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.2012年6月29日；287(27):23079-94.
doi:10.1074/jbc。M111.328757。 Epub 2012年5月4日。

融合肉瘤（FUS）和43 kDa TAR DNA结合蛋白（TDP-43）应激颗粒募集的要求

伊娃·本特曼 1, 曼纽拉·诺伊曼, 萨比娜·塔希罗维奇, 雷蒙娜·罗德, 多萝西·多尔曼, 克里斯蒂安·哈斯
附属公司

融合肉瘤（FUS）和43 kDa TAR DNA结合蛋白（TDP-43）应激颗粒募集的要求

伊娃·本特曼等。 生物化学杂志. .

摘要

含有43 kDa TAR DNA结合蛋白（TDP-43）或肉瘤融合蛋白（FUS）的细胞质内含物是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的几种亚型的标志。FTLD和ALS患者中的FUS阳性内含物始终与应激颗粒（SG）标记蛋白共同标记。TDP-43内含物是否含有SG标记目前仍存在争议。我们确定了FUS和TDP-43的SG招募要求，发现细胞质定位错误是FUS和TDP-43 SG招募的常见先决条件。对于FUS，精氨酸-甘氨酸-甘氨酸锌指结构域是蛋白质的主要RNA结合结构域，对SG招募最为重要，而富含甘氨酸的结构域和RNA识别基序（RRM）结构域的贡献较小，富含谷氨酰胺的结构域是不必要的。对于TDP-43，SG定位需要RRM1和C端富含甘氨酸结构域。位于TDP-43富含甘氨酸结构域的ALS相关点突变不影响SG募集。有趣的是，TDP-43的25-kDa C末端片段（富含FTLD/ALS皮质内含物，但不富含脊髓内含物）未能被招募到SG中。一贯地，富含C末端片段的FTLD患者皮质内含物没有与SG标记物聚（a）结合蛋白1（PABP-1）共同标记，而脊髓内含物中含有全长TDP-43，通常对该标记蛋白呈阳性反应。

