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生物化学杂志。2017年3月24日；292(12): 5089–5100.
在线发布2017年2月6日。 数字对象标识：10.1074/jbc。M116.753913
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MAPK/ERK激酶热休克诱导TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43）磷酸化调节TDP-43功能*保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg

文丽（Wen Li）,‡ 阿什利·N·里布,‡ 林宾艳,‡ 普拉文·苏布拉马尼安,‡,1 艾琳·E·菲,‡,2 凯瑟琳·克诺维雷克（Catherine R.Knoverek）,‡,三 瑞秋·L·弗兰奇,‡ 艾琳·H·比吉奥,§和尤纳·M·阿亚拉‡,4
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摘要

TAR DNA-binding protein（TDP-43）是一种高度保守的重要DNA和RNA-bindings protein，通过RNA加工，特别是剪接调控来控制基因表达。TDP-43的细胞内聚集是肌萎缩侧索硬化和泛蛋白阳性额颞叶变性的标志。这种TDP-43病理学也存在于包括阿尔茨海默病在内的其他类型的神经退行性变中。我们在此报告TDP-43是MEK的底物，MEK是MAPK/ERK信号通路中的一种中央激酶。人类细胞中的热休克反应（HSR）显著增加了MEK在苏氨酸153和酪氨酸155（p-T153/Y155）处的TDP-43双重磷酸化。HSR通过维持蛋白质体内平衡和防止蛋白质错误折叠来促进蛋白质中毒条件下的细胞存活。MEK被HSR激活，并有助于蛋白质组稳定性的调节。磷酸化的TDP-43与TDP-43聚集无关，在促进蛋白质错误折叠的条件下，p-T153/Y155仍然可溶。我们发现，活性MEK显著改变了TDP-43调节的剪接，并且这两个残基上的磷酸化取代减少了与富含GU的RNA的结合。使用磷酸化特异性p-T153/Y155抗体的细胞成像显示，磷酸化的TDP-43特异性地被招募到核仁，这表明p-T153/Y155在核相关RNA的加工过程中调节了TDP-43以前未被认可的功能。这些发现强调了一种通过磷酸化调节TDP-43功能和体内平衡的新机制，因此，可能有助于制定防止TDP-43聚集的策略，并揭示TDP-43在细胞代谢中以前未被探索的作用。

关键词：肌萎缩侧索硬化（ALS）（Lou Gehrig病）、神经退行性变、蛋白质聚集、RNA结合蛋白、RNA-蛋白质相互作用、TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43）（TARDBP）、MEK激酶、热休克反应

介绍

近年来，RNA结合蛋白在神经退行性疾病中的作用，特别是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）5已成为人们研究的热点。TAR DNA结合蛋白（TDP-43）在几乎所有ALS和约50%的FTLD病例中形成细胞质聚集(1,2). TDP-43病理学在包括阿尔茨海默病在内的其他神经系统疾病中观察到(三,4). TDP-43基因中>40个ALS/FTLD患者衍生的常染色体显性错义突变强调了TDP-43在疾病中的直接作用(TARDBP公司) (5). TDP-43包裹体与正常核TDP-43检测的显著降低一致(2)这意味着累积后功能丧失。神经退行性变和TDP-43功能之间的联系尚未明确确立，TDP-43聚集对发病机制的贡献也知之甚少。

TDP-43是一种高度保守的异质核核糖核蛋白（hnRNP），具有两个典型的RNA识别基序（RRM），其中RRM1是结合RNA所必需和足够的。C末端的低复杂度序列或朊蛋白样结构域介导RNA加工所需的蛋白质相互作用(6,7)是蛋白质聚集的主要驱动因素(8). 虽然TDP-43在细胞核和细胞质之间穿梭，但它主要是细胞核(9). 在细胞核中，TDP-43显示出对卡哈尔天体和宝石的扩散模式和补充(10). 在特定的细胞应激条件下，如氧化应激，TDP-43定位于细胞质应激颗粒(11)可能有助于病理性聚集物的形成(12).

TDP-43对动物模型和培养细胞的发育和存活至关重要(13,–17). 在人类细胞和小鼠大脑中，TDP-43结合了数千个对富含GU序列有强烈偏好的转录物，并调节着600多个蛋白编码基因。TDP-43主要通过剪接调控来控制这些基因(18,–20). 虽然TDP-43参与了RNA加工和RNA转运的不同机制，但剪接调控是其最显著的功能(20,21). 此外，最近的研究结果表明，TDP-43作为隐匿外显子内含物的抑制剂，在基因调控中发挥着更广泛的作用(22).

尽管有证据表明TDP-43控制着大量基因并在细胞中动态分布，但通过翻译后修饰调节TDP-43功能的细胞刺激和因素大多仍不清楚。我们对非病理环境中发现的新的TDP-43磷酸化位点进行了表征，并试图确定控制它们的机制。我们的研究结果表明，在没有增加TDP-43聚集或蛋白质清除的情况下，细胞热休克反应（HSR）的激活通过MAPK/ERK激酶MEK显著增加了Thr-153和Tyr-155的TDP-43磷酸化。在存在活性MEK的情况下，Thr-153/Tyr-155磷酸化增加，Thr-133/Tyr-153处的磷酸化模拟取代显示剪接调控功能降低。此外，Thr-153/Tyr-155的拟磷酸取代降低了RNA结合亲和力，表明这些位点的磷酸化调节TDP-43的活性。

