SUMO2/3靶点的综合鉴定及其在有丝分裂过程中的动力学

细胞培养和SILAC标记

HeLa细胞保存在补充有10%胎牛血清（FBS，HyClone）和1%青霉素链霉素（Life Technologies）的DMEM中。父母HeLa FRT TRex细胞在5µg/ml Blastidin HCl（Life Technologies）和50µg/ml Zeocin（Life Technologies）的选择下培养。生成的稳定细胞系在5µg/ml Blastidin HCl和200µg/ml Hygromycin B（Life Technologies）的选择下培养。除非另有说明，否则用1 ng/ml和RhoGDIα和0.5 ng/ml多西环素诱导SUMO2融合构建体表达48小时。使用了以下药物浓度：胸苷（西格玛）2.5 mM，紫杉醇（西格马）100 nM，ZM447439（Tocris Bioscience）2µM。

为了进行定量蛋白质组学实验，细胞在补充了10%透析FBS（PAA）、青霉素链霉素和谷氨酰胺（生命技术）以及同位素标记的L-精氨酸和L-赖氨酸的SILAC DMEM（PAA。SUMO2ΔGG细胞在添加正常精氨酸（R0）和赖氨酸（K0）（Sigma）的轻“L”SILAC培养基中生长。在培养基“M”条件下，SUMO2细胞在添加U的SILAC DMEM中生长-¹³C类₆精氨酸（K6）和4,4,5,5-D₄赖氨酸（K4）和重“H”标记的SUMO2细胞用U培养-¹³C类₆，U-¹⁵N个₄精氨酸（R10）和U-¹³C类₆，U-¹⁵N个₂赖氨酸（K8）（剑桥同位素实验室）。在收获前，细胞在SILAC培养基中培养至少五次。

抗体

在指定的稀释液中使用以下抗体进行western blot分析。小鼠抗FLAG（1∶1000，F3165，Sigma）、小鼠SUMO2/3（1∶000，ab81371，Abcam）、大鼠抗tubulin（1∶5000，ab6160，Abcam）、小鼠抗Vinculin（1∶9000，V9131，Sigma-）、鼠抗CyclinB1（1∶2000，554177，BD Biosciences）、兔抗Aurora A（1∶4000，ab1287，Abca姆）、兔对抗RhoGDIα（1∶2000sc-360，Santa Cruz Biotechnology）和小鼠抗RhoA（1∶500，sc-418，Santa Cruz Biotechnology）。

SUMO相关蛋白的纯化

采集有丝分裂细胞，用冰镇PBS洗涤，并在4°C下500 g离心收集。根据颗粒重量，细胞在Gu-HCI裂解缓冲液（6 M Gu-HCl，100 mM Na）中进行裂解₂高性能操作₄，10 mM Tris-HCl（pH 8.0），20 mM咪唑，10 mCβ-巯基乙醇）–每0.1 g细胞2 ml裂解缓冲液。在纯化之前，通过0.45µm无菌过滤器过滤裂解产物，但通常使用Ni-NTA超流珠（Qiagen）进行裂解程序和纯化，如前所述[18]。通过将一轮流出的流体与新的Ni-NTA珠培养，进行多轮消耗。将6.4 M尿素中的洗脱馏分混合，并通过缓冲液交换将尿素浓度降低至TBS-T缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，300 mM NaCl，1 mM EDTA，5%甘油，1%TritonX-100）中，并添加5 mM氯乙酰胺，20 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM，Sigma）和无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）使用离心过滤器（AmiconUltra、Millipore）。在4°C下，用100µl抗FLAG M2亲和树脂（Sigma）培养经缓冲区改变的样品2小时。将抗FLAG珠在TBS缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl）中洗涤两次，为了洗脱蛋白质，将LDS样品缓冲液（Life Technologies）添加到珠中。在收集洗脱的纯化SUMO2缀合物之前，将珠子和样品缓冲液悬浮液在96°C下煮沸3分钟，然后在5000 g下离心30秒。

