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.2005年6月15日；24(12):2172-82.
doi:10.1038/sj.emboj.7600700。 Epub 2005年6月2日。

PIASy在有丝分裂染色体上介导拓扑异构酶-II的SUMO-2结合

Yoshiaki Azuma先生 1, 阿列克谢·阿尔纳乌托夫, 塔达希·安南, 玛丽·达索
附属公司

PIASy在有丝分裂染色体上介导拓扑异构酶-II的SUMO-2结合

Yoshiaki Azuma先生等。 欧洲工商管理硕士J. .

摘要

在这里，我们证明PIASy蛋白是爪蟾卵提取物中通过SUMO-2结合对拓扑异构酶-II进行有丝分裂修饰的特异性必需蛋白。PIASy在PIAS家族成员中是独一无二的，它能够结合有丝分裂染色体并将Ubc9招募到染色质上。这些特性至关重要，因为不结合染色质或不能招募Ubc9的PIASy突变体在功能上不活跃。我们观察到PIASy缺失基本上消除了EGFP-SUMO-2共轭物种的所有染色体积累，表明它是SUMO-2有丝分裂染色体底物的主要E3样因子。PIASy依赖的SUMO-2结合种高度集中于内着丝粒，PIASy的抑制阻断了鸡蛋提取物中后期姐妹染色单体的分离。总之，我们的观察结果表明，PIASy是拓扑异构酶-II和其他染色体底物有丝分裂SUMO-2结合的关键调节器，其活性可能与适当染色体分离所需的着丝粒功能特别相关。