结果

热休克反应控制RRM1中TDP-43磷酸化

位于RRM1的苏氨酸153和酪氨酸155处的TDP-43磷酸化(图1,A类和B类)通过人类HeLa细胞的大规模磷酸化蛋白质组质谱分析鉴定(23). 这些修改是在非病理条件下确定的。为了表征这些先前未探索的磷酸化位点，我们开发了一种新型的磷酸化特异性多克隆抗体p-T153/Y155-TDP-43，以识别Thr-153/Tyr-155的双重TDP-43磷酸化。在包括SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞在内的不同人类细胞系中，通过免疫印迹法几乎无法检测到p-T153/Y155-TDP-43识别的蛋白质的基本水平(图1,C类和D类,补充图S1). 然而，我们发现热休克显著上调了p-T153/Y155-TDP-43相关信号。在氧化应激、DNA损伤应激或转录抑制条件下未观察到显著增加(图1C类). 热休克应激的人类HEK-293也获得了类似的结果(补充图S1)和HeLa细胞(图2A类). 总蛋白>150μg的对照细胞裂解液中未检测到p-T153/Y155-TDP-43相关信号水平(图1D类,补充图S1). 相反，从～20μg总蛋白开始，在热休克处理的细胞裂解液中观察到该信号(图1D类,补充图S1). 我们通过不同的分析确认了Thr-153/Tyr-155处TDP-43磷酸化的抗体特异性。TDP-43击倒后，热休克后与p-T153/Y155-TDP-43相关的信号显著降低(图2A类). 将抗体与在Thr-153和Tyr-155磷酸化的TDP-43肽（氨基酸148-161）孵育，导致p-T153/Y155-TDP-43相关信号的丢失，而非磷酸化对照肽没有影响(图2B类). 此外，与对照组相比，热休克细胞裂解物的磷酸酶处理降低了p-T153/Y155-TDP-43相关信号的水平(图2C类). 为了进一步表征我们的新抗体对Thr-153和Tyr-155双磷酸化的特异性，我们测定了p-T153/Y155-TDP-43对Thr-183或Tyr-153单磷酸化的活性。使用在单一氨基酸残基Thr-153或Tyr-155磷酸化的肽进行免疫印迹竞争分析(补充图S2，A类和B类). 在Thr-153（Thr（P）-153）磷酸化的肽不能阻断P-T153/Y155-TDP-43相关带的识别。类似高浓度的Tyr-155磷酸化肽（Tyr（P）-155，0.1μg/ml）显示部分抑制P-T153/Y155-TDP-43活性。然而，与同等浓度的P-T153/Y155双磷酸化肽相比，通过降低Tyr（P）-155肽的浓度来阻断抗体没有显示出显著的竞争活性(补充图S2B类). 此外，我们分析了热休克相关信号是否可以通过产生的抗体检测到，以识别Tyr-155（p-Y155-TDP-43）的单一磷酸化。在控制或热休克条件下，该抗体未检测到p-T153/Y155-TDP-43相关信号(补充图S2C类). 总的来说，这些结果强烈支持新开发的p-T153/Y155-TDP-43抗体对Thr-153和Tyr-155的双重TDP-43磷酸化的特异性，并显示了HSR对TDP-43翻译后修饰的调节。

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热休克诱导Thr-153和Tyr-155处的TDP-43磷酸化。 A、，突出与蛋白质活性和结构相关的TDP-43结构域的示意图：核定位序列(荷兰统计局)在N端，RRM 1和2，以及在C端的低复杂度序列。苏氨酸153和酪氨酸155(红色)在RRM1中突出显示插入。B、，与UG-rich RNA分子结合的TDP-43 RRM1-2片段（氨基酸102–269）的带状和表面表征(灰色)基于配合物的核磁共振结构(36). Thr-153和Tyr-155突出显示在红色-C，43℃热休克30min后SH-SY5Y细胞的免疫印迹；用亚砷酸钠处理，0.5 m米持续1h（NaAsn）；H（H）2O（运行）2, 100 μ米持续5小时；羟基脲，4米米持续4小时(匈牙利); 和放线菌素D，5μg/ml，持续3小时(第D幕).D、，来自对照和热休克处理的SH-SY5Y细胞的增加细胞裂解物的免疫印迹。一种识别总的磷酸依赖性TDP-43的抗体被用作对照。采用Tubulin和GAPDH作为负荷控制。

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抗体p-T153/Y155-TDP-43特异性检测热休克介导的TDP-43磷酸化。 A、，用TDP-43特异性和对照siRNA处理HeLa细胞的免疫印迹，以比较热休克应激后p-T153/Y155-TDP-43的水平。误差线、S.D。n个= 4.B、，使用p-T153/Y155-TDP-43抗体检测SH-SY5Y细胞裂解液中的热休克相关信号，该抗体被对应于Thr-153/Tyr-155区域（氨基酸148-161）的TDP-43肽阻断，该区域在Thr-153和Tyr-153（T153）磷酸化P（P）/155日元P（P）)或以相应的非磷酸化肽作为对照。低浓度使用了两种肽(L（左）)和高(H（H）)，见“实验程序”C、，p-T153/Y155-TDP-43检测来自对照和热休克处理SH-SY5Y细胞的对照和λ-磷酸酶处理的裂解物。

