Aurora B couples chromosome alignment with anaphase by targeting BubR1, Mad2, and Cenp-E to kinetochores

doi:10.1083/jcb.200208091

.2003年4月28日；161(2):267-80.

doi:10.1083/jcb.200208091。

Aurora B通过将BubR1、Mad2和Cenp-E靶向动粒，将染色体比对与后期配对

克莱尔·迪奇菲尔德¹, 维多利亚·L·约翰逊, 安东尼·提格, 丽贝卡·埃尔斯顿, 卡罗琳·霍沃思, 特雷弗·约翰逊, 安德鲁·莫特洛克, 尼古拉斯·基恩, 斯蒂芬·泰勒

附属公司

PMID： 12719470
预防性维修识别码： PMC2172902型
内政部： 10.1083/jcb.200208091

Aurora B通过将BubR1、Mad2和Cenp-E靶向动粒，将染色体比对与后期配对

克莱尔·迪奇菲尔德等。 J细胞生物学. 2003.

.2003年4月28日；161(2):267-80.

doi:10.1083/jcb.200208091。

作者

附属

¹曼彻斯特大学生物科学学院，英国曼彻斯特M13 9PT牛津路斯托福德大厦2.205号。

PMID： 12719470
预防性维修识别码： PMC2172902型
内政部： 10.1083/jcb.200208091

摘要

蛋白激酶Aurora/Ipl1家族在有丝分裂和胞质分裂中起着多重作用。在这里，我们描述了ZM447439，一种新型选择性极光激酶抑制剂。经ZM447439处理的细胞通过间期进行，正常进入有丝分裂，并组装双极纺锤体。然而，染色体排列、分离和胞质分裂都失败了。尽管存在取向错误的染色体，但ZM4447439处理的细胞以正常的动力学退出有丝分裂，表明纺锤体检查点受到损害。事实上，ZM447439可以防止接触紫杉醇后的有丝分裂阻滞。RNA干扰实验表明，这些表型是由于Aurora B的抑制，而不是Aurora A或其他一些激酶的抑制。在没有极光B功能的情况下，纺锤检查点组件BubR1、Mad2和Cenp-E的动粒定位减弱。此外，抑制Aurora B激酶活性可防止在着丝粒张力降低后BubR1重新结合到中期动粒。Aurora B激酶活性也是进入有丝分裂时BubR1磷酸化所必需的。最后，我们证明了BubR1不仅是纺锤体检查点功能所必需的，而且也是染色体对齐所必需的。总之，这些结果表明，通过将检查点蛋白靶向动粒，Aurora B将染色体对齐与后期发病配对。

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数字

**图1。**
**ZM447439抑制极光A和极光B。**（A） ZM447439的化学结构。（B） IC显示表₅₀针对一组蛋白激酶的ZM447439值（μM）。（C）用ZM447439处理HeLa、A549和HME细胞数小时后的DNA含量直方图。（D）有丝分裂DLD-1细胞磷酸组蛋白H3（绿色）和DNA（红色）染色。

**图2。**
**p53在ZM447439存在下抑制核内复制。**（A）具有（p53+）或不具有（p53−）功能性p53应答的U20S细胞的DNA含量直方图，用ZM447439处理，时间以小时为单位。（B）生长停滞或增殖的MCF-7细胞暴露于ZM447439 72 h，然后分析在没有ZM447739的情况下形成集落的能力。（C）柱状图量化了用一系列ZM447439浓度处理的MCF-7细胞的克隆效率。每个值代表三个独立实验的平均值和SD。

**图3。**
**ZM447439处理的细胞进入有丝分裂，但不能分裂。**HeLa细胞从G1/S释放到不同的药物组合中，在指定的时间（小时）收获，然后通过流式细胞术和免疫印迹分析。所示数据代表了三个独立的实验。A和B中的数据来自同一个实验，其中有丝分裂指数在G1/S释放后10小时达到峰值。C中的数据来源于一个独立的实验，其中，有丝分裂指标在G1/S.释放后12小时达到峰值，（A）DNA含量直方图显示ZM447439处理的细胞无法分裂，但以与对照细胞相似的动力学重新复制它们的基因组。（B）由MPM-2反应性测定的有丝分裂指数随时间的曲线图显示，经ZM447439处理的细胞以与对照相似的动力学进入和退出有丝分裂。（C）免疫印迹显示，在ZM447439处理的细胞中，细胞周期蛋白B1水平上升和下降，其动力学与对照组相似。Tubulin用作加载控件。

**图4。**
**ZM447439防止染色体对齐和分离。**（A）有丝分裂DLD-1细胞微管蛋白、动粒/着丝粒（ACA，绿色）和DNA（红色）染色。底部面板显示了用ZM447439处理1小时后经常观察到的异常前中期的示例（B）量化DLD-1细胞暴露于ZM447739 1小时后的前期（P）、前中期（PM）、中期（M）和后期（A）细胞数量的图表，表明染色体对齐和分离受到抑制。（C）显示在用单独的ZM4447439（红色菱形）、诺可达唑（黄色正方形）或ZM4447439加上诺可达唑（蓝色三角形）处理后所指示的时间DLD-1培养物的有丝分裂指数的图。B和C中的值表示来自三个独立实验的平均值和SEM，其中至少计数了1000个细胞。（D） ZM447439处理的HeLa细胞的电子显微照片，显示动粒（箭头）和动粒纤维。