大规模生长和细胞同步

4*10⁷细胞在一个滚筒瓶中接种200 ml培养基（Nunc TufRoll 850 cm²)，并在HeraCell培养箱中以0.1 rpm的速度培养，该培养箱配有滚筒瓶装置和仪器（Thermo Scientific）。播种24小时后，每分钟转数增加到0.2，48小时后更换培养基，再培养24小时。然后将胸腺嘧啶添加到最终浓度为2.5 mM的溶液中20小时，以使S期细胞预同步。在添加新鲜培养基之前，用25ml培养基冲洗两次，将细胞从培养基中释放出来。释放后3小时，添加紫杉醇至最终浓度100 nM。添加紫杉醇后11小时，通过有丝分裂振荡收集有丝分裂阻滞的细胞。为了进行有丝分裂检查点覆盖，将收集的细胞和培养基转移到新的滚筒瓶中，添加2µM ZM447439，并培养细胞1小时。

质谱分析

将珠状物的洗脱液还原、烷基化并加载到SDS-PAGE凝胶上。如前所述，将通道切成7块，进行凝胶内胰蛋白酶消化，随后进行样品脱盐和浓缩[19]使用easy-nLC纳米流系统（Thermo Scientific，Odense，Denmark）通过纳米电喷雾离子源连接到Q Exactive质谱仪（Thermo-Scientistic，Bremen，Germany），通过纳米HPLC–MS/MS对所得肽混合物进行分析。柱长150 mm，内径75µm，内部用1.9µm C包装₁₈珠子（Reprosil-AQ Pur，Dr.Maisch）。使用140 min的梯度，在0.5%乙酸中从4%到36%的乙腈对每个样品进行分析。质谱仪按照所述进行灵敏采集[20]。在MaxQuant环境1.3.9.9版中，使用为三重SILAC和Andromeda搜索引擎配置的默认设置执行数据分析[21]。搜索的数据库是UniProt完整的人类蛋白质组2012_2版，与常见的背景污染物列表相连。为了进行搜索，蛋氨酸氧化、蛋白质N末端乙酰化、赖氨酸和焦谷氨酸的QQTGG修饰被指定为可变修饰，半胱氨酸的氨基甲酰被设置为固定修饰。根据诱饵数据库搜索策略，FDR率设置为1%[22].

RNAi对蛋白质的消耗

使用Lipofectamine RNAiMAX（Life Technologies）对细胞进行双重敲除，以释放10 nM的RhoGDIα（#1:s698-CCAGCAUACAGGAAA公司，#2:s699-GUCUAACCAUGAUGCCUUA（古库亚卡古古古古亚），#3:s700-仙人掌、Ambion Silencer Select、Life Technologies）、RhoGDIβ（#1:s455-GGAAGUUCUGAUAGA公司，#2:s456-CCAUGGACCUUACUGGAGA公司，#3:s224014-GUGGAUAAGCACAUUA公司、Ambion Silencer Select、Life Technologies）、Ubc9（隐身预先设计的UBE2IHSS11130-UCGAACCACCAUUAUUUCACCCGAA公司，Life Technologies）或100 nM PIAS1-4（PIAS1-GGAUCAUUCUAGAGCUUUAPIAS2–CUUGAUAUACAUCUUA村，PIAS3–CCCUGAUGUCACCAUGAAA公司，PIAS4–GGAGUAAGAGUGGACUGAA公司)[23]siRNA寡核苷酸。作为对照，100 nM的荧光素酶(CGUACGGAAUACUUCGA公司使用Sigma）siRNA寡核苷酸。在收获前48小时和24小时转染细胞。