为了证实我们的结果并确定Thr-153/Tyr-155的磷酸化是否改变TDP-43的细胞定位，我们通过间接免疫荧光分析对p-T153/Y155-TDP-43抗体进行了表征。在未经处理的细胞中，p-T153/Y155-TDP-43相关信号定位于核仁室，呈致密的卷曲状结构(图3). 这在不同的人类细胞系中观察到，包括HeLa、SH-SY5Y(图3,A类和B类)、U2-OS和HEK-293细胞（未显示）。我们通过RNAi介导的TDP-43敲除和与上述Thr-153和Tyr-155磷酸化肽（氨基酸148-161）的竞争分析，在我们的免疫荧光分析中确认了在Thr-153/Tyr-153处TDP-43磷酸化的抗体特异性。在磷酸化肽存在的情况下，核仁信号的检测被阻断，而抗体与非磷酸化肽的孵育没有影响(补充图S3A类). 此外，与对照处理细胞相比，通过shRNA敲除TDP-43降低了核仁信号水平(补充图S3B类). 这些结果表明，在正常条件下，p-T153/Y155与TDP-43的核仁定位有关。这与之前在HeLa细胞核仁结构域中检测TDP-43的质谱一致(24). 根据对磷酸依赖性TDP-43的检测，核仁募集的总TDP-43水平似乎比其余细胞核低得多(图3A类). HeLa和SH-SY5Y细胞的共焦显微镜分析表明，磷酸化的TDP-43是核仁致密纤维成分（DFC）的一部分，因为我们观察到与纤维蛋白（一种成熟的DFC标记物）的显著共定位(图3B类). 热休克后，p-T153/Y155在细胞核中的定位保持不变。对整个细胞中p-T153/Y155水平的量化显示，热休克后HeLa和HEK-293细胞的相对荧光分别增加50%和40%(图3C类,补充图S4). 需要进一步的实验来确定HSR期间磷酸化的增加是否主要源于核仁室相对于细胞其余部分的变化。

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p-T153/Y155-TDP-43检测TDP-43在致密卷曲结构中的核仁定位。 A、，未处理HeLa细胞的荧光成像显示总TDP-43和p-T153/Y155-TDP-43定位。B、，共焦显微镜观察到HeLa和SH-SY5Y细胞中p-T153/Y155与核仁标记物纤维蛋白共定位。C、，与对照处理细胞相比，热休克后HeLa细胞中p-T153/Y155的检测。酒吧，10微米。

TDP-43磷酸化与聚集、应激颗粒或蛋白质清除无关

我们分析了热休克后TDP-43的聚集，以确定p-T153/Y155是否与蛋白质溶解度的变化有关，并将p-T153/W155与之前确定的与聚集和病理密切相关的两个TDP-43磷酸化位点Ser-403/404、Ser-409/410进行比较(25,26). 从细胞裂解物（CL）中提取蛋白质到RIPA（R）和尿素（U）可溶部分后，热休克显著导致不溶部分中总TDP-43的错误折叠和积累。免疫印迹分析表明，热休克后RIPA可溶部分的总TDP-43显著降低，尿素可溶样品相应增加(图4A类). 相反，p-T153/Y155仅存在于RIPA可溶部分中。通过37°C培养从热休克中恢复，尿素部分中的总TDP-43水平降低，表明错误折叠的TDP-43和/或伴侣辅助的蛋白质重折叠被清除。同时，在恢复过程中，p-T153/Y155水平显著降低。这些结果与成像分析一致，成像分析显示热冲击后p-T153/Y155没有积累到可见聚集物中(图3C类). 尽管热休克后总TDP-43在尿素组分中积累，但我们没有观察到总TDP-53在细胞质聚集体中的积累(图3C类)，表明热冲击后尿素馏分中存在的TDP-43代表可能在形成更大的可见聚集物之前的错误折叠物种。

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p-T153/Y155与TDP-43的聚集、应激颗粒募集或清除无关。 A、，对SH-SY5Y细胞进行分馏，使用对照细胞、热休克处理细胞（43°C，30分钟），并允许细胞在37°C下恢复1或2小时(1小时R,2小时R)热冲击后。总裂解物的免疫印迹(氯)、RIPA(R（右）)和尿素(U型)检测p-T153/Y155和总TDP-43的可溶性部分。加载等体积的总裂解物和RIPA可溶性部分，而尿素部分的浓度高出5倍。B、，UPS抑制剂MG132（20μ米持续5小时）、热休克（HS:43°C持续30分钟）、海藻糖（100米米24小时），thapsigargin（THP:1μ米和血清饥饿（24小时）。C、，对照和热休克处理HeLa细胞的荧光显微镜检测p-T153/Y155和应激颗粒标记物TIAR。箭头表示TIAR正应力颗粒。D、，对照和MG132处理的HeLa细胞（20μ米，5小时）。箭头表明用磷酸依赖性抗体检测到TDP-43细胞质聚集物。酒吧，10微米。E中，对照和海藻糖（100 m米，24 h）处理的HeLa细胞。自噬小泡的形成(箭头,下部面板)GFP融合微管相关蛋白1A/1B-轻链3转染后可见(生命周期3).酒吧，25微米。

为了确定Thr-153和Tyr-155的磷酸化是否与疾病条件下的病理包涵体有关，我们分析了FTLD病例中的p-T153/Y155定位。作为TDP-43病理学存在的阳性对照，我们使用了一种识别磷酸化Ser-409/410的抗体，这是TDP-43疾病相关包涵体的一个成熟标记(25). 额颞叶痴呆脑切片的免疫组织化学分析显示，p-T153/Y155在聚集物中没有显著积聚(补充图S5). 这些初步观察表明，与先前确定的磷酸化事件不同(即。Ser（P）-403/404和Ser（P）-409/410），P-T153/Y155与FTLD中聚集物的形成无关。这与我们基于细胞的数据相一致，该数据表明p-T153/Y155调节TDP-43的功能和定位，并在促进TDP-43错误折叠的条件下与可溶性蛋白相关联(图4A类). 然而，目前我们不能排除在不同类型的TDP-43蛋白病中观察到p-T153/Y155水平升高或特定检测模式的可能性。

