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.2016年10月20日；167（3）：774-788.e17。
doi:10.1016/j.cell.2016.10.002。

C9orf72二肽重复损伤无膜细胞器的组装、动力学和功能

Kyung-Ha Lee（李庆华） 1, 张培培 1, 金洪珠（Hong Joo Kim） 1, 戴安娜·米特里亚 2, 莫霍纳·萨卡尔 1, 布莱恩·德·弗雷鲍姆 1, 杰林·西卡 2, 毛拉·考夫林 1, 詹姆斯·梅辛 1, 阿曼丁·莫利克斯 1, 布莱恩·麦克斯韦 1, 南楚金 1, 贾姆希德·特米洛夫 1, 珍尼弗·莫尔 1, 里贾纳·马里亚·科莱蒂斯 三, 蒂莫西·萧 4, 冰白 2, 彭俊敏 5, 理查德·克里瓦基 6, J保罗·泰勒 7
附属公司

C9orf72二肽重复损伤无膜细胞器的组装、动力学和功能

Kyung-Ha Lee（李庆华）等。 单元格. .

摘要

六核苷酸重复序列GGGGCC（G4C类2)C9ORF72是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）最常见的病因。成绩单携带（G4C类2)扩张经历非传统的非ATG依赖性翻译，产生被认为与疾病有关的有毒二肽重复序列（DPR）蛋白。在这里，我们鉴定了所有DPR的相互作用组，发现含精氨酸的DPR，polyGly-Arg（GR）和polyPro-Arg（PR），与RNA-binding蛋白质和低复杂度序列域（LCD）蛋白质相互作用，这些蛋白质通常介导无膜细胞器的组装。事实上，大多数GR/PR相互作用物是无膜细胞器的组成部分，如核仁、核孔复合体和应力颗粒。果蝇的遗传分析证明了这些相互作用与DPR毒性的功能相关性。此外，我们发现GR和PR改变了含LCD蛋白质的相分离，潜入其液体组件并改变其材料属性，导致多个无膜细胞器的动力学和/或功能受到干扰。

