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.2010年8月27日；39(4):618-31.

doi:10.1016/j.molcel.2010.07.025。

核仁SUMO靶蛋白的蛋白质组学筛选显示，SUMO酸化调节Nop5/Nop58的功能

贝琳达·J·韦斯特曼¹, 塞琳·韦尔赫根（Céline Verheggen）, 萨斯基娅·赫滕, 云华林, 爱德华·贝特朗, 安格斯一世拉蒙德

附属公司

PMID： 20797632
预防性维修识别码：项目经理2938476
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2010.07.025

核仁SUMO靶标的蛋白质组学筛选显示SUMO化调节Nop5/Nop58的功能

贝琳达·J·韦斯特曼等。分子电池. 2010.

.2010年8月27日；39(4):618-31.

doi:10.1016/j.molcel.2010.07.025。

作者

贝琳达·J·韦斯特曼¹, 塞琳·韦尔赫根（Céline Verheggen）, 萨西娅·赫滕, 云华林, 爱德华·贝特朗, 安格斯一世拉蒙德

附属

¹英国邓迪DD15EH邓迪大学生命科学学院威康基因调控与表达信托中心。

PMID： 20797632
预防性维修识别码：项目经理2938476
内政部： 2016年10月10日/j.molcel.2010.07.025

摘要

翻译后SUMO修饰是调节蛋白质功能的重要机制，尤其是在细胞核中。核仁是负责rRNA合成、加工和组装大小核糖体亚单位的亚核细胞器。在这里，我们使用基于SILAC的定量蛋白质组学来鉴定核仁SUMOylated蛋白质。这揭示了SUMO化通过靶向Nhp2和Nop58在小核仁核糖核蛋白复合物（snoRNP）的生物生成和/或功能中的作用。使用体外和体内相结合的方法，Nhp2和Nop58（也称为Nop5）都被证明是SUMO化的底物。突变分析显示Nhp2上的修饰位点为K5，Nop58上的修饰部位为K467和K497。与Nop58和Nhp2不同，密切相关的Nop56和15.5K蛋白似乎不是SUMO靶点。SUMO酸化对于Nop58与snoRNAs的高亲和力结合至关重要。本研究提供了SUMO修饰与snoRNP功能相关的直接证据。

版权所有（c）2010 Elsevier Inc.保留所有权利。

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图1
核仁包含SUMO1和SUMO2/3，使用定量蛋白质组学鉴定核仁SUMOylated蛋白质（A）与Hoechst、抗纤维素酶-FITC和抗SUMO1-AF546（顶部）或-2/3-AF546（底部）共染的HeLa细胞的荧光显微镜图像。将显示单独和合并的图像。比例尺表示15μm。另请参见图S1。（B）基于SILAC的核仁SUMO靶点蛋白质组学筛选概述。希拉和希拉^{6HisSUMO公司}细胞在同位素不同的培养基中生长，等量的细胞合并进行分离（～10⁸总计）。将纯化的核仁溶解在6M Gdn-HCl缓冲液中，并用镍分离出6HisSUMO-蛋白²⁺-MS分析前的NTA琼脂糖。（C）用细胞质（α-微管蛋白）、细胞核（层粘连蛋白B1）和核仁（B23）的标记抗体进行western blotting监测细胞分级。还对组分进行了Nop58检测。核仁制剂大多不含细胞质和核质蛋白，并富含核仁蛋白。（D）柱形图显示了当前核仁蛋白数据库中蛋白质组的强度和流行率之间的关系（NopDB；Ahmad等人，2009年）。根据强度，只显示了前300个蛋白质组，并且y轴被截断以帮助可视化。（E）从蛋白质组筛选获得的log2比率频率直方图（M/L，蓝色；H/L，红色）呈正常分布，由于实验可变性，平均值略微偏离零。（F和G）离子计数总强度与log2比率（分别为M/L和H/L）的散点图。对于具有确定基因名称的蛋白质组，数据点根据显著性A（0<绿色<0.001，0.001<黄色<0.01，0.01<红色<0.05）进行着色。未显示反向蛋白质组和污染蛋白质组。标签（1–25）对应于假定的SUMO基板。未标记的彩色数据点对应于比率计数为1的蛋白质组。另见表S1和S2。

图2
Nhp2和Nop58是SUMO底物，以及修饰位点的识别（A）³⁵对S-Met标记的Nhp2、Nop58和IRF2（阳性对照）进行体外SUMO分析。车道2、9和16的反应条件相同；3和10；以及4和11。显示了未修改的Nhp2和Nop58的位置。（B）希拉牌手表^{6HisSUMO2公司}用WTNhp2-或K5R-Nhp2-GFP转染细胞（48小时）并在6M Gdn-HCl中溶解。6HisSUMO2结合物在镍上纯化²⁺-NTA琼脂糖。输入（I）和洗脱液（E）样品通过抗GFP免疫印迹法进行分析。显示了Nhp2-GFP和Nhp2-GFP+SUMO的位置。用抗SUMO2抗体重染斑点（图S2A）。（C）与（B）中一样，除了GFP外，WTNop58-、2mutNop58（K467R、K497R）-、4mutNop58（K390R、K415R、K467R、K497R）-、K467RNop58-、K497RNop58-或EEAANop58（E469A、E499A）-GFP。背景波段的位置(^∗)显示Nop58-GFP和Nop58-GFP+SUMO。使用抗SUMO2对1–12号车道进行重新处理（图S2B）。（D）不同物种（人类、，Q9Y2X3型; 鼠标，问题6DFW4; 斑马鱼，第6季度第6季度; 果蝇，问题9VM69;拟南芥,O04658号; 和酵母，问题12499)使用ClustalW程序（Uniprot）进行校准。人类Nop58 SUMO站点被装箱。

