Regulation of Rho GTPase crosstalk, degradation and activity by RhoGDI1

doi:10.1038/ncb2049

.2010年5月；12（5）:477-83。

doi:10.1038/ncb2049。 Epub 2010年4月18日。

RhoGDI1对Rho GTPase串扰、降解和活性的调节

艾蒂安·博尔特¹, 拉斐尔·加西亚-马塔, 克里斯托弗·吉卢伊, 阿迪·杜巴什, 根达利娜·罗西, 帕特里克·J·布伦沃尔德, 基思·伯里奇

附属公司

PMID： 20400958
预防性维修识别码：项目经理2866742
内政部： 10.1038/ncb2049

RhoGDI1对Rho GTPase串扰、降解和活性的调节

艾蒂安·博尔特等。 Nat细胞生物学. 2010年5月.

.2010年5月；12(5):477-83.

doi:10.1038/ncb2049。 Epub 2010年4月18日。

作者

艾蒂安·博尔特¹, 拉斐尔·加西亚-马塔, 克里斯托夫·吉尔鲁, 阿迪·杜巴什, 根达利娜·罗西, 帕特里克·J·布伦沃尔德, 基思·伯里奇

附属

¹美国北卡罗来纳州教堂山北卡罗莱纳大学细胞与发育生物学系，邮编：27599。

PMID： 20400958
预防性维修识别码：项目经理2866742
内政部： 10.1038/ncb2049

摘要

在稳定状态下，大多数Rho GTPase在胞浆中与Rho鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂（RhoGDIs）结合。RhoGDI通常被认为在细胞质内被动地将Rho蛋白保持在非活性状态。在这里，我们描述了RhoGDI1控制真核细胞中Rho蛋白稳态的进化保守机制。我们发现RhoGDI1的缺失促进了Rho GTP酶胞浆香叶基香叶基化池的错误折叠和降解，同时激活了剩余的膜结合部分。由于RhoGDI1水平受到限制，Rho蛋白竞争与RhoGDI 1的结合，外源Rho GTPase的过度表达取代了与Rho GDI1结合的内源性Rho蛋白质，导致其降解和失活。这些结果对从控制Rho蛋白水平的研究中得出的结论提出了重要问题。在许多情况下，观察到的反应可能不仅仅是由于过度表达本身，而是由于竞争与RhoGDI1的结合而对其他Rho GTPase的水平和活性产生的额外影响；这可能需要重新评估之前仅依赖这些技术的已发表研究。

PubMed免责声明

数字

**图1。RhoGDI1复制触发真核细胞中Rho蛋白的降解和激活**
(一)对照组或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞的裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(b条)从对照细胞或RhoGDI1 siRNA转染细胞中纯化总RNA。用特异性引物对DNAse I处理的RNA进行RT-PCR。RT-PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行解析。(**c（c）**)用LLnL处理8小时的对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞的裂解液通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(d日)HeLa细胞与对照或RhoGDI1 siRNA和HA-标记的RhoGDI 1 RNAi抗性突变体共同转染。细胞裂解产物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。请注意，RhoGDI1缺失细胞中RhoA的降解可通过表达对siRNA耐药的RhoGDI 1而不是通过不结合Rho GTPases的Rho GDI1突变体来挽救。(**e（电子）**)转染HA标记的wt RhoGDI1或RhoGDI 1 D45/185A的HeLa细胞的裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。所有siRNA实验在转染后72小时进行分析。对于过表达实验，在siRNA转染48小时后，用所示cDNA转染细胞，并再培养24小时(**（f）**)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞72小时。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho GTPases。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(克)定量RhoGDI1-缺失细胞（黑条）相对于对照细胞（白条）中RhoA、Rac1和Cdc42的激活。*RhoA、Rac1和Cdc42在双尾非配对学生t检验中分别为p=0.0108、p=0.0146和p=0.0229，误差条表示三个独立实验的平均值标准误差。(小时)对照细胞或RhoGDI1 siRNA转染细胞被分为胞浆和膜组分，通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。TfR代表转铁蛋白受体。(我)用RhoA-miR-shRNA-expressing腺病毒感染HeLa细胞或用RhoGDI1 siRNA转染HeLa淋巴细胞72小时。用GST-RBD将活性RhoA去除。通过SDS-PAGE解析总细胞裂解物和GST-RBD结合蛋白，并通过蛋白质印迹进行分析。(j个)使用GTP-RBD或GST-PBD珠将野生型或Rdi1d酵母菌株中的活性Rho GTPase拉下。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。Sso蛋白用作负荷控制。(k个)对照野生型Cdc42和Rho1的免疫荧光染色(*无线电数据接口1*)和*rdi1型*Δ应变。比例尺为8µm。(我)对照野生型偏振光芽染色强度的定量(*无线电数据接口1*)和*rdi1型*Δ应变。数据通过双尾学生t检验（p＜0.005）进行分析，误差条代表三个实验的标准偏差。

