磷酸化的能力。

TSC1/TSC2抑制Rheb功能

TSC1/TSC2和Rheb之间的功能关系在活泼地。TSC1/TSC2共转染抑制了Rheb刺激的能力S6K系列(图3A). 类似结果用4EBP1观察到(图。3B公司). 这些数据进一步支持TSC2作为GAP的观点朝向Rheb。

mTOR作用于Rheb下游

先前的研究表明mTOR作用于TSC2的下游(Gao等人，2002年；Inoki等人，2002年；Tee等人，2002年). 要确定Rheb与mTOR之间的关系，雷帕霉素的作用是调查。雷帕霉素对细胞的治疗完全阻断了Rheb对S6K磷酸化的刺激作用(图4A)表明RhebmTOR上游的功能。为了进一步测试功能关系在Rheb和mTOR之间，mTOR的激酶激活突变体与莱布。我们发现显性负性mTOR-KD显著阻断了Rheb对S6K的磷酸化作用(图。第4页). 我们之前观察到TSC1/TSC2抑制mTOR的S2448磷酸化(Inoki等人2002年；Kenerson等人。2002). Rheb的共表达导致mTOR显著增加S2448磷酸化，而Akt磷酸化不受影响(图4C)表明Rheb激活mTOR。

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Rheb在mTOR上游发挥作用，并参与对各种信号。(A类)Rheb在营养信号的下游和m任务大纲。如图所示，HA-S6K与RhebL64或RasV12共转染。细胞是用雷帕霉素或D-PBS处理30分钟已确定。(B类)激酶非活性mTOR KD阻断Rheb诱导的S6K磷酸化。(C)Rheb刺激mTOR的磷酸化。Flag-mTOR或GST-Akt与Rheb共转染并免疫沉淀。(左侧)mTOR的磷酸化通过抗磷酸mTOR检测（S2448）抗体。(赖特)Akt的磷酸化由抗磷酸化Akt（S473）抗体。(D类)瑞b在S6K调节中的作用通过各种信号途径。单独转染HA-S6K(左边一半）或与RhebL64一起(正确的一半）。细胞用D-PBS、1-丁醇（0.3%）、山梨醇（600 mM）、2-DG（25 mM）或雷帕霉素（20 nM）如图所示，持续30分钟。

Rheb参与多种信号通路调节S6K系列

S6K的磷酸化受多种细胞信号调节，包括营养素(自豪2002). 这个分析了大黄酸在营养信号传导中的功能意义。在Rheb转染HEK293细胞，营养缺乏（用D-PBS治疗含有葡萄糖，但不含氨基酸）引起的S6K系列(图4A). 相反，营养饥饿抑制RasV12转染细胞中S6K磷酸化(图4A). 这些结果证明Rheb在营养信号传导中起着重要作用但Ras并不直接参与营养信号传导。我们还通过山梨醇检查渗透胁迫的影响，通过2-脱氧葡萄糖（2-DG）和1-丁醇对磷脂酶D的抑制。这些已知治疗可诱导S6K去磷酸化(图4D；Dennis等人，2001年；Fang等人，2001年；Desai等人，2002年). Rheb公司显著阻断了2-DG和1-丁醇的作用，但效果甚微山梨醇诱导S6K脱磷反应的研究(图4D). 这些数据表明Rheb在细胞能量敏感途径和磷脂酶D中起作用但不直接参与渗透胁迫途径。一直以来，TSC1/TSC2在调节S6K对细胞能量消耗的反应（数据未显示）。

TSC1/TSC2在细胞生长调节中的重要性已建立(波特和徐2001). TSC1/TSC2的主要细胞功能是抑制S6K和4EBP1的磷酸化，可能通过mTOR。本研究提供了对how分子机制的理解取得重大进展TSC1/TSC2调节S6K和4EBP-1的磷酸化。基于中的两者体外和体内生化实验，我们得出结论，TSC2是一种Rheb-specific GAP和Rheb是TSC1/TSC2的关键下游目标(图5). Rheb与与Ras相关，是一种不寻常的GTPase，因为它主要与GTP结合在单元格中。Rheb的生物学功能尚未明确定义。我们的研究支持Rheb通过刺激磷酸化促进细胞生长S6K和4EBP1，但在ERK激活中没有作用。

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TSC1/TSC2下游和m任务大纲。TSC2作为GAP，通过直接刺激GTP使Rheb失活水解作用。Rheb刺激mTOR。营养和细胞能量状态信号通过Rheb，而渗透胁迫信号独立于Rheb。

TSC1/TSC2对Rheb的抑制可能对其功能至关重要这两种抑癌蛋白中，Rheb能有效调节S6K和4EBP1的磷酸化。有趣的是，Rheb同源基因的突变在里面S.pombe公司显示营养缺乏的表型特征(马赫等人，2000年). 我们的数据与S.pombe公司和支持Rheb在营养信号传递中发挥重要作用的观点。S.pombe公司还包含TSC1和TSC2相关分子(松本等人，2002年). 我们也表明TSC2是一个不寻常的GAP，因为它缺乏保守的在其他Rap家族GAP中发现的精氨酸。但它有很高的选择性GAP对Rheb的活性。阐明催化机理的未来研究TSC2对Rheb GTP水解的作用将为这种不寻常的情况提供新的见解GTP和GAP工作。