关键词：C9ORF72；肌萎缩侧索硬化；二肽重复；无膜细胞器；核仁；相分离；应力颗粒。

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数字

图1
图1。蛋白质组分析显示GR和PR共享一组在LCD中富集的共同作用物
（A） GFP-GR公司50-和GFP-PR50-SAINT概率评分显示的相互作用蛋白。绿色，与LCD交互；灰色，没有液晶显示器的互动器。（B） 说明GFP-GR之间重叠（P<1.17e-37，超几何检验）的维恩图50-和GFP-PR50-相互作用蛋白。（C） GR/PR相互作用组中含有LCD的蛋白质的百分比与人类蛋白质组中含LCD的蛋白的百分比相比。（D） 基因本体分析显示，作为无膜细胞器组成部分的蛋白质富集。P值通过DAVID算法得出。另请参见图S1。
图2
图2。GR/PR相互作用组与毒性的相关性果蝇属
（A） 在指定温度下，由GMR-GAL4驱动的指定转基因表达导致的眼部表型。（B，C）由（B）OK371-GAL4-driven或（C）GMR-GAL4-drven在指定温度下表达指定转基因产生的卵-成虫存活表型。n=3个生物重复，***通过双向方差分析，Tukey的事后检验，P<0.0001。（D） 在Neuro-2a细胞中异位表达指示的DPR构建体后的MTT测定。通过单向方差分析，n=5个生物重复，**P<0.01，***P<0.001。（E） 具有与GR/PR相互作用体相关的无膜细胞器的细胞示意图。GR活性增强剂（红色）和抑制剂（绿色）按无膜细胞器分类。数据表示为（B–D）中的平均值±SEM。另请参见图S2。
图3
图3。GR和PR二肽定位于核仁亚结构并损害NPM1的生物物理性质在体外
（A） mCherry-GR的细胞定位50或-PR50HeLa细胞中的（红色）和内源性G3BP1（绿色）。DAPI显示为蓝色。比例尺，10μm。（B） 结构光照显微镜显示GFP-GR亚核仁定位50和-PR50HeLa细胞中的（绿色）、UBF1（青色）和纤维素酶（红色）。根据DAPI染色勾画细胞核轮廓（未显示）。比例尺，1μm。（C） GR在GC和DFC中本地化，但不包括在FC中。纤维素酶和GFP-GR的典型线扫描强度图50将显示。比例尺，1μm。（D） 由NPM1和富R基序介导的LLPS的示意图表示。NPM1具有N端寡聚结构域（OD，金）、三个酸性域（A1，A2，A3，红色）和一个C端RNA识别基序（RRM，紫色）。（E） 聚精氨酸肽相分离在体外NPM1为1:1化学计量比。所示为20μM NPM1，GR的共焦显微镜图像20和公关20（左面板）和20μM NPM1与20μM所示肽的二元混合物（右面板）。1μM的总NPM1和每个肽分别用Alexa488或TAMRA标记。比例尺，10μm。（F） NPM1（20μM）与指示浓度的SURF6和GR的三元混合物的相图20（顶部）或SURF6和PR20（底部）。指出了液滴形成的单相区（红色钻石）和两相区（绿色圆圈）。（G） 希腊20（左）和PR20（右）在1:1化学计量比（DPR:NPM1）下与NPM1相分离，但在较高化学计量比下不相分离。使用共焦荧光显微镜检测Alexa488-NPM1。比例尺，10μm。（H，I）。GR的滴定20（H） 和公关20（一） （顶部浓度）进入液相液滴，液滴由1:1 NPM1:SURF6肽组成，以不同浓度制备（如左图所示）。使用共焦荧光显微镜检测Alexa488-NPM1（各面板左侧）和TAMRA-DPR肽（中间）。比例尺，10μm。参见图S3和S4。
图4
图4。GR和PR二肽破坏活细胞中的核仁动力学和功能
转染（A，B）GFP-NPM1或（C，D）GFP-NCL和mCherry-GR的（A–D）HeLa细胞50或-PR50使用FRAP分析结构。黄色圆圈表示光漂白区域。显示了光漂白前后同一区域的代表性图像。比例尺，10μm。光漂白区（B）GFP-NPM1或（C）GFP-NCL随时间的荧光。n=GFP-NPM1每个样品10–12个细胞；n=GFP-NCL每个样本7–8个细胞，***P<0.001，经Student t检验，成对。（E） GFP-GR的表达显示了核仁纤维中心（FC）的平均直径50或公关50二肽或对照。P<0.01，方差分析。比例尺，1μm。每个条件下至少分析12个细胞（n=2个生物重复）。显示了由DFC包围的FC的典型线扫描强度图。（F） rRNA特异性抗体（红色）显示转染GFP-GR的HeLa细胞中的rRNA水平50或-PR50或仅GFP。（G） 量化细胞，显示rRNA相对于相邻未转染细胞的正常（灰色）和减少（白色）免疫染色百分比。n=3个生物重复，***P<0.001（单向方差分析）。比例尺，10μm。数据在（B）、（D）和（E）中表示为平均值±SEM。另请参见图S4。
图5
图5。GR和PR二肽促进低动力应激颗粒的自发组装并抑制细胞翻译
（A） GFP-GR的细胞定位50、GFP-PR50或HeLa细胞中的GFP和内源性TDP-43（红色）和eIF4G（紫色）。DAPI显示为蓝色。比例尺，10μm。（B） GFP、GFP-GR表达后HeLa或U2-OS细胞中含有应激颗粒的细胞百分比50或GFP-PR50.n=2个生物重复。（C） G3BP1-GFP（绿色）和mCherry，mCherry-GR显示的HeLa细胞中的应力颗粒动力学50或mCherry-PR50（红色）。连续14小时对活细胞进行成像（另请参阅电影S1–S3）。白色箭头，细胞在成像开始时带有应力颗粒；黄色箭头，细胞在成像过程中自发形成应力颗粒。比例尺，10μm。（D） 危害分析表明有应激颗粒形成和细胞死亡的风险***经对数秩检验，P<0.0001。（E） 通过测量嘌呤霉素（红色）掺入新生肽的方式观察HeLa细胞的翻译效率；GFP（绿色）、EIF4G（紫色）。比例尺，10μm。（F） HeLa细胞翻译的量化如（E）所示。n=3个生物重复，***P<0.001（单向方差分析）。（G） 通过代谢分析监测S掺入评估转化抑制35转化为新翻译的蛋白质。n=5个生物重复，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05，双向方差分析，Dunnett的事后检验。数据表示为（F）和（G）中的平均值±SEM。另请参见图S5和电影S1–S3。
图6
图6。GR和PR二肽改变hnRNPA1和TIA-1的生物物理性质，并改变活细胞中的应激颗粒动力学
（A） hnRNPA1示意图。RRM，RNA再认识基序；LCD，低复杂度序列域。（B） 将DPR并入hnRNPA1的相分离液滴中。hnRNPA1（DIC）与TAMRA标记多肽混合的荧光图像。比例尺，10μm。（C） hnRNPA1的相图作为蛋白质浓度和多肽浓度的函数。希腊20和公关20显著改变相图。红色和绿色符号表示样品分别处于单相（红色）或两相（绿色）状态。（D） TIA-1示意图。（E） 将DPR并入TIA-1的相分离液滴中。TIA-1（DIC）与TAMRA标记多肽混合的荧光图像。比例尺，10μm。（F） TIA-1的相图使用与（C）相同的分析。（G） G3BP1-GFP转染的HeLa细胞要么用NaAsO2处理以诱导应激颗粒，要么用mCherry-GR联合转染50然后进行光漂白（黄色圆圈）和荧光恢复监测。比例尺，10μm。（H） 光漂白区域随时间的荧光。通过配对的Student t检验，数据表示为n=7–8的平均值±SEM，***P<0.001。另请参见图S6和影片S4–S5。
图7
图7。GR和/或PR二肽损害其他无膜细胞器的组装或动力学
（A） SRSF7-GFP和mCherry-GR转染HeLa细胞的核斑点动力学50或-PR50使用FRAP分析结构。黄色圆圈标记光漂白区域。显示了光漂白前后同一区域的代表性图像。比例尺，10μm。（B） 光漂白区SRSF7-GFP随时间的荧光。通过配对学生t检验，数据表示为n=10，***P<0.001的平均值±SEM。（C） mCherry-PR转染HeLa细胞中Cajal小体的组装50或-GR50用抗Coilin抗体进行免疫染色。对于面板a–c（柯林染色），放大图像显示在右侧。比例尺，10μm。另请参见图S7。
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