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数字

图1。
图1。
经各种应激源治疗后，将细胞质FUS招募至SG。 一个，所示为FUS野生型的示意图(重量)和用于HeLa细胞瞬时转染的P525L突变体。哈，HA表位标签；问，富含谷氨酰胺的结构域；G公司，富含甘氨酸结构域；R（右），RRM域；Z轴，精氨酸-甘氨酸-甘氨酸（RGG）锌指结构域。B类，用N-末端HA-标记的FUS-WT或FUS-P525L瞬时转染HeLa细胞。转染细胞24小时后，对细胞进行热休克（44°C，持续1小时）、亚砷酸钠（0.5 m）米30分钟），或克霉唑（20μ米持续30分钟）或未经处理(控制)。固定细胞，用HA特异性抗体染色(绿色)，一种TIA-1特异性抗体(红色)和核染色(蓝色)并用共焦显微镜进行分析。右侧面板显示更高的放大倍数装箱区虽然FUS-WT仍为核反应堆，但在所有检查的应力条件下，FUS-P525L都被隔离在蒸汽发生器中。比例尺，20微米。C类用HA-FUS-WT或P525L在DIV 7上瞬时转染原代大鼠海马神经元。转染48小时后，神经元受到热休克（44°C）1小时或未经处理（37°C）。神经元被固定并用HA特异性抗体染色(绿色)，一种TIA-1特异性抗体(红色)和神经元标记抗体Tuj1(白色)可视化神经元形态。FUS-P525L显示细胞质定位错误，在热应激时被征募到TIA-1阳性SG。右上角的插图显示更高的放大倍数装箱区域。比例尺，20微米。
图2。
图2。
FUS的C末端RGG-锌指结构域是SG招募的最重要结构域。 一个所示为针对SG招募分析的不同FUS构造的示意图。将P525L突变引入PY-NLS以获得胞浆中定位错误的蛋白质。B类，显示了表达不同FUS构建体的HeLa细胞的免疫细胞化学，如一个固定前，细胞受到热休克（44°C持续1 h）或未经处理（37°C）。细胞用HA特异性抗体染色(绿色)，一种TIA-1特异性抗体(红色)和核染色(蓝色)并用共焦显微镜进行分析。右侧面板显示更高的放大倍数装箱区Z域对SG招募最为重要，而Q域则可有可无。G和R域也有助于SG招募，但程度低于Z。比例尺=20微米。C类，使用ImageJ定量定位在TIA-1阳性SG中的FUS的百分比。以盲法分析10-20个细胞，计算所有细胞的平均值，S.D.由误差线请注意，在中查看相应的共焦图像时，SG中FUS-P525L的百分比似乎低得惊人B类然而，与剩余的细胞体积相比，SG非常小，因此，FUS-P525L弥散分布在细胞质和细胞核中占总蛋白的很大比例（超过80%）。
图3。
图3。
FUS的RGG-锌指结构域与富含UG-的RNA结合。 一个，FUS-WT是在体外在以下人员在场的情况下翻译[35S] 蛋氨酸(左车道,输入)并分析与固定在链霉亲和素珠上的不同RNA寡核苷酸的结合(右车道,无人值守地面12、UGUGUUGUG、UGGUGU、UGU；GGUG公司，UUGUAUUUGAGCUAGUUGGUG公司澳大利亚；CCUC公司，UUGUAUUUGAGCUAGUUCCUC公司澳大利亚）。UG最有效地击落了FUS12在较小程度上通过GGUG RNA。B类，指示的FUS构造为在体外在以下人员在场的情况下翻译[35S] 蛋氨酸(上部面板,输入)。生物素化UG12用固定在链霉亲和素珠上的RNA拖出放射性标记蛋白(下部面板,下拉)。CCUC RNA作为阴性对照。FUS-WT和P525L以及组成Z的所有蛋白质第525页该领域被UG专门删除12RNA，而其他蛋白质没有表现出可检测的RNA结合。打开箭头指示降解产物。
图4。
图4。
细胞溶胶定位错误是TDP-43招募SG的先决条件。 一个，所示为TDP-43野生型的示意图(重量)和NLS突变体(NLSmut公司).NLSmut公司经典核定位信号中的三点突变（K83A/R84A/K85A）；富G-rich，富含甘氨酸结构域；版本5，V5表位标签。B类将C-末端V5标记的TDP-WT或NLSmut瞬时转染到HeLa细胞中，24 h后进行热休克（44℃，1 h）、亚砷酸钠（0.5 m）米30分钟），或克霉唑（20μ米30分钟）治疗或不治疗(控制)。细胞固定，V5染色(绿色)和TIA-1(红色)-特异性抗体和核染色(蓝色)共聚焦显微镜分析。右侧面板显示方框区域的更高放大倍数。尽管细胞溶质NLS突变体被隔离到SG中，但TDP-WT在所有检测的胁迫条件下都保持核。比例尺=20微米。C类，将V5标记的TDP-WT或NLSmut瞬时转染大鼠原代海马神经元。转染后48小时，神经元受到热休克（44°C）1小时或未经处理（37°C）。神经元被固定并用V5特异性抗体染色(绿色)，一种TIA-1特异性抗体(红色)和神经元标记抗体Tuj1(白色)可视化神经元形态。NLSmut表现出部分细胞质定位错误，在热应激时被招募到TIA-1阳性SG。右上角的插图显示方框区域的更高放大倍数。比例尺，20微米。
图5。
图5。
在抑制Importinα/β依赖性核输入后，内源性TDP-43被隔离在热冲击诱导的SG中。用融合于GFP的Importinα/β特异性肽抑制剂转染HeLa细胞(GFP双峰)或GFP作为对照(绿色)。转染后24 h的细胞在固定前受到热休克（44℃持续1 h）或保持在控制温度（37℃）。细胞共染内源性TDP-43(红色)和TIA-1（白色），并通过共焦显微镜进行分析。GFP-Bimax的表达导致内源性TDP-43在细胞内定位错误，并在热休克时补充到SG中。在控制条件（GFP）下，TDP-43主要为核物质，热冲击后未与SG共定位。比例尺=20微米。
图6。
图6。