暴露于氧化应激和蛋白毒性应激后，观察到TDP-43向应激颗粒（SG）的补充(11). 为了研究热休克时磷酸化是否介导TDP-43向SG的募集，我们分析了p-T153/Y155与SG标记物T细胞限制性细胞内抗原相关蛋白（TIAR）的共定位。热休克后细胞质中形成TIAR阳性SGs(图4C类). 然而，我们没有观察到p-T153/Y155或磷酸依赖性TDP-43向SG的招募，这与之前的报告一致(27). 总之，我们的研究结果表明，Thr-153/Tyr-155的磷酸化与TDP-43的聚集或应激颗粒募集无关。相反，我们发现在触发TDP-43错误折叠的条件下，如热休克，p-T153/Y155与蛋白质的可溶性构象有关。然而，此时，我们不能排除TDP-43聚集增加导致Thr-153/Tyr-155无法磷酸化的结构的可能性。

接下来，我们询问在HSR期间，TDP-43磷酸化的增加是否发生在介导TDP-43清除的两条途径激活时：泛素-蛋白酶体系统（UPS）和宏观自噬（自噬）(28,–30). 用UPS抑制剂MG132处理的细胞，其诱导TDP-43的积累，最终导致UPS降解(28)，未显示p-T153/Y155水平的变化(图4B类). 免疫荧光分析显示MG132处理后总TDP-43的细胞质聚集(图4D类)，如前所示(29). 然而，我们观察到p-T153/Y155与这些聚集体没有共定位。然后我们询问p-T153/Y155是否介导TDP-43的自噬相关降解。将细胞暴露于增加自噬（海藻糖、血清饥饿）或阻止自噬体-溶酶体融合（thapsigargin）的条件下。在这些条件下，p-T153/Y155的水平不受影响(图4B类). 此外，我们未观察到p-T153/Y155与微管相关蛋白轻链3（LC-3）（自噬囊泡的标记物）的共定位(图4E类). 这些结果表明，Thr-153/Tyr-155的磷酸化与已知的TDP-43清除途径无关。

MEK调节Thr-153/Tyr-155的TDP-43磷酸化

双特异性有丝分裂原激活蛋白/ERK激酶（MEK）（亚型1/2，MAP2K1/2（地图2K1/2）)是基于一致序列预测分析在Thr-153/Tyr-155磷酸化的主要候选。Thr-153/Tyr-155区域与已建立的MEK底物ERK1/2（细胞外信号调节激酶）的双磷酸化位点的氨基酸序列比对如图所示图5A类磷酸化位点显示出TEY基序的保守性，与MAPK家族中其他激酶的双重磷酸化共有序列相比，TEY基序对于MEK底物是独特的。基序中的谷氨酸残基对MEK高效磷酸化ERK1/2至关重要(31). 热休克处理显著增加MEK的活化和磷酸化(图5B类)，与之前的结果一致(32). 这触发了ERK的磷酸化和活化以及下游底物MSK1的磷酸化(图5B类). 我们使用特定激酶抑制剂PD184352和PD98059研究了TDP-43的MEK磷酸化。热休克前的抑制剂治疗阻断了Thr-153/Tyr-155磷酸化(图5C类). 然而，下游激酶ERK的抑制法国财务报告180204没有降低Thr-153/Tyr-155磷酸化(图5C类). 添加冈田酸（通过抑制蛋白磷酸酶PP1/2A阻止MEK失活）可增加对照和热休克条件下的p-T153/Y155水平(图5D类). 通过添加MEK抑制剂PD184352阻止了这种作用。此外，MEK1的组成活性突变体GFP-MEK1_DD（S218D/S222D）的过度表达显著增加了非处理细胞中Thr-153/Tyr-155的TDP-43磷酸化(图5E类). 我们还观察到，与对照组相比，在含有组成活性MEK的情况下，血凝素（HA）标记的TDP-43的磷酸化增加(补充图S6). 总之，这些发现强烈表明TDP-43是MEK的新底物，热休克不是组成活性MEK磷酸化Thr-153/Tyr-155的先决条件。

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TDP-43在Thr-153/Tyr-155被MEK特异性磷酸化。 A、，围绕Thr-153和Tyr-155的人TDP-43氨基酸序列(下划线的)与人ERK1激活环序列一致，其中MEK在Thr-202和Tyr-204磷酸化(下划线的).B、，热休克和对照处理的HEK-293和SH-SY5Y细胞的免疫印迹。显示了磷酸依赖性蛋白的水平，并使用微管蛋白作为负荷控制。C、，用特定MEK抑制剂PD184352（10μ米)和PD98059（50μ米)和下游激酶ERK的特异性抑制剂法国财务报告180204(30 μ米). 在抑制剂处理1小时后，细胞受到热休克。D、，蛋白磷酸酶PP1/2A抑制剂冈田酸（0.5μ米)在热休克前与甲乙酮抑制剂PD184352合用1小时。E中，在没有热休克的情况下，根据SH-SY5Y细胞中组成活性GFP-MEK_DD突变体和GFP对照结构的表达分析p-T153/Y155水平。