图3
在无外源性SUMO的情况下检测内源性SUMOylated Nop58，并用针对SENP3和/或SENP5的siRNAs转染核仁SENPs U2OS细胞（72小时）Nop58的去SUMO化，然后在1%SDS中进行初步裂解。使用对照或抗Nop58抗体（B）分离内源性Nop58。使用抗Nop58（A和B，顶部）、-SUMO2（B，中部）、-SAMO1（B，底部）、-SENP5（C，顶部）或-SENP3（C，底部）对输入（A和C）和洗脱蛋白（B）进行蛋白质印迹分析。Ponceau染色用作负荷对照（a，底部）。显示了Nop58和Nop58-SUMO对应的频带位置。另请参见图S3。

图4
Nop56和15.5K是劣质SUMO基板（A）Nhp2(Q9NX24型)和15.5K(第55769页)使用ClustalW程序（Uniprot）对全长序列进行比对。Nhp2中已验证的SUMO站点已装箱。（B）如（A）所示，但不包括第56条(O00567号; aa 301–594）和Nop58(Q9Y2X3型; aa 291–529）。显示了预测的SUMO站点（A和B；SUMOplot）（虚线框）。（C和D）³⁵对S-Met标记的Nop58、Nop56、Nhp2和15.5K进行相同的体外SUMO测定。显示了Met残基的数量、MWs以及未改性Nop56和15.5K的位置。（E）来自HeLa、HeLa的裂解液^{6HisSUMO1公司}和赫拉^{6HisSUMO2公司}细胞（输入；1–3通道）受到镍的影响²⁺-NTA下拉（洗脱液；泳道4-6），并通过抗-Nop56和抗-Nop58的蛋白质印迹进行分析（图S4A）。星号对应于背景带。（F）希拉，希拉^{6HisSUMO1公司}和HeLa^{6HisSUMO2公司}如图所示，用YFP-15.5K转染细胞，并用镍处理²⁺-NTA下拉列表。输入（I）和洗脱液（E）样品用抗GFP和抗SUMO的蛋白质印迹法进行分析（图S4B）。

图5
关于Nop58 SUMO酸化功能结果的鉴定（A）U2OS细胞与编码WTNop58-mCherry和2mutNop58-GFP的构建物共转染20小时，固定细胞荧光显微镜显示，SUMO化不会改变Nop58的亚细胞定位，这与snoRNP的适当掺入一致。每个水平行对应一个z平面。显示了单独和合并的图像（ROI用于量化）。比例尺代表30μm。另请参见图S5A–S5C。（B和C）Nop58 SUMO化对snoRNA结合很重要，如使用U2OS对来自抗GFP IP的洗脱液（顶部）和输入（底部）样品中的snoRNA和U2 snRNA（对照）进行qPCR检测所示^{WT编号58-GFP}和U2OS^{2个Nop58-GFP}裂解物。每个列/误差条表示三个不同IP测量值的平均/标准偏差。GAPDH mRNA作为正常化的参考。调整输入测量值，使WTNop58-GFP的值=1。与对照组相比，洗脱液的测量结果显示折叠富集（蛋白质-G/抗HA Sepharose珠）。P值是通过双尾异方差t检验获得的。输入和洗脱液样品通过免疫印迹法（C）分析内源性和FP标记Nop58的抗Nop58。星号对应于背景带。另请参见图S5D–S5F。（D–F）U2OS^{WTNop58绿色荧光蛋白}和U2OS^{2个Nop58-GFP}用大鼠U3B.7 snoRNA-编码质粒和靶向5′和3′非翻译区（UTR）的对照（FFL）或内源性Nop58 siRNAs共转染细胞（40小时）。通过western blotting（E）和抗Nop58（顶部）以及Ponceau染色作为负荷对照（底部）确认敲除。星号对应于背景带。细胞与Cy5-共轭寡核苷酸探针（红色）原位杂交以对抗大鼠U3B.7 snoRNA，并用DAPI（蓝色）染色。图中显示了与单个z平面对应的合并图像（D）。比例尺表示30μm。在Nop58敲除（F）前后，对具有正确的大鼠U3B.7 snoRNA定位的细胞平均百分比（基于三个不同实验中的40个细胞）进行量化，其中siFFL值调整为100%，P值和误差条如（B）所示。

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