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.2011年4月；14(4):452-8.
doi:10.1038/nn.2778。 Epub 2011年2月27日。

利用TDP-43表征RNA靶点和位置依赖性剪接调控

詹姆斯·托勒维 1, 托马·柯克, 鲍里斯·罗杰尔, 迈克尔·布莱斯, 马特奥·塞雷达, 梅利斯·凯伊奇, 朱利安·科尼格, 蒂博尔·霍托巴吉, 阿格尼丝·西村, 维拉·祖蓬斯基, 里基·帕塔尼, 悉达丹·钱德兰, 格雷戈·罗特, 布拉日·祖潘, 克里斯托弗·E·肖, 杰内·乌莱
附属公司

利用TDP-43表征RNA靶点和位置依赖性剪接调控

詹姆斯·托勒维等。 自然神经科学. 2011年4月.

摘要

TDP-43是一种主要与核RNA结合的蛋白质，在额颞叶变性（FTLD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）中形成包涵体。TDP-43在人脑中的mRNA靶点及其在RNA处理中的作用在很大程度上是未知的。使用单个核苷酸分辨率的紫外线交联和免疫沉淀（iCLIP），我们发现TDP-43在体内优先结合UG-rich序列的长簇。对患有FTLD的受试者大脑中TDP-43的RNA结合分析表明，结合增加最多的是MALAT1和NEAT1非编码RNA。我们还发现，TDP-43与前mRNA的结合以与Nova蛋白类似的位置依赖性方式影响选择性剪接。此外，我们在沉默外显子下游的深内含子位置发现了异常长的TDP-43结合簇。TDP-43调节的替代mRNA亚型中有很大一部分编码调节神经元发育或与神经疾病有关的蛋白质，突出了TDP-43对大脑剪接调控的重要性。

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数字

图1
图1。健康和FTLD-TDP脑中TDP-43 RNA结合的比较
（a）为了验证TDP-43抗体对iCLIP的特异性32在存在或不存在UV交联或抗TDP-43抗体的情况下，从对照（Ctr）或敲除（KD）HeLa细胞中分离出与TDP-43凝胶结合的P标记RNA。使用高和低RNase浓度来确认是否存在与TDP-43结合的RNA。箭头标记了凝胶上与TDP-43单体或二聚体大小相对应的位置。TDP-43输入提取物的Western分析证实了TDP-43的敲除，GAPDH被用作装载控制。完整图像如补充图1a所示（b）TDP-43 iCLIP实验中映射到不同RNA区域的四种样本中cDNA（在映射到人类基因组的所有cDNA中）的比例。（c）映射到不同类型ncRNAs的cDNA的比例。（d）在任何实验中，映射到具有至少10个cDNA的单个RNA的cDNA的比例。对照组和FTLD-TDP脑组织中变化最大的RNA标记为红色（经Student’s t检验，cDNA比例差异>0.1%，p值<0.05，单尾，方差不等）。长ncRNA MEG3（母体表达3）在FTLD-TDR中TDP-43结合减少最大。（e）实时PCR分析从对照和FTLD-TDP脑样本中分离的总RNA中TDP-43 iCLIP变化最大的转录物。（f）iCLIP中TDP-43交联位置的cDNA计数NEAT1公司实验中的基因来自SH-SY5Y和hES细胞系，以及来自不同个体的健康和FTLD-TDP组织。蓝色条代表基因组感测链上的序列，条的高度对应于cDNA计数。显著交联簇（XL簇）的位置如上图所示，两个人簇下的RNA序列如下图所示，UG重复序列为粉红色。该图显示了映射到的cDNA的平均比例NEAT1公司每个实验中的转录本（在所有映射到人类基因组的cDNA中），以及不同个体的实验之间的标准偏差。（g）iCLIP中TDP-43交联位置的cDNA计数SLC1A2型基因。橙色条代表基因组反义链上的序列。该图显示了映射到的cDNA的平均比例SLC1A2型不同实验中的3′UTR，以及不同个体实验之间的标准偏差。峰值交联位点下的RNA序列如下所示，UG重复序列为粉红色。
图2
图2。TDP-43结合基序分析
（a）健康和FTLD-TDP脑iCLIP显示了围绕所有交联位点（−30 nt到+30 nt）的61 nt序列中的倍半萜类化合物出现的z评分。给出了两个最富集的五聚体的序列和两个样品之间的皮尔逊相关系数（r）。（b）在健康大脑（蓝色）和FTLD-TDP大脑（红色）的TDP-43 iCLIP实验和健康大脑（绿色）的CELF2实验中，与不同长度的UG重复序列中的随机数据相比，交联的富集程度。（d）与来自SH-SY5Y和hES细胞的TDP-43 iCLIP实验中不同长度UG重复序列的随机数据相比，交联的富集程度，其中我们要么包括所有交联位点（深灰色），要么只包括那些映射到交联簇的位点（浅灰色）。（e）对比健康大脑（蓝色）和FTLD-TDP大脑（红色）中TDP-43交联位点周围的随机数据以及健康大脑（绿色）中CELF2实验，分析UGUGU富集的位置。（e）与来自SH-SY5Y和hES细胞的TDP-43 iCLIP实验中的随机数据相比，分析UGUGU富集的位置，其中我们要么包括所有交联位点（深灰色），要么只包括那些映射到交联簇的位点（浅灰色）。（f）TDP-43自身转录物交联(TARDBP）。复制实验被总结并显示在一条轨道上。图中显示了峰值交联位点下的RNA序列，UG和GU二核苷酸呈粉红色。
图3
图3。TDP-43的RNA剪接图
交替外显子和侧翼外显子500 nt范围内的交联簇图。图中显示了ΔIrank>1（增强外显子，红色簇）或ΔIrank<-1（沉默外显子、蓝色簇）的盒式外显子在这些区域中至少有一个交联簇。通过对三个区域的交联簇位置进行序列分析，将外显子分为三组：S1组由区域1中的簇、上游至外显子的150nt和外显子内的簇确定；S2组位于外显子下游150-500nt的区域2；E组在外显子下游0–150nt处聚集。
图4
图4。TDP-43调节非编码和蛋白质编码RNA的剪接
（a）TDP-43交联MIAT公司ncRNA。UG重复长度以粉色条显示，交联簇以黑色条显示。分析迈阿密对照组和TDP-43敲低SH-SY5Y细胞的外显子10内含物（凝胶电泳图，左，定量，右）如下所示。（b）MEF2D蛋白编码转录物中的TDP-43交联。UG重复长度以粉色条显示，交联簇以黑色条显示。分析MEF2D公司对照组和TDP-43敲低SH-SY5Y细胞的第11外显子内含物（凝胶电泳图，左，定量，右）如下所示。（c）分析BIM公司对照组和TDP-43敲低SH-SY5Y细胞，以及健康（C23，C25，C30）和FTLD-TDP（F19，F20，F21）脑样本中的外显子3剪接（凝胶电泳图，左，定量，右）。
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中的注释

  • TDP-43：多种靶点，多种疾病机制？
    Sendtner M。 Sendtner M公司。 自然神经科学。2011年4月；14(4):403-5. doi:10.1038/nn.2784。 自然神经科学。2011 PMID：21445063 没有可用的摘要。
  • 神经退行性疾病：TDP43的靶点图。
    威利K。 威利K。 Nat Rev神经科学。2011年5月；12(5):246. doi:10.1038/nrn3032。Epub 2011年4月13日。 Nat Rev神经科学。2011 PMID：21505508 没有可用的摘要。

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