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.2008年12月；10(12):1411-20.
doi:10.1038/ncb1799。 Epub 2008年11月9日。

APC/C通过将Cdc20作为销毁目标来维护主轴组件检查点

雅各布·尼尔森 1, 莫娜·耶克扎尔, 杰里米·明舒尔, 乔纳森·派恩斯
附属公司

APC/C通过将Cdc20作为销毁目标来维护主轴组件检查点

雅各布·尼尔森等。 Nat细胞生物学. 2008年12月.

摘要

纺锤体组装检查点（SAC）用于阻止姐妹染色单体分离，直到所有染色体都正确连接到有丝分裂器上。SAC通过后期促进复合物/环体（APC/C）泛素连接酶抑制细胞周期蛋白B1和安全蛋白的泛素化，防止细胞进入后期。SAC的目标是必需的APC/C激活剂Cdc20。目前尚不清楚SAC是如何使Cdc20失活的，但大多数现有模型表明，Cdc20与Mad2检查点蛋白形成稳定的复合物。这里我们表明，大多数Cdc20与Mad2不在一个复合体中；相反，Cdc20需要Mad2与另一个检查点蛋白BubR1形成复合物。我们进一步表明，在SAC期间，APC/C泛素化Cdc20以使其降解。因此，人Cdc20的泛素化并不需要将其从检查点复合体中释放出来，而是需要将其降解以维持有丝分裂阻滞。