体内SUMO酸化免疫纯化分析

用多西环素诱导稳定的HeLa FRT TRex细胞株，并在紫杉醇有丝分裂的最后一晚停止前用胸腺嘧啶阻断预同步。通过摇晃收集有丝分裂细胞，并在添加2 ng/ml微囊藻毒素-LR（酶生命科学）、1 mM DTT、20 mM NEM和无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏）的裂解缓冲液（50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM-EDTA、1%NP-40）中进行裂解。将清除的裂解液添加到GFP-trap（ChromoTek）珠中，并将混合物在4°C下培养1小时。将小球在裂解缓冲液中洗涤两次，并在2×LDS样品缓冲液中再次悬浮，并在95°C下煮沸10 min，以洗脱GFP陷阱捕获的蛋白质。在免疫纯化的同一天对样品进行蛋白质印迹分析，以避免靶点的脱磺酰化。

有丝分裂期间和退出时SUMO2/3修饰蛋白的定量质谱筛选

然后，我们将SUMO2/3纯化装置与细胞培养中稳定同位素标记（SILAC）定量MS相结合[28],[29]使用三组不同的同位素标记的精氨酸和赖氨酸氨基酸来标记细胞培养物，从而在质谱仪中区分不同培养物中的肽(图2C). SUMO2ΔGG细胞系在光（“L”，R0K0）培养基中生长，用紫杉醇阻滞，并作为对照。对于有丝分裂阻滞状态，SUMO2细胞系在重（“H”，R10K8）培养基中生长，并用紫杉醇阻滞在前中期。最后，为了有丝分裂退出状态，SUMO2细胞在培养基（“M”，R6K4）中生长，紫杉醇被截留并用ZM447439处理1小时。根据Cyclin B1和Aurora A降解的时间选择用ZM447439培养1小时(图2B和2C). SILAC方法允许我们识别前中期靶点（H/L比率）、有丝分裂退出靶点（M/L比率）和SUMO2/3修饰的动力学（H/M比率）。

混合来自每个细胞系的等量细胞提取物，然后从合并的裂解物中纯化SUMO2/3缀合物（约120mg总提取物）。通过SDS-PAGE分离后，将凝胶层切成7片，并在MS分析和定量之前进行凝胶内消化。进行了两次独立的复制纯化（筛选I和筛选II），只有H/L或M/L比率高于2且至少有2个比率计数的蛋白质被视为SUMO2/3靶点。通过数据过滤，在筛选I和筛选II中分别鉴定出227和445个SUMO2/3修饰蛋白(图2E和文件S1). 尽管我们使用了SUMO2 Q87R突变，但我们无法在任何靶点中检测到任何特定的结合位点。虽然我们不知道识别SUMO2/3结合位点困难的确切原因，但我们怀疑这是由于样品中SUMO2/3结合物的含量普遍较低，尽管我们努力保存它们。一般来说，很难确定结合位点，因为通常只有一小部分特定蛋白质被修饰。在筛选I中鉴定的227个蛋白质中，208个也在筛选II中鉴定，显示出良好的鉴定重复性。在两个复制屏幕中确定的单个SILAC比率也显示出良好的相关性，相关系数在0.81到0.9之间(图2F和图S1B–C），这证实了所获得数据的稳健性。基于屏幕之间的重叠和良好的相关系数，屏幕II中识别的大多数SUMO2/3目标可能是真实的。我们鉴定了SUMO结合途径的所有成分和所有PIAS SUMO连接酶，以及以前报道的有丝分裂靶点，如拓扑异构酶IIα和NuMA，验证了我们的方法。

为了深入了解有丝分裂中单个靶点和整体SUMO2/3修饰动态，我们接下来使用了MS识别的筛选II中分类SUMO2/3靶点的H/M SILAC比率₂（H/M）值，将目标分为三组；退出前中期逮捕后增加SUMO2/3修改（日志₂（H/M）≤-1，n = 110），在前中期增加SUMO2/3修改（log₂（H/M）≥1，n = 5） 或在有丝分裂中不断被SUMO2/3修饰（-1<log₂（H/M）<1，n = 330) (图3A). 这表明，SUMO2/3修饰的蛋白质在有丝分裂退出时大量增加，这与我们通过western blot观察到的SUMO2/3修饰蛋白质的总增加相一致(图2B和2C). 令人惊讶的是，几乎没有检测到在前中期特异性修饰的蛋白质。