Thr-153和Tyr-155的MEK磷酸化降低TDP-43对拼接的调节

为了探讨Thr-153/Tyr-155磷酸化对TDP-43功能的影响，我们使用了细胞剪接报告。成熟的囊性纤维化跨膜电导调节器（CFTR）第9外显子微基因报告子(6,33)与Thr-153/Tyr-155拟磷酸TDP-43变体（T153E/Y155E）组合使用。TDP-43通过与3′剪接位点上游富含GU的序列结合防止外显子9剪接(图6A类) (34). TDP-43与该序列的直接结合招募了额外的hnRNP，特别是hnRNP A2，阻止了空间位阻对3′剪接位点的识别(6). 在对照条件下，外显子9显示26%的内含物，正如预期的那样，siRNA-介导的TDP-43敲除大大增加了外显子内含物(补充图S7A类) (30). 在表达siRNA-resistant野生型TDP-43（WTsiRes）后，重新建立剪接抑制(6,33). 双突变Phe-147和Phe-149 to Leu（F147L/P149L）在我们的检测中被用作对照，因为它由于RNA结合大大降低而无法调节剪接(35,36). 正如预期的那样，F147L/F149L与野生型相比活性下降了约50%(图6B类). 我们发现，与野生型和T153E/Y155A相比，磷酸类似物T153E/Y155E替换导致剪接抑制减少30%，其中磷酸位点突变为丙氨酸以阻止磷酸化(图6B类). 为了进一步分析Thr-153/Tyr-155和MEK调节对TDP-43活性的影响，进行了类似的分析。图6C类显示了对照细胞和siRNA处理细胞的CFTR第9外显子剪接活性作为MEK_DD表达的功能。中显示的相对TDP-43活性图6C类是与WTsiRes细胞相比，每种情况下CFTR第9外显子内含物水平的测量值。在对照细胞中，MEK_DD将CFTR外显子9剪接的抑制降低了约30%，并且在TDP-43被敲除后这种作用消失。这些结果表明，内源性TDP-43的MEK_DD磷酸化降低了剪接调控活性，就像磷酸化突变一样(图6B类). 因此，在WTsiRes TDP-43存在的情况下，MEK_DD表达对报告基因外显子剪接的影响被重新确立，其中MEK_D将剪接调控降低了约50%。相反，MEK_DD的这种作用在siRes、非磷酸化、T153A/Y155A TDP-43突变体表达后显著减弱。总之，我们的观察结果表明，Thr-153/Tyr-155的MEK磷酸化抑制了TDP-43介导的剪接调控。

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Thr-153/Tyr-155的拟磷酸取代调节TDP-43活性。 A、，TDP-43活性CFTR第9外显子微基因细胞报告子的示意图。外显子和内含子区域表示为盒和线分别为。TDP-43绑定到UG重复序列（UG13)靠近3′剪接位点抑制外显子9的内含子。拼接的两个主要产品如下所示正确的。B、，抗RNAi（siRes）TDP-43突变体在siRNA-处理的HeLa细胞中表达。比较野生型siRes计算相对TDP-43活性。以RNA结合缺陷突变体F147L/F149L的作用作为对照。误差线，标准偏差。，n个> 5.C、，组成活性MEK_DD或对照GFP载体，在siRNA或对照处理细胞中表达。报告者活动与siRes野生型（WT）相关先生). 数值代表独立转染实验的平均值。误差线，标准偏差。，n个≥ 4.

为了阐明T153E/Y155E的剪接调节活性降低是否可能是由RNA结合亲和力的变化引起的，我们使用细菌表达系统生成了重组TDP-43。我们在N末端表达并纯化TDP-43融合到His-SUMO标签，以提高产量和蛋白质溶解度。接下来，我们开发了一种基于荧光的RNA结合分析来测量表观解离常数(K（K）d日（应用程序）)TDP-43-RNA相互作用作为电迁移率变化分析（EMSA）的替代方法。这种新方法基于我们的观察，即TDP-43的固有荧光在RNA结合时显著降低（约50%）。通过此分析，我们获得K（K）d日（应用程序）=2.3±0.7牛顿米用于绑定到A（GU）的野生型TDP-436以1:1的化学计量比(图7A类,表1)与EMSA获得的值密切一致(37). 正如预期的那样，Phe-147和Phe-149（F147L/P149L）的突变之前显示与GU重复序列直接接触(35,36)，显示出结合亲和力大大降低(表1). 我们研究了色氨酸残基对与RNA结合相关的TDP-43固有荧光变化的贡献，以进一步验证我们的分析。与全长TDP-43相比，C末端（ΔC）或N末端和C末端结构域（片段102-269）的去除并没有显著改变亲和力或降低荧光变化(表1). 这些结果表明，N和C末端的Trp残基对与RNA结合相关的荧光变化没有贡献。此外，它们与先前的工作一致，表明TDP-43的羧基和氨基末端结构域不参与RNA结合(35). 然后，我们在RRM1中发现的113和172位取代了剩余的色氨酸。将Trp-113替换为Ala（W113A）会导致荧光信号变化的丢失，这是RNA的一个功能，而W113F会将荧光变化减少50%，但对K（K）d日（应用程序）(表1). Trp-172突变为苯丙氨酸或丙氨酸在我们的分析中不影响结合亲和力或荧光变化(表1). 我们的研究结果强烈表明，Trp-113区域周围的变化是观察到的RNA结合后固有荧光降低的主要原因。Trp-113与富含GU的RNA进行序列特异性接触，该残基的替换降低了结合亲和力(36,37). 根据我们的数据，这些相互作用会导致固有荧光发生剧烈变化，可以利用这些变化来准确测量RNA结合亲和力。

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基于荧光的测定TDP-43 RNA与GU重复物结合亲和力的方法。 A、，固有荧光(F类)A（UG）滴定后的重组TDP-436在没有RNA的情况下，通过荧光使RNA标准化(F类0). 所示为F类/F类0四种不同TDP-43浓度下的值和数据根据方程式1和2在“实验程序”下。表观平衡离解常数的最佳拟合值，K（K）d日（应用程序），如所示表1.B、，全长TDP-43的示意图，突出显示RRM1中的Trp-113和Trp-172。下部面板显示了与富含GU的RNA结合的102–269片段的表面和带状表示(36). RRM1中的色氨酸残基在洋红.