**图2。RhoGDI1缺失损害细胞迁移**
(一)对照组或RhoGDI1 siRNA转染的HeLa细胞融合单层产生的伤口闭合的时间过程分析。该图用代表标准偏差（n=10）的误差条描述了伤口区域。(b条)对照或RhoGDI1 siRNA转染的WM2664黑色素瘤细胞的融合单层上产生的伤口闭合的时间过程分析。该图用代表标准偏差（n=6）的误差条描述了伤口区域。(**c（c）**)对照组或RhoGDI1 siRNA转染的WM2664黑色素瘤细胞的速度分析。数据通过双尾非配对学生t检验进行分析（p=1.72×10⁻¹⁴)误差条分别表示n=28和n=56个单元格的平均值（s.e.m.）的标准误差。对照组和RhoGDI1敲除细胞的平均速度分别为12.74μm/min和5.64μm/min。(d日)用对照或RhoGDI1 siRNA转染WM2664黑色素瘤细胞72小时。分别用GST-PBD或GST-RBD珠从细胞裂解液中提取活性Rac1和活性RhoA。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(**e（电子）**)通过SDS-PAGE解析对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞的细胞裂解物，并通过Western blotting进行分析。请注意，尽管RhoA和Rac强烈激活，但Rho蛋白效应器并未激活。(**（f）**)从补充信息电影1中提取的图像描绘了一个用荧光标记的RhoGDI1 siRNA（红色箭头）转染的WM2664黑色素瘤细胞和两个用未标记的对照siRNA（白色和黑色箭头）转导的WM2644细胞随时间迁移。右边的面板显示了在t0处拍摄的图像，用于识别用荧光标记的siRNA转染的细胞。比例尺为40µm。(克)对照组（左）或RhoGDI1（右）siRNA转染的WM2664黑色素瘤细胞的典型XY迁移轨迹。在2小时内每5分钟记录一次细胞的位置（n=10）。(小时)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞72小时后，将其分为细胞溶质或膜部分。膜组分通过在碘克沙醇密度梯度上离心进一步分离为质膜（PM）和ER膜（ER）。通过SDS-PAGE和Western blotting分析每个组分。(我)每个组分中RhoA、Rac1和Cdc42谱带相对强度的密度分析。注意，RhoGDI1沉默后，GTPase基本上从质膜部分消失。

**图3。RhoGDI1缺失后Rho家族GTPase的降解不需要Rho蛋白的激活，但取决于它们的香叶基香叶酰化，并涉及分子伴侣机制**
(一)用对照或RhoGDI1 siRNA和p190RhoGAP cDNA共同转染HeLa细胞。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho-GTP酶。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(b条)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞，并用细胞渗透性C3毒素处理。用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性Rho-GTP酶。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(**c（c）**)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞，并用香叶基香叶基转移酶抑制剂GGTI 2417处理。细胞裂解产物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(d日)HeLa细胞与对照或RhoGDI1 siRNA和编码细菌蛋白酶YopT的cDNA共同转染。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。(**e（电子）**)用对照或RhoGDI siRNA转染HeLa细胞，并从细胞裂解物中免疫沉淀RhoA。免疫沉淀蛋白通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(**（f）**)转染对照组或RhoGDI1 siRNA的HeLa细胞，无论是否含有蛋白酶体抑制剂LLnL，都被分为细胞溶质或膜组分，RhoA从细胞溶质和膜组分中免疫沉淀。为了确保相似数量的RhoA被免疫沉淀，用限制数量的抗体和饱和数量的细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀蛋白和细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。(克)用对照或RhoGDI1 siRNA转染HeLa细胞，并用格尔德霉素处理12小时。通过SDS-PAGE解析细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。显示RhoA印迹的短期和长期暴露。所有siRNA实验在转染后72小时进行分析。对于过表达实验，在siRNA转染48小时后，用所示cDNA转染细胞，并再培养24小时。

**图4。与RhoGDI1的竞争性相互作用调节Rho蛋白的水平和活性**
(一)用RhoA miR shRNA腺病毒感染HeLa细胞72 h。细胞裂解物用SDS-PAGE溶解并用Western blotting分析。注意RhoA耗尽的细胞中Rac1和Cdc42的水平增加。(b条)用myc标记的Rho-GTP酶转染HeLa细胞，免疫沉淀内源性RhoGDI1。免疫沉淀蛋白和细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过Western blotting进行分析。HeLa细胞(**c（c）**和d日)或HEK 293细胞(**e（电子）**，**（f）**，克，小时，我，j个，k个和我)通过增加所示myc标记Rho GTPase的质粒编码量进行转染。24h后，用SDS-PAGE溶解细胞裂解产物，并用Western blotting进行分析。(米)用myc-tagged Cdc42表达质粒转染HEK 293细胞，转染后24 h内分别加入或不加入HA标记的RhoGDI1表达质粒。细胞裂解产物用SDS-PAGE进行解析，并用Western blotting进行分析。(**n、 o和p**)如图所示，用5µg myc标记的Rho GTPase表达质粒转染HEK 293细胞。24小时后，分别用GST-RBD或GST-PBD珠从细胞裂解液中提取活性RhoA或活性Rac1。结合蛋白和总细胞裂解物通过SDS-PAGE进行解析，并通过蛋白质印迹进行分析。所有结果均代表至少3个独立实验。注意，一个Rho家族成员的过度表达会降低其他Rho蛋白的表达和活性。

**图5。RhoGDI调节Rho蛋白稳态**
新合成的RhoGTPases在ER中进行香叶基香叶酰化和翻译后修饰。香叶基香叶酰化后，Rho蛋白直接与RhoGDI结合，后者将其作为可溶的戊基化物隔离，形成胞浆并保护其免受降解。当RhoGDI1耗竭或Rho蛋白过度表达时，内源性RhoGTPase释放到胞浆中，作为短期不稳定中间产物存在，部分折叠或错误折叠（红色箭头）。如果它们不能正确折叠，它们可以与伴侣复合物结合，或者成为降解的靶点。在没有GDI的情况下，新合成的Rho蛋白无法传递到质膜并在内质网中积累。在稳定状态下，这种不稳定的中间产物未被检测到，RhoGTPases大部分与细胞膜相关或与GDI结合，只有一小部分与伴侣系统相关。使用的缩写：ER，内质网；PM，质膜；GGTase，香叶基香叶酰基转移酶；Rce1，戊基蛋白特异性蛋白酶；lcmt，异戊烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶。

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