**图5。**
**ZM447439损害了主轴检查点功能。**（A–C）有丝分裂HeLa细胞在诺卡唑阻滞12小时后通过选择性分离分离，在不同药物组合中重新种植，然后在指定的时间采集并分析。（A） DNA含量直方图显示对照细胞在1小时后分裂。（B）绘制由MPM-2反应性测定的有丝分裂指数的图表，显示ZM447439加速了有丝分裂的退出。（C）免疫印迹显示，在ZM447439处理的细胞中，细胞周期蛋白B1和磷酸组蛋白H3水平迅速下降。用药物组合处理（D和E）DLD-1细胞，然后固定并通过荧光显微镜进行分析。（D）绘制6小时后有丝分裂指数的柱状图显示，ZM447439可以降低紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞，但不能降低诺卡唑诱导的有核分裂阻滞。（E）绘制8小时后有丝分裂指数的折线图，显示ZM447439解决了诺卡唑和紫杉醇对纺锤检查点功能的影响。D和E中的值表示三个独立实验得出的平均值和SEM，其中至少有1000个细胞被计数。所使用的药物组合是单独使用诺可唑（Noc，黄色方块）；紫杉醇单独用药（税务）；仅ZM447439（ZM，红色钻石）；诺卡唑加ZM447439（新西兰，蓝色三角形）；紫杉醇加ZM447439（TZ，绿色方块）；无药物（对照组，绿色圆圈）。（F）诺克唑阻滞2小时或12小时后收获的有丝分裂HeLa细胞被替换为诺克唑（黑条）或诺克唑加ZM447439（白条），有丝分裂指数是通过测量4小时后MPM-2的反应性来确定的。柱状图显示，ZM447739在长时间有丝分裂阻滞后，可以破坏诺克唑诱导的检查点激活。

**图6。**
**ZM447439不能阻止极光B定位到着丝粒。**在（A）暴露于ZM447439 1 h或（B）转染Aurora B siRNA双链后，对前中期DLD-1细胞的免疫荧光图像进行染色，以检测Aurora A（绿色）、Survivin（红色）和DNA（蓝色）。（C）瞬时转染HeLa细胞，表达Myc-tagged Aurora B或Myc-tag Aurora BK106R，染色检测Aurora B（绿色）、Myc-tagned蛋白质（红色）和DNA（蓝色）。

**图7。**
**ZM447439抑制BubR1的动粒定位和磷酸化。**（A）去卷积图像堆栈的投影显示有丝分裂DLD-1细胞用指定药物处理1小时，然后染色以检测动粒/着丝粒（ACA）、BubR1和DNA。（B）绘制了各种条件下BubR1与ACA信号的荧光比率的条形图，表明ZM447439将BubR1信号降低了约10倍。数值表示至少在三个不同细胞中分析的至少26个不同的着丝粒/着丝粒对的平均值和SEM。（C）未经处理的细胞（绿色圆圈）或暴露于ZM447439（红色钻石）或紫杉醇（蓝色方块）40分钟的细胞中期动粒的BubR1信号强度与动粒间距离的曲线图。使用ACA病灶确定动粒位置。椭圆至少包含75%的数据点。（D）通过免疫印迹分析从G1/S释放到所指示的药物中后通过选择性分离收集的有丝分裂HeLa细胞。在ZM447439存在下，BubR1的磷酸化形式无法检测到。（E） BubR1从诺卡唑阻滞的有丝分裂HeLa细胞中亲和纯化，并在ZM447439存在下检测激酶活性。每个值代表三个独立实验得出的平均值和SEM。

**图8。**
**极光B的抑制阻止了BubR1的动粒定位。**用siRNA双工体转染HeLa和DLD-1细胞以抑制Aurora A或B。数值表示三个独立实验的平均值和SEM，其中至少计算了1000个细胞。（C）靶向Aurora A（顶部）和Aurora B（底部）的siRNAs转染后，诺卡唑处理的有丝分裂DLD-1细胞的投影去卷积图像堆栈。（D）对照组和Aurora B RNAi培养中纺锤体形态的例子。（E）对照细胞和极光B抑制细胞的动粒间距图。

**图9。**
**抑制BubR1可阻止染色体对齐。**用siRNA双工体转染DLD-1细胞以抑制BubR1，然后进行染色以检测Bub1（绿色）、微管蛋白（红色）和DNA（蓝色）。（A）染色体沿着纺锤体长度而不是沿着中期板排列的异常前中期细胞的例子。条形图显示，约40%的前丝分裂出现异常，染色体沿纺锤体长度排列。（B）使用Bub1焦点测量的动粒间距离图，以确定动粒位置。（C）暴露于MG132 1小时后，有丝分裂细胞表现出前中期或中期染色体对齐的比例。数值代表三个独立实验得出的平均值和SEM，其中至少计算了100个有丝分裂细胞。

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