表1

野生型和突变型TDP-43的结合亲和力

表观平衡离解常数K（K）d日（应用程序）测定重组TDP-43与A（GU）的结合6RNA。

K（K）d日（应用程序）
n个米
野生型2.3 ± 0.5
ΔC（aa 1–261）2.8 ± 0.6
RRM1-2（aa 102–269）2.2 ± 0.5
RRM1–2个W113AND（无损检测）一
RRM1–2个W113F6.0 ± 0.6
RRM1–2个W172F2.0±0.4
RRM1–2 W172A5.0 ± 0.6
147/149升ND（无损检测）一
T153A/Y155A3.1 ± 0.6
T153E/Y155E10 ± 3

一ND，未确定。

使用基于荧光的分析对T153E/Y155E进行分析，结果显示a（GU）减少了5倍6与野生型相比，在存在拟磷酸取代的情况下的结合亲和力，而相应的丙氨酸突变不影响结合(表1). 这些结果与磷酸化取代存在时剪接调控功能降低一致，并强烈表明磷酸化调节TDP-43活性。

讨论

TDP-43通过不同的RNA处理机制调节数百个基因，特别是通过剪接的调节(18,19,22). TDP-43细胞定位高度动态，核导入缺陷与聚集和神经毒性有关(9,38,39). 这些不同的TDP-43功能在细胞中是如何控制的，目前还不清楚。先前确定的位于Ser-403/404和Ser-409/410的TDP-43磷酸化位点与TDP-43功能的控制关系不大，并且大多是病理聚集物的标记(25,26). 在这里，我们报告了TDP-43在Thr-153/Tyr-155的双重磷酸化，并提供了强有力的证据，证明它是由MAPK/ERK激酶MEK特异控制的。这种磷酸化被人类细胞中的HSR显著上调。在测试条件下，p-T153/Y155的增加与聚集或蛋白质清除率增加无关。相反，我们发现p-T153/Y155在促进TDP-43错误折叠的条件下仍然可溶。为了支持p-T153/Y155的功能作用，我们的结果表明，MEK活性增加显著改变了TDP-43介导的细胞外显子剪接控制。我们的观察结果表明，甲乙酮的作用是通过Thr-153/Tyr-155的磷酸化介导的。TDP-43活性的降低至少可以部分解释为RNA结合减少，因为我们发现T153E/Y155E以5倍的低亲和力结合富含GU的RNA。未来的研究应确定磷酸化是否改变RNA序列特异性，或是否影响TDP-43调控剪接所需的蛋白质相互作用，例如与hnRNP A2的结合(6).

热休克对TDP-43磷酸化的显著上调，以及热休克因子1（HSF1）激活后TDP-43聚集减少的最新研究结果(40,41)，指出HSR在TDP-43内稳态和翻译后调节中以前未被重视的作用。除了高温应激外，HSR还被其他类型的损伤激活，这些损伤会破坏蛋白质的体内平衡(42,43)这种反应的缺陷在包括神经退行性变在内的人类疾病中普遍存在。针对HSR途径的治疗，如对ALS有良好疗效的治疗(44)，可专门针对TDP-43。我们认为p-T153/Y155可能介导与伴侣蛋白/热休克蛋白的相互作用，防止TDP-43错误折叠和聚集，如DNAJB2a和Hsp70(40). 或者，它可能与HSR介导的清除途径有关，这与UPS和自噬不同，后者可阻止聚集。我们还提出了另一种诱人的设想，即TDP-43可能调节HSR靶基因的表达，其水平在蛋白毒性应激反应期间由选择性剪接控制(45). 根据我们的研究结果，TDP-43的HSR-特异性功能可能由Thr-153/Tyr-155的磷酸化控制。

MEK在热休克时被激活，最近的研究表明，通过磷酸化和激活HSF1，MEK至少部分地维持了蛋白质的体内平衡(32). 以前，唯一被认可的其他MEK底物是ERK。现在，我们提供证据证明TDP-43是一种在有无热冲击条件下的新型MEK底材。MEK可能不是唯一一个在Thr-153/Tyr-155磷酸化TDP-43的激酶，然而，我们观察到在特异性抑制MAPK相关的双重特异性激酶，即JNK和p38激酶后，HSR诱导的p-T153/Y155水平没有显著降低(补充图S8). 我们的证据表明，与活性MEK相关的细胞过程，如增殖和分化，也可能诱导p-T153/Y155并调节TDP-43功能。基于我们的发现，p-T153/Y155与TDP-43在触发蛋白质错误折叠的条件下的溶解度有关，未来的工作应该确定MEK激活是否能防止TDP-43聚集并阻断TDP-43相关的神经毒性。

我们的发现表明磷酸化TDP-43的特异性定位表明，核仁TDP-43募集受磷酸化调节，并可能为之前未被认识的TDP-43在与核仁RNA加工相关的细胞功能中的作用提供新的见解。在c9或f72六核苷酸重复扩增是家族性ALS和FTD最常见的原因(46,47)，核仁室被富含精氨酸（GR和PR）二肽重复序列的产生所破坏(48,–50). GR和PR有毒，积聚在核仁中，并与包含TDP-43等低复杂性序列域的蛋白质结合(51,52). 这些发现强烈表明，ALS/FTD的主要致病机制之一是核仁功能异常。未来的实验将确定TDP-43的功能，特别是p-T513/Y155在核仁特异性RNA加工中的作用，以及富含精氨酸二肽重复序列对该功能的影响。这可能阐明TDP-43和c9或f72-ALS/FTD发病机制中的相关功能障碍。

