Purification of SUMO conjugating enzymes and kinetic analysis of substrate conjugation

doi:10.1007/978-1-59745-566-4_11

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.2009:497:167-86.

doi:10.1007/978-1-59745-566-411。

SUMO偶联酶的纯化及底物偶联动力学分析

阿里·A·尤努斯¹, 克里斯托弗·D·利马

附属公司

PMID： 19107417
预防性维修识别码：项目经理2739043
内政部： 10.1007/978-1-59745-566-4_11

审查

SUMO结合酶的纯化及底物结合动力学分析

阿里·A·尤努斯等。分子生物学方法. 2009.

.2009:497:167-86.

doi:10.1007/978-1-59745-566-4_11。

作者

阿里·A·尤努斯¹, 克里斯托弗·D·利马

附属

¹美国纽约斯隆-凯特琳研究所结构生物学项目。

PMID： 19107417
预防性维修识别码：项目经理2739043
内政部： 10.1007/978-1-59745-566-4_11

摘要

SUMO与蛋白质底物的结合需要一种专用的E2泛素结合酶（Ubc9）和相关的E3连接酶的协同作用。虽然Ubc9可以直接识别和修饰SUMO修饰共识位点内的底物赖氨酸残基，但E3连接酶可以在体外和体内SUMO偶联期间重定向特异性并提高接合率。在本章中，我们将描述用于纯化SUMO结合酶的方法和可用于体外分析SUMO接合的模型底物。我们还将描述在E3依赖或E3依赖底物共轭期间提取动力学参数的方法。

PubMed免责声明

数字

**图1。Ubc9介导的SUMO与人p53结合**
(一个)在用SDS-PAGE分离并用抗SUMO-1抗体检测后，在不同p53浓度下，对SUMO从E2-SUMO硫酯转移到人类p53的C末端四聚体结构域进行单循环分析的时间进程。(B类)图A中的数据通过线性回归分析计算不同p53浓度下的反应速率。(C类)反应速率（Y轴）根据不同的p53浓度（X轴）绘制，数据拟合成形式为Y=ax/（b+X）的矩形双曲线。数据点表示三个独立实验的平均值，误差条表示一个标准偏差。

**图2。pH滴定及Ubc9介导的SUMO与人p53结合分析**
(一个)经SDS-PAGE分离并用抗SUMO-1抗体检测后，在4°C的不同pH值下，在94μM单循环条件下SUMO与p53结合的时间过程。(B类)A中的数据用图形表示，以计算不同pH值下的反应速率。通过线性回归分析计算反应速率。(C类)初始反应速率（Y轴）绘制为pH的函数，数据拟合为S形函数（详见正文）。垂直线标记了最大活性一半时的pH值（可滴定组的pK）。数据点表示两次独立实验的平均值，误差条表示一个标准偏差。

**图3。Siz1-dependent Smt3-Alexa-Fluor 488与酵母PCNA的结合**
(一个)通过SDS-PAGE分离并检测荧光信号后，在不同PCNA浓度下，对Smt3从E2~Smt3硫酯转移到酵母PCNA突变株K127G的单一周转分析的时间进程。(B类)A中的数据用图形表示，用线性回归分析计算不同底物浓度下的反应速率。(C类)根据不同酵母PCNA浓度绘制初始反应速率（Y轴），数据拟合成形式为Y=ax/（b+x）的矩形双曲线。数据点表示三个独立实验的平均值，误差条表示一个标准偏差。

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