我们的研究提出了Rheb参与S6K调控的模型对营养物质和能量水平的反应(图5). 相反，渗透性压力独立于Rheb调节S6K。Rheb的主要功能是刺激mTOR；然而，我们没有发现Rheb和mTOR，表明Rheb可能间接激活mTOR。未来工作重点将放在Rheb如何刺激mTOR。我们的模型预测TSC2通过Rheb规范翻译(图5). 这表明Rheb积极调节细胞生长，在TSC的发展。因此，抑制Rheb可能是一个潜在的靶点用于治疗TSC和癌症。

材料和方法

抗体和质粒

抗磷S6K（T389）、抗mTOR和抗磷mTOR（S2448）抗体来自Cell Signaling Inc.，抗Myc抗体来自圣克鲁斯生物技术。抗-HA和抗Flag从Covance购买和Sigma。TSC1和TSC2结构如前所述(Inoki等人，2002年). 这个J.Blenis慷慨提供了HA标记的S6K1（αII）构造（哈佛大学，剑桥，马萨诸塞州）和标记的mTOR和激酶不活跃mTOR（mTORKD）来自S.Schreiber（马萨诸塞州剑桥哈佛大学）。拉布5是G.Li（俄克拉荷马大学，俄克拉荷马州健康科学中心俄勒冈州城市）。所有其他DNA结构，包括Ras、Rheb、Rap1、Rac、Cdc42、，RhoA、4E-BP1、Akt和ERK2为实验室库存。所有的突变结构通过PCR诱变产生TSC2和Rheb，并通过DNA验证排序。

细胞培养、转染和免疫沉淀

HEK293细胞接种于Dulbecco改良的Eagle’s含有10%胎牛血清（FBS）的培养基（DMEM）。转染是根据制造商说明。细胞在裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl）中进行裂解pH 7.5，100 mM NaCl，1%NP-40，1%Triton X-100，50 mM NaF，2 mM EDTA，1 mMPMSF、10μg/mL亮氨酸肽、10μg/mL抑肽酶）和免疫沉淀带有所示抗体和蛋白G-Sepharose珠。免疫复合物进行SDS-PAGE分析。

体外GTPase检测

GST-Rheb、GST-Ras、GST-Rac和GST-Rap在细菌中表达菌株BL21，并使用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠（Sigma）作为描述。小GTP酶被加载32之前的P-γ-GTPGAP分析。这里，10μg小GTPase蛋白结合在谷胱甘肽珠上用50μCi的32装载缓冲器中的P-γ-GTP（20 mM Tris，pH 8，5 mM EDTA，1 mM DTT，0.1 mg/mL BSA），体积为20μL。通过添加MgCl停止加载反应2到10然后洗脱小GTPase蛋白。

将HA-TSC2转染HEK293细胞并用抗HA免疫沉淀抗体。用洗涤缓冲液（20 mM）洗涤免疫复合物三次pH 7.4、800 mM NaCl、2 mM EDTA、1%NP-40）条件下的三次试验，以及GAP试验的两次试验清洗缓冲液（pH值为8时为20 mM Tris，100 mM NaCl，5 mM MgCl2，1毫米DTT）。最终GAP分析包括0.5μg32P-γ-GTP负载小GTPase和1×10的免疫沉淀TSC27转染HEK293细胞。在40μL GAP中进行反应分析缓冲液（20 mM Tris，pH 8，10 mM MgCl2和4 mM DTT），在室温下保持20分钟。用300μL木炭停止反应缓冲液（5%木炭，20mM磷酸，0.6M盐酸），然后涡旋10min，并以13000 rpm旋转10 min。然后将100μL上清液拍摄，以及32P释放通过闪烁测定计数。

Rheb的体内标记

用无磷酸盐DMEM洗涤细胞一次，并与0.5mCi/mL32正磷酸盐（ICN）作用4小时。用标记裂解缓冲液（1%Triton X-100，50 mM HEPES，pH 7.4，100 mM NaCl，5mM氯化镁2，1毫克/毫升BSA，1毫升DTT，1毫升PMSF，10微克/毫升亮氨酸肽，10μg/mL抑肽酶）。经Myc-tagged的Rheb被免疫沉淀。受Rheb约束用洗脱缓冲液洗脱核苷酸（2 mM EDTA，0.2%SDS，1 mM GDP，1mM GTP）在68°C下放置20分钟。然后将洗脱的核苷酸使用0.75 M PEI纤维素板（Baker-flex）的薄层色谱法千赫2人事军官4（pH值3.4）。

致谢

我们感谢朱天庆的技术援助。我们还要感谢李伟全Huira Chong负责质粒构建，Haris G.Vikis和Jennifer负责质粒构建奥兰特批判性阅读手稿。这项工作得到了NIH和沃尔特癌症研究所的拨款。

这篇文章的出版费用部分由以下款项支付页面费用。因此，必须在此标记此物品根据《美国法典》第18卷第1734节，“广告”仅限于指出这一事实。

笔记

通讯作者。

文章在印刷前在线发布。文章和发布日期为在http://www.genesdev.org/cgi/doi/10.101/1110003。

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文章来自基因与发育由以下人员提供冷泉港实验室出版社