实验程序

材料

除非另有规定，否则所有试剂均来自Sigma。人类细胞系：神经母细胞瘤SH-SY5Y、上皮性HeLa和胚胎肾HEK-293细胞购自ATCC。

质粒构建

先前描述了用于哺乳动物表达的FLAG标记野生型TDP-43，siRNA-resistant结构(7). 这是使用QuikChange定点突变试剂盒（安捷伦科技公司）生成TDP-43突变体用于哺乳动物表达的定点突变模板。MEK1_DD-GFP（S218D/S222D）是以野生型MEK1-GFP构建物（Addgene，14746）为模板，通过定点突变产生的。pEGFP-LC3载体购自Addgene（24920）。通过在pET-28b/His-SUMO中克隆TDP-43来制备细菌TDP-43表达的构建体（SUMO-TDP43）(53)使用pQTDPBam_FW和SacTDPend_RV。该构建物是通过上述定点突变产生细菌表达TDP-43突变体的模板。pQTDPBam_FW和Sac_269_RV；Bam_102_FW和Sac_269_RV分别用于克隆ΔC-TDP-43和片段102-269。用于诱变和克隆的寡核苷酸在补充表S1通过将shT2_FW和shT2_RV退火产物连接到经AgeI和EcoRI消化的pLKO.1-puro载体中，生成TDP-43下调的pLKO载体。

细胞培养、分离和剪接分析

人类细胞系生长在生长培养基中，即Dulbecco改良的Eagle's培养基，4500毫克/升葡萄糖，我-谷氨酰胺和碳酸氢钠，并补充10%的过滤胎牛血清。对于可溶和不可溶部分，将细胞颗粒重新悬浮在RIPA缓冲液中（150 m米氯化钠，50米米Tris，pH 8.0，1%Nonide P-40，5 m米EDTA、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠、1×蛋白酶抑制剂混合物、1×磷酸酯酶抑制剂混合物（罗氏应用科学））。使用Biolruptor Pico（Diagenode）对裂解液进行超声波处理，在4°C下进行10，30 s开/30 s关的循环，并在40000×克在4°C下保持30分钟。用RIPA缓冲液冲洗颗粒，并将最终颗粒重新悬浮在尿素缓冲液（7米尿素，2米硫脲、4%CHAPS和30m米Tris，pH 8.5）。四环素诱导下稳定表达HA标记TDP-43的HEK-293细胞(7)如前所述用于免疫沉淀实验(54). 如前所述，对TDP-43进行RNAi介导的下调(33)以siCONTROL非靶向siRNA#1（Dharmacon）作为对照。shRNA介导的TDP-43下调是通过使用pLKO载体系统（pCMV8.2ΔR，pCMV-VSV-G，圣路易斯大学Susana Gonzalo实验室的慷慨捐赠）在HEK-293T细胞中产生慢病毒颗粒来实现的。生成shRNA荧光素酶慢病毒颗粒用于控制转导。根据制造商的协议，在Opti-MEM还原血清培养基（Life Technologies）中用Lipofectamine 2000（生命技术）转染HEK-293T细胞。6小时后，用生长培养基替换培养基，并在37°C、5%CO下培养细胞248 h。48 h后，收集含慢病毒的培养基，并用0.45μm过滤器进行过滤消毒。用对照和TDP-43-shRNA慢病毒颗粒以及Polybrene转染试剂转染HeLa细胞。转导后48小时通过嘌呤霉素筛选（1μg/ml）产生TDP-43敲低克隆。免疫印迹证实TDP-43下调。

根据制造商的协议，在siRNA（Life Technologies）的情况下，对瞬时转染了Lipofectamine 2000和Oligowetamine的HeLa细胞进行剪接分析。如前所述，使用CFTR报告人迷你基因进行分析(6,33). 简单地说，在用控制或siRNA TDP-43（0.1 nmol）以6孔格式进行两次转染后，用野生型或突变型TDP-43的FLAG-TDP43 siRNA抗性构建物和CFTR报告物（各0.3μg）共同转染细胞(17). 24小时后提取RNA，并进行RT-PCR分析，以比较外显子包含/排除水平。PCR产物用ImageJ定量。

磷酸酶处理

根据制造商的说明，将含有～30μg总蛋白的细胞裂解液与400单位λ-蛋白磷酸酶（新英格兰生物实验室）在37°C下培养1小时。

肽竞争

p-T153/Y155抗体与对应于在Thr-153和/或Tyr-155位置磷酸化的TDP-43的148-161氨基酸的肽孵育。使用非磷酸化肽作为对照。在免疫印迹或免疫荧光之前，将1mg/ml的p-T153/Y155-TDP-43抗体与0.02μg/ml（低）和1mg/ml（高）肽在25°C下孵育1h。

免疫印迹和免疫荧光显微镜

将细胞颗粒重新悬浮在裂解缓冲液中（0.25米氯化钠，15米米Hepes，pH 7.5，0.5%Nonide P-40，10%甘油，1×蛋白酶抑制剂混合物，1×磷酸酯酶抑制剂混合物（罗氏应用科学））。除非另有规定，否则加载约30μg总蛋白进行免疫印迹分析。样品通过Bradford测定法进行测量。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移至硝化纤维素（0.22μm，GE Healthcare）。用5%BSA/TBS-Tween封闭膜，并通过增强化学发光（ECL、Pierce、ThermoFisher Scientific）进行免疫检测。使用针对磷酸依赖性TDP-43的抗体来比较p-T153/Y155水平和总TDP-43。微管蛋白或GAPDH被用作负荷控制。如前所述进行间接免疫荧光(17). 在配备DFC350FX数码相机（徕卡微系统公司）的徕卡DM5000B显微镜上观察细胞。使用LAS AF软件，在TCS SP5显微镜（徕卡）上使用一个×63/1.4油浸物镜进行共聚焦显微镜研究。