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图1
图1
有丝分裂染色质能够促进拓扑异构酶II的SUMO-2修饰在体外(A类)有丝分裂染色质促进拓扑异构酶-II结合。在含有dnUbc9的脑脊液提取物中组装有丝分裂染色质，并按照材料和方法进行分离。如图所示，染色质与纯化的Uba2/Aos1（20 nM/反应；‘+E1’）、纯化的Ubc9（300 nM/作用；‘+E2’）或两者（‘+E1+E2'）孵育。或者，将染色质与M相卵提取物（1/100体积的反应混合物；“+CSF ext.+E2”）或间期卵提取物（1/100体积的反应混合液；“+Int.ext.+E_2”）以及纯化的Ubc9孵育。在指定的时间（分钟）从反应混合物中取出等分样品，用抗EGFP和抗TopoII抗体的Western blotting分析EGFP–SUMO-2与Topoisomerase-II的结合。括号表示EGFP–SUMO-2偶联的拓扑异构酶II，箭头表示未偶联的EGFP–SUMO-2。(B类)相间染色质不支持拓扑异构酶II结合。染色质是在存在或不存在dnUbc9的情况下从脑脊液或间期提取物中制备的。分离后，将染色质培养在含有纯化Uba2/Aos1、纯化Ubc9和T7–SUMO-2-GG的反应混合物中。在指定的时间（min），取等分样品，用抗Topo2和抗T7抗体进行Western blotting分析T7–SUMO-2与Topoisomerase-II的结合。
图2
图2
PIASy蛋白是有丝分裂SUMO-2与拓扑异构酶II结合所必需的。(A类)PIASy对于拓扑异构酶-II的SUMO-2偶联和Ubc9向染色质的募集至关重要。使用抗人PIASy（-PIASy）抗体对脑脊液提取物进行免疫抑制小时)，的N末端片段爪蟾PIASy（-PIASyxl（xl）-N） 或C末端片段爪蟾PIASy（-PIASyxl（xl）-C） ●●●●。耗尽的提取物与5000个精子核/μl孵育。45分钟后，通过Western blotting分离并分析每个反应的染色质，抗体显示在每个面板的右侧。(B类)缺乏PIASy的有丝分裂染色质不支持拓扑异构酶-II结合在体外使用亲和纯化抗体或用非特异性IgG模拟处理CSF卵子提取物以去除PIASy。将精子染色质添加到每个提取物中，并允许在dnUbc9存在下进行组装。将组装好的染色质分离出来，并在含有E1、E2和EGFP–SUMO-2的反应混合物中培养，如图1所示。用抗EGFP抗体进行Western blotting分析EGFP–SUMO-2的掺入。(C类)重组爪蟾PIASy蛋白恢复PIASy缺失提取物中拓扑异构酶-II的修饰。伊斯6-已标记爪蟾PIASy蛋白在细菌中表达，纯化亲和层析和凝胶过滤。将指示浓度的纯化蛋白添加到之前使用抗PIASy耗尽的脑脊液提取物中xl（xl）-N抗体。用抗PIASy抗体对每个反应的样品进行Western blotting分析，以比较内源性蛋白和重组蛋白的数量（顶部面板）。45分钟后，通过Western blotting分离并分析每个反应的染色质，抗体显示在每个面板的左侧（下面三个面板）。(D类)用人和人拯救拓扑异构酶-II修饰爪蟾PIASy蛋白。人类（PIASy小时)和爪蟾（PIASy公司xl（xl）)PIASy蛋白在网织红细胞裂解物中翻译。将翻译反应添加到之前使用抗PIASy耗尽的脑脊液提取物中xl（xl）-N抗体。如图所示，通过将PIAS-表达的网织红细胞裂解物与未编程的网织白细胞裂解物（对照）混合，将添加的网织细胞裂解物的量调整为最终反应体积的10%。45分钟后，通过Western blotting分离并分析每个反应的染色质，抗体显示在每个面板的右侧。请注意，人类和爪蟾蛋白质的N-末端被T7标记。(E类)与有丝分裂染色质相关的PIASy电泳迁移率降低。PIASy从完整提取物（Ext.）或从染色质盐洗脱获得的组分（染色质洗脱）中免疫沉淀。沉淀蛋白用抗PIASy抗体进行Western blotting分析。显示了M相（CSF）和相间（Int.）提取物的沉淀。
图3
图3
拓扑异构酶-II结合特别需要PIASy。(A类)其他PIAS蛋白不能有效促进拓扑异构酶-II修饰。人、PIAS3、PIASxα、PIASxβPIASy和小鼠PIAS1在网织红细胞裂解物中翻译。将翻译反应或未编程的网织红细胞裂解物（对照）添加到5000个精子核/μl（10%最终反应体积）的脑脊液提取物中。将所有反应培养45分钟，以允许染色质重塑和染色体凝聚。通过免疫印迹法分离并分析反应产生的染色质，抗体显示在上部三个面板的右侧。底部面板显示网织红细胞翻译分析的Western blot。由于所有人类PIAS蛋白的N端都有T7标记，因此可以定量添加到脑脊液提取物中的每个蛋白的相对量。(B类)调节PIAS蛋白与有丝分裂和间期染色质的关联。T7标记的哺乳动物PIAS蛋白在网织红细胞裂解物中表达，并与间期或脑脊液提取物混合，在室温下存在5000个精子核/μl。45分钟后，分离染色质组分，并通过Western blotting和抗T7抗体分析PIAS蛋白的相关性。
图4
图4
拓扑异构酶-II的SUMO-2修饰需要PIASy的三个保守结构域。(A类)分析了PIASy和突变体中保守结构域的表示。(B类)染色质结合和Ubc9招募所需的PIASy域。将表达野生型或突变型人类PIASy蛋白的网织红细胞裂解物添加到缺乏PIASy的提取物中，并用所示抗体通过Western blotting分析染色质组分。(C类)PIASy的外源C末端片段阻断Ubc9向染色质的募集。人类PIASy C末端片段（PIASy小时413–510）和/或Ubc9被添加到含有5000个精子核/μl（PIASy）的脑脊液提取物中小时413–510=0.5，1，2μM；Ubc9=0.2、0.6、2μM）。从这些反应中分离出染色质部分后，用所示抗体通过蛋白质印迹分析SUMO-2与拓扑异构酶II的结合和Ubc9向染色质部分的募集。
图5
图5
PIASy介导有丝分裂染色体IC上SUMO-2掺入。(A类)EGFP–SUMO-2病灶依赖于共轭。含有罗丹明标记微管蛋白（红色）和EGFP–SUMO-2（绿色）的脑脊液提取物被CaCl释放到间期2添加。在CaCl作用5分钟后，总共添加200个精子/μl2并将提取物在23°C下孵育55分钟。通过添加新鲜CSF提取物（反应体积的50%）和dnUbc9（终浓度为150纳克/μl）或不添加dnUbc9（终浓度为150纳克/μl）来诱导重新进入有丝分裂。30分钟后，取出样品，分析微管和EGFP–SUMO-2的分布，并用Hoechst 33342 DNA染料（蓝色）染色。(B类)EGFP–SUMO-2焦点与IC一致。含有EGFP–SUMO-2（绿色）的反应按（A）处理，但添加诺卡唑的同时，用新鲜脑脊液提取物诱导M期再进入。将每个反应的样品旋转到盖玻片上，并用CENP-A和Aurora B抗体进行免疫荧光分析（合并面板中显示为红色）。为了进行比较，来自对照提取物的EGFP–SUMO-2信号也显示在带有Hoechst 33342染色的合并图像中（最右侧面板）。(C类)EGFP–SUMO-2病灶需要有丝分裂PIASy活性。有丝分裂染色质和纺锤体的组装和分析如（A）所示。在用新鲜脑脊液提取物诱导M期重返的同时加入抗PIASy抗体。(D类)EGFP–SUMO-2的IC积累依赖于PIASy。将EGFP–SUMO-2（显示为红色）添加到未经处理的CSF提取物、PIASy贫化提取物或补充网织红细胞翻译的人PIASy的PIASy贫化提取物中。提取物被CaCl释放到界面2添加。精核添加、重新进入有丝分裂和样品制备如（B）所述。每个反应的样品同时用Hoechst 33342染色（以绿色显示）。
图6
图6
抗PIASy抗体对有丝分裂中PIASy功能的干扰导致染色体分离缺陷。(A类)抗PIASyxl（xl）-N和反PIASyxl（xl）-有丝分裂染色质上的C区SUMO-2结合。脑脊液提取物被CaCl释放到间期2添加。在CaCl作用5分钟后，总共添加2000个精子/μl2，并将提取物在23°C下孵育55分钟。用新鲜脑脊液提取物（反应体积的50%）诱导重新进入有丝分裂状态，该提取物含有对照IgG，即针对C末端的抗体爪蟾PIASy（反PIASyxl（xl）-C） ，抗N末端抗体爪蟾PIASy（反PIASyxl（xl）-N） （每种情况下的最终抗体浓度=0.3μg/μl）或dnUbc9（最终浓度为150 ng/μl）。如图所示，从对照反应和每个含抗体反应中分离出有丝分裂染色质。对染色质进行免疫印迹，抗体显示在每个面板的右侧。(B类)抗PIASyxl（xl）-N和反PIASyxl（xl）-C阻断后期姐妹染色单体分离。用罗丹明标记的微管蛋白补充（A）中的反应。CSF提取物诱导中期30分钟后，添加CaCl诱导后期2.在CaCl之前移除等分试样2添加（上排）或CaCl后13分钟2添加（底部三行）。使用Hoechst 33342 DNA染料（绿色）和固定后的微管结构（红色）分析样品的DNA形态。
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