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图3

有丝分裂中SUMO2/3修饰的动力学。

显示单个修改动态日志的图形₂（H/M），屏幕II（紫色）中确定的445个SUMO2/3目标。虚线代表|日志₂（H/M）|≥1修正动力学截止值。日志绿线以下₂（小时/米） = −1，靶细胞在有丝分裂出口处SUMO化程度更高，在log处高于红线₂（小时/米） = 1，靶点在前中期停搏时被磺胺化，在有丝分裂退出时被去磺胺化。两条线之间的靶点通过有丝分裂在恒定水平上被SUMO修饰，或者在较小程度上表现出动态。在有丝分裂退出时修饰的10个最具活力的靶点和5个最好在前中期进行SUMO化的已识别靶点在图下方用各自的基因名称突出显示。显示了已识别的SUMO通路成分的名称（粗体）和有丝分裂中SUMO化的已知靶点，箭头指示它们各自的比例。

SUMO2/3修饰对有丝分裂进程的调控

以前，不同的蛋白质组学方法被用于识别SUMO化的靶点，但通常是在SUMO化度较高的细胞条件下进行识别，如热休克[15],[33],[34]或蛋白酶体降解被抑制时[35],[36]我们在此开发的方法允许在SUMO2/3修饰蛋白丰度较低的细胞条件下进行稳健的鉴定。高效检测的关键是一种简单有效的纯化策略，连续使用His-tag和FLAG亲和步骤证明非常有效。另一种方法是使用蛋白质阵列，通过将哺乳动物有丝分裂细胞提取物应用于这种阵列，另一项研究确定了大约500个SUMO2/3靶点[37]。与我们的数据集进行的比较显示，有限的重叠可能反映出非常不同的实验方法。利用FLAG亲和纯化和同步CDK1抑制的最新蛋白质组学筛选[38]显示与我们的数据有一些重叠（请参见文件S1). 在Schimmel等人的筛选中，共确定了73个有丝分裂靶点，其中我们确定了25个。与采用标记SUMO2过度表达的研究相反，我们以接近内源性水平表达标记的SUMO2。尽管如此，我们的纯化和鉴定策略确定了明显更多的有丝分裂靶点，总共超过400个，这表明它在富集和鉴定SUMO底物方面是有效的。

虽然检测SUMO修饰的蛋白质很有趣，但我们在这里绘制的动态变化提供了额外的信息层，可以帮助识别起调节作用的修饰。我们的筛查证实，在有丝分裂退出时，SUMO2/3修饰的蛋白质增加，而在有丝细胞分裂期间特异性修饰的蛋白质较少，这与以前的观察结果一致[13]许多在有丝分裂退出时被强烈修饰的蛋白质与转录有关，这与据报道的SUMO途径在这一生物过程中的调节作用一致[39],[40]由于有丝分裂期间染色质的致密性，转录受到限制，但在退出转录后恢复，可能观察到这些蛋白质中的一些SUMO2/3修饰调节转录。

此外，还鉴定出许多参与有丝分裂调控的蛋白质，如NuMA、RanGAP1、拓扑异构酶IIα、CDK1和APC4，尽管SUMO2/3修饰在这些蛋白质上的变化较小。KNL2（Mis18BP1）是我们确定的一个有趣的动态SUMO2/3靶点。有丝分裂退出时，CENP-A加载需要KNL2[41]–[43]这与SUMO2/3对其进行的修改有关。此外，极光B活性调节器Repo-Man[44],[45]，在用ZM4447439治疗后显示出增加的SUMO2/3修饰。SUMO2/3修饰这些蛋白质的作用值得探索。

我们感谢实验室所有成员对这项工作的讨论。我们感谢斯蒂芬·泰勒提供HeLa FRT/TRex细胞系。