免疫组织化学

我们研究了来自西北神经病理学核心组织库（NADC AG13854）的具有TDP-43病理学和年龄匹配对照的FTLD病例。根据之前描述的方案，对额叶皮层和齿状回切片进行免疫染色(55)带有p-T153/Y155-TDP-43。使用pS409/410（Cosmo Bio USA）抗体作为对照。

重组TDP-43的表达与纯化

重组TDP-43在BL21（DE3）中表达大肠杆菌来自SUMO-TDP43质粒的细胞。诱导用0.3 m米异丙基β-d日-硫代吡喃半乳糖苷和细胞在25°C下生长4 h。细胞颗粒在裂解缓冲液（500 m）中重新悬浮米氯化钠，50米米Tris，pH 8.0，1 m米三（2-羧乙基）膦，10%蔗糖，10%甘油，5 m米CHAPS、0.1%脱氧胆酸钠、无EDTA蛋白酶抑制剂混合物、2.5μg/ml溶菌酶、10μg/ml DNase I）。在20000×克在冰上超声处理后，温度为4°C。通过亲和色谱法（AKTA-Start，GE Healthcare）在镍-硝基三乙酸树脂（McLab）上分离蛋白质。用缓冲液A:500 m清洗柱米氯化钠，50米米Tris，pH 8.0，10%蔗糖，10%甘油，50 m米咪唑。重组TDP-43用缓冲液A和300mL洗脱米咪唑。如前所述，用Ulp1蛋白酶以1:1000（w/w）的比例去除SUMO标签(53). Ulp1由Sergey Korolev的团队慷慨提供。所有步骤均在4°C下进行。

荧光滴定RNA结合分析

随着A（GU）浓度的增加，在滴定时测量TDP-43的固有荧光6荧光-4分光光度计上的RNA（Horiba Scientific）。在1-ml试管中，在10–100 n范围内的四种不同重组TDP-43浓度下进行荧光读数米200 m处米氯化钠，20米米Tris，pH 8.0，0.1%PEG-8000，2%甘油，25°C。蛋白质在280 nm处激发（狭缝5/10，曝光时间0.02 s），并在340 nm处记录发射。在这些条件下，我们没有观察到明显的光漂白。使用Origin（8.1版，OriginLab）根据方程式1,

F类= F类0+ΔF类最大值⁡θ
（等式1）

哪里F类是荧光，F类0是F类在没有RNA的情况下，ΔF类最大值是总变化F类饱和时。

θ=K（K）d日(应用程序)+N个T型t吨+R（右）t吨负极(K（K）d日(应用程序)+N个T型t吨+R（右）t吨)2负极4N个T型t吨R（右）t吨2N个T型t吨
（等式2）

方程式2用表观平衡离解常数来描述分数饱和度K（K）d日（应用程序），TDP-43的总浓度(T型t吨)，总RNA浓度(R（右）t吨)和TDP-43：RNA结合化学计量，N个。同时分析四条TDP-43-RNA结合曲线，以获得K（K）d日（应用程序）和N个.

抗体

免疫印迹和间接免疫荧光采用：兔多克隆和鼠单克隆抗TDP-43（ProteinTech 10782-2-AP，Abcam，ab109535）、抗TIAR（BD Biosciences，610352）、抗纤维素酶（Abcam，ab4566）、鼠抗微管蛋白（Andres Muro，Trieste，Italy）、抗GAPDH（Abcam、ab181602）、抗MEK（Abcam，ab178876）、，抗磷酸化-MEK1/2（细胞信号，编号9154）、抗ERK1/2（电池信号，编号4695）、抗磷酸化-ERK1/2（手机信号，编号4370）、抗MSK1（电脑信号，编号3489）和抗磷酸化-MSK1。识别p-T153/Y155和p-Y155-TDP-43的兔多克隆抗体由马萨诸塞州21世纪生物化学公司生产。包括在Thr-153/Tyr-155或Tyr-155磷酸化的TDP-43氨基酸148-161的肽用作抗体生产的表位。通过亲和纯化可增强抗体特异性，以选择与磷酸化的Thr-153/Tyr-155或Tryr-155结合，但不与相应的非磷酸化肽结合。

作者贡献

W.L.、A.N.R.、B.L.、P.S.、E.E.F.、C.R.K.、R.L.F.、E.H.B.和Y.M.A.设计了研究，进行了实验并分析了数据。Y.M.A.写了手稿。

补充材料

补充数据：

致谢

我们感谢Enrico Di Cera和同事们就基于荧光的RNA结合分析的设计和分析进行的有益讨论；Olga Koroleva为重组蛋白生产提供宝贵建议；Tom Misteli对手稿提出意见和建议；和亚历山德罗·文迪尼发表评论和进行有益的讨论。

*这项工作得到了美国国立卫生研究院、NINDS拨款K01 NS082391和圣路易斯大学总统研究基金拨款230175的部分支持。作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突内容完全由作者负责，不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为sbox.jpg本文包含补充图S1–S8和表S1.

5使用的缩写如下：

FTLD公司
额颞叶变性
注册风险管理
RNA识别基序
hnRNP公司
异质核核糖核蛋白
TDP-43型
TAR DNA结合蛋白
高铁
热冲击响应
DFC公司
致密纤维组分
新加坡
应力颗粒
TIAR公司
T细胞限制性细胞内抗原相关蛋白
不间断电源
泛素蛋白酶体系统
CFTR公司
囊性纤维化跨膜电导调节器
高铁
热冲击系数。

工具书类

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文章来自生物化学杂志由以下人员提供美国生物化学和分子生物学学会