ALS相关TARDBP公司突变不会改变TDP-43的细胞定位。 一个将携带指示的ALS相关点突变（A315T、M337V或G348C）的Myc-tagged野生型TDP-WT或TDP-43瞬时转染到HeLa细胞中。转染后24 h的细胞受到热休克（44℃持续1 h）或保持在控制温度（37℃）。随后固定细胞，用myc染色(绿色)和TIA-1(红色)-特异性抗体和细胞核反染(蓝色)共聚焦显微镜分析。TDP-WT和ALS相关的点突变体在控制条件下均为核突变体，在热休克后仍保持核。比例尺=20微米。B类，显示了中使用的TDP-43构造的表达级别一个用myc特异性抗体通过免疫印迹分析总细胞裂解物(上部面板)。Tubulin用作加载控制(下部面板)。所有车道均来自相同污点的相同暴露。C类，显示了37°C时myc染色的核和细胞溶质荧光强度的定量。误差线注明S.D。
图7。
图7。
ALS相关TARDBP公司突变不影响细胞溶质TDP-43的SG募集。将ALS相关点突变（A315T、M337V、G348C）引入TDP-43 NLS突变（NLSmutA315T飞机，NLS穆特M337伏，NLS穆特G348C型)，并分析突变对SG募集的影响。一个，用所示TDP-43构建物瞬时转染的HeLa细胞与克霉唑孵育30分钟或不治疗(控制)。细胞固定，V5染色(绿色)和TIA-1(红色)-特异性抗体和核染色(蓝色)共聚焦显微镜分析。ALS相关点突变不影响细胞溶质TDP-43的SG募集。比例尺=20微米。B类用V5特异性抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物中的蛋白质水平(上部面板)微管蛋白作为负荷控制(下部面板)。这个黑色箭头表示全长TDP-43白色箭头表明在瞬时转染条件下经常观察到caspase生成的35-kDa CTF（61，75）。C类，使用ImageJ定量TIA-1阳性SG中定位的TDP-43的百分比。以盲法分析15-20个细胞，计算所有细胞的平均值，S.D.由误差线.
图8。
图8。
脊髓而非海马中的TDP-43内含物经常被SG标记蛋白PABP-1联合标记。脊髓福尔马林固定石蜡包埋组织切片的TDP-43免疫组织化学研究(上部面板)或海马(下部面板)显示了FTLD-TDP和ALS-TDP案例。用N端和C端TDP-43特异性抗体染色表明，用这两种抗体标记脊髓运动神经元中的神经元胞质内含物（ALS病例#1所示），而海马齿状颗粒神经元中的内含物仅用C端抗体标记（FTLD-TDP病例#1显示）。相同病例的双标记免疫荧光染色显示磷酸化TDP-43阳性包涵体共标记(绿色)SG标记蛋白PABP-1(红色)在脊髓中，但不在皮质内含物中。细胞核用DAPI染色(蓝色).比例尺=10μm。
图9。
图9。
25 kDa的C末端片段和TDP-43的C末端缺失突变体在SG中隔离不良。 一个所示为为SG招募分析的TDP-43缺失突变体的示意图。选择缺失突变体Δ1–173来模拟发现沉积在FTLD-TDP患者皮层区域的25-kDa CTF（4，59）。C末端缺失突变体(NLSmut公司ΔC类)缺乏朊蛋白样富含甘氨酸的结构域。B类，所示TDP-43构建物在HeLa细胞中瞬时转染。固定前，用克霉唑处理细胞（20μ米30分钟）或不治疗（对照组）。随后，用V5对细胞进行染色(绿色)和TIA-1(红色)-特异性抗体和核染色(蓝色)并用共焦显微镜进行分析。右侧面板显示更高的放大倍数装箱区与全长TDP-NLSmut相比，这两个缺失突变体在热休克后仍主要弥漫在胞浆中，并且很少被SG吸收。比例尺=20微米。C类，使用ImageJ定量TIA-1阳性SG中定位的TDP-43的百分比。以盲法分析15-20个细胞，计算所有细胞的平均值，S.D.表示为错误栏。D类用V5特异性抗体进行免疫印迹分析总细胞裂解物中的蛋白质水平(上部面板); 微管蛋白作为负荷控制(下部面板).黑色箭头表示全长TDP-NLSmut或两个缺失突变体，以及白色箭头表示降解产物。所有车道均来自相同污点的相同暴露。
图10。
图10。
TDP-43的C端缺失突变体仍然与UG结合12RNA。 一个，TDP-WT为在体外在以下人员在场的情况下翻译[35S] 蛋氨酸(左车道,输入)并分析与固定在链霉亲和素珠上的不同RNA寡核苷酸的结合(右车道,无人值守地面12、UGUGUUGUG、UGGUGU、UGU；GGUG公司，UUGUAUUUGAGCUAGUUGGUG公司澳大利亚；CCUC公司，UUGUAUUUGAGCUAGUUCCUC公司澳大利亚）。TDP-43绑定到两个UG12和GGUG RNA，但不是CCUC RNA）。B类，指示的TDP-43构造为在体外在以下人员在场的情况下翻译[35S] 蛋氨酸(上部面板,输入)。生物素化UG12将RNA或CCUC控制RNA固定在链霉亲和素珠上，并用于提取放射性标记的蛋白质(下部面板,下拉)。TDP-WT和NLSmut以及C末端缺失突变体NLSmut-ΔC被UG特异性下调12RNA，而类似25-kDa CTF的Δ1–173缺失突变体没有与UG结合12RNA。
图11。
图11。
TDP-43和FUS的SG招募模型。细胞应激时，mRNA的翻译被阻止，含有mRNA（小核糖体亚单位）的翻译沉默的起始前复合物(40秒)，早期引发因素(例如eIF3,电子IF4A,eIF4G型)，和PABP-1被打包到SG中。我们建议招募TDP-43(左边)或FUS(正确的)SG涉及蛋白质-RNA和蛋白质-蛋白质相互作用。TDP-43和FUS通过其主要RNA结合域（分别为TDP-43中的RRM1和FUS中的RGG-锌指（Z）域）与富含UG-的mRNA序列结合，因此可能通过其相关mRNA被招募到SG中。由于在我们的RNA结合分析中没有显示与富含UG-RNA结合的其他结构域也有助于TDP-43和FUS的SG募集，我们建议与蛋白质X和Y的额外蛋白质相互作用参与TDP-43与FUS的SUG募集。
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