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数字

图1
图1
Cdc20在检查点对应的细胞中降解A）HeLa细胞在S期进行预同步化，随后用诺卡唑阻止细胞有丝分裂6小时。细胞未经处理（对照）或用MG132或放线菌酮（CHX）处理2小时，通过定量免疫印迹法测定BubR1、Cdh1、Cdc20和Mad2的水平。蛋白质水平根据肌动蛋白进行标准化，条形图显示未经处理的样品设置为1时所示蛋白质的水平。B）将环己酰亚胺添加到诺可唑或紫杉醇阻滞的细胞（与A同步）后0、20、40、60和120分钟，通过ECL western blot分析BubR1、Cdc20、Cyclin B1和Mad2的水平（整个blot如图S7所示）。C）将环己酰亚胺或雷帕霉素添加到诺卡唑阻滞的细胞后，在0、20、40、60和120分钟时，Cdc20和Mad2的水平（图S7中显示了整个印迹）。D）将雷帕霉素添加到异步HeLa细胞后，在0、30、60和120分钟时，p70S6K在Thr389上磷酸化。E和F）YFP-Cdc20在单细胞中的降解。将编码YFP-Cdc20的质粒微注射到G2期HeLa细胞中，通过有丝分裂检测荧光水平。请注意，YFP-Cdc20是由cap-dependent mRNA编码的，其翻译在有丝分裂中受到抑制，因此，我们可以在不使用环己酰亚胺的情况下检测降解。在指定的时间添加诺卡唑或MG132。在E）中的前中期和在F）中的G2期中加入诺可唑。在3个独立实验中，细胞代表10个细胞。
图2
图2
Cdc20降解取决于APC/C活性和功能性SAC。一个)用抗GADPH（如图1所示）或APC3的siRNA寡核苷酸处理细胞，72小时后，通过添加环己酰亚胺30分钟并通过定量免疫印迹分析（图S7所示的全印迹），在诺克唑滞留细胞中测定Cdc20的稳定性。B）将Cdc20的水平归一化为Hsp70，显示了3个实验中Cdc20水平的平均值和标准偏差，未经处理的样本设置为1。C）用APC3 siRNA寡核苷酸处理的有丝分裂细胞中YFP-Cdc20荧光水平（该寡核苷酸在95%以上的细胞中阻止细胞有丝分裂数小时）。所示的细胞代表了2个实验中的6个细胞。D） 在诺科达唑存在下，用靶向Mad2或GAPDH的siRNA处理的有丝分裂细胞中YFP-Cdc20荧光水平。所示数据代表了分别针对GAPDH和Mad2、，
图3
图3
Cdc20需要在SAC HeLa细胞中降解APC/C和Mad2结合基序，将编码YFP野生型或突变型Cdc20的质粒微量注射到SAC HeLa细胞中，并在诺康唑存在下通过有丝分裂测定荧光水平。数据代表了每个突变体的3个独立实验。A） IR突变体（R499E）9细胞B）C-box突变体（D77RYIPHR公司83至A77AAIAHA公司83)13细胞C）Mad2-结合位点R132A，12细胞。
图4
图4
凝胶过滤色谱法分析检测点复合物(一个)或用MG132处理紫杉醇阻滞细胞2小时(B类)或用MG132和ZM447439处理紫杉醇抑制细胞2小时(C)在Superose 6柱上分离。检测各组分中的BubR1（红色）、APC4（绿色）、Cdc20（黑色）和Mad2（灰色），并通过定量免疫印迹分析。将值归一化为峰分数值，以获得所示的轮廓。（APC/C和BubR1峰之间出现的星号表示Cdc20的新峰可能是与CCT伴侣结合的Cdc20，因为它并不总是可见的，例如，参见补充图4和5。）结果代表了4个或更多独立实验。（图S7所示紫杉醇阻滞细胞的全杂交。请注意，这是对Cdc20、BubR1和Mad2的顺序探测。）D&E）从诺卡唑滞留细胞的两个峰组分中的每一个免疫沉淀Cdc20（组分22和组分28，见图S4），并分析BubR1、APC3、Bub3和Mad2的存在，以及2 MDa复合物中APC/C亚基的存在(E） 。F-H）用抗GAPDH、Mad2或BubR1的siRNA寡核苷酸处理细胞72小时。在此期间，将细胞从双胸苷块中释放出来，9小时后用诺可唑和MG132处理2小时。Cdc20从振荡收集的有丝分裂细胞中免疫沉淀。通过定量免疫印迹法测定与Cdc20相关的BubR1和Mad2的数量，并将其归一化为Cdc20的数量。GAPDH处理细胞中BubR1和Mad2的水平设置为1。数据是使用BubR1 RNAi寡聚物#1在F中进行的3个独立实验的平均+/-SD，以及使用RNAi寡聚物#2在G中进行的2个独立实验的平均值。整个印迹如图S7所示。在这种情况下，斑点被切割成3块，不同的面板探测BubR1、Cdc20或Mad2。
图5
图5
无赖氨酸的Cdc20突变体覆盖纺锤体检查点A）从杆状病毒感染的SF9细胞中表达和纯化Cdc20的野生型或无K突变体，并用诺可唑阻滞细胞中纯化的APC/C培养增加量。通过免疫印迹法分析Cdc20的反应。。B）用siRNA处理以消耗内源性Cdc20的G2期HeLa细胞注射编码siRNA抗性YFP标记的野生型Cdc20或无K突变体的质粒，并用诺可达唑处理。每隔3分钟通过延时DIC和荧光显微镜监测细胞，并测量和量化荧光水平。YFP-Cdc20 K-less的缓慢下降是由于光浸出。C和D）DIC和细胞荧光图像分析(B类). 表达YFP-Cdc20 K-less蛋白的有丝分裂细胞（箭头所示）(D类)～120分钟后退出诺卡唑阻滞，而表达野生型YFP-Cdc20的细胞仍被阻滞5.5小时以上，并降解YFP-Cd20蛋白(C). 在两个独立实验中，细胞代表17个（野生型）和16个（无K突变型）细胞。
图6
图6
检查点蛋白与Cdc20的分离不需要Cdc20泛素化。A）用抗GAPDH的siRNA或抗APC3和APC11的siRNA处理细胞，并对APC3、APC11和Hsp70进行免疫印迹，作为负荷对照。B）细胞被视为A）用紫杉醇阻止有丝分裂，并通过添加环己酰亚胺（CHX）测定Cdc20的半衰期。C）在中处理的单元格A）与紫杉醇孵育6小时，将样品分成两部分，并添加MG132或MG132加ZM447439。2小时后对Cdc20进行免疫纯化，并通过定量免疫印迹法测定与Cdc20结合的BubR1和Mad2的量。（LC=抗体轻链）。整个印迹如图S7所示。注意，污点被切成3块，面板探测BubR1、Cdc20或Mad2。D）中所示实验的量化抄送：结合的BubR1和Mad2的水平归一化为Cdc20的量，在不含ZM447439的样品中，BubR1和Mad1的水平设置为1。显示了3个独立实验的平均+/-SD。E）稳定表达FLAG-tagged wt或K-less Cdc20的HeLa细胞系从S期释放出来，在9小时后加入MG132，持续2小时，并通过振荡收集有丝分裂细胞。将样品分为两部分，并将100 nM紫杉醇和MG132添加到两者中。1小时后，从一个细胞中免疫纯化FLAG-Cdc20，并在免疫沉淀FLAG-Cdc20前1.5小时向另一个细胞中加入4μM ZM4447439。通过定量免疫印迹法测定与Cdc20结合的BubR1、APC3和Mad2的数量。F）中所示实验的量化E）在没有ZM447439的实验中，将BubR1和Mad2的水平标准化为Cdc20的量，并将绑定到Cdc20上的BubR1和Mad2量设置为1。注意，Cdc20的无K突变体从紫杉醇处理的细胞中共免疫纯化，其具有比wt Cdc20更多的BubR1和Mad2。显示了3个独立实验的平均+/-SD。当检查点失活时，与K-less和wt-Cdc20相关的APC3数量下降了75%。
图7
图7
纺锤体检查点模型Cdc20在有丝分裂中不断合成，并作为APC/C的激活剂。然而，在存在不正确附着的动粒时，Mad2结合Cdc20，这允许Cdc20加载到BubR1上。一旦BubR1与Cdc20结合，就不需要Mad2来维持结合，并在复合物呈现给APC/C之前或之后离开复合物。APC/C随后促进Cdc20的泛素化和降解以维持检查点。
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中的注释

  • 有丝分裂阻滞：Cdc20死亡两次。
    油炸AM，Yamano H。 Fry AM等人。 自然细胞生物学。2008年12月；10(12):1385-7. doi:10.1038/ncb1208-1385。 自然细胞生物学。2008 PMID：19043431

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