感谢您提交您的文章“早期小鼠胚胎的胚胎外和胚胎区域的不同中胚层迁移表型”供考虑电子生活。你的文章已经过三位同行评审员的评审，其中包括作为评审编辑和第一评审员的莉莲娜·索尼卡·克雷泽尔，而作为高级编辑的乔纳森·库珀对你的评价进行了监督。以下参与审查您提交的文件的人员已同意透露其身份：Margot Williams（审查人#3）。

审稿人相互讨论了这些评论，审稿编辑起草了这一决定，以帮助您准备修改后的提交。

利用漂亮的体内成像，原稿描述了单个内化胚胎和胚外中胚层细胞在原肠化小鼠胚胎中的迁移行为，并揭示了它们之间的差异。胚胎和胚外中胚层（ExM）在迁移、细胞形状、肌动蛋白组织和突起活动方面的差异与RNA-seq数据集相关，该数据集揭示了基因表达的有趣差异。

作者首先提供了与胚胎中胚层（EM）相比，ExM迁移速度、位移和直线度降低的证据，并将其与细胞形状、数量和产生的细胞突起类型的数量和质量差异联系起来。然后，他们分析了纯化的ExM和EM群体中的基因表达，以确定其所识别的不同细胞行为的可能分子调节器。差异表达基因包括那些在细胞迁移中具有潜在作用的基因，包括粘附、细胞外基质、导向和细胞骨架基因。值得注意的是，与肌动蛋白细胞骨架相关的基因在ExM中往往减少，而编码中间丝的基因在ExM中增加。

根据观察到的ExM和EM之间细胞骨架和迁移行为之间的差异，作者通过在穿过原始条纹的细胞中有条件地丧失功能来评估Rho GTP酶RhoA和Rac1在中胚层迁移中的作用。他们发现，两种GTPase的丢失对ExM迁移的影响小于EM，这表明这两种中胚层种群具有不同的分子调控。基于这些功能研究，作者认为胚胎中胚层依赖Rho GTPases，而非胚外中胚层，这表明依赖于不同的细胞骨架重排。

人们早就认识到ExM迁移的遗传调控与胚胎中胚层的遗传调控不同，但这种差异的细胞和分子基础在很大程度上尚不清楚。这是一项有趣的、简明的、仔细进行的研究，它揭示了这个问题。手稿的描述性方面很新颖，值得关注电子生活读者群。RNA-seq数据集，特别是ExM的RNA-seq数据集，为未来的分析以及物种内和物种间的比较提供了有价值的数据，尤其是现在在合成体外场景中研究小鼠和人类原肠胚形成的各个方面时。由于这些原因，评论者认为这项工作在我们对原肠胚形态发生的理解上取得了重要进展。然而，仍有一些错失的机会可能为中胚层细胞与周围组织，特别是内脏内胚层之间的关系提供了令人兴奋的数据。在本报告发布之前，作者还应解决其他问题（如下所列）。

基本修订：

1） 研究表明，覆盖在后部外胚层上的内脏内胚层细胞近端三分之一保持相对连贯，形成一个新月形，在前面逐渐变细（Kwon等人，2008）。Kwon及其同事建议将该地区作为信号中心。内脏内胚层的这一区域似乎覆盖了胚胎近端后部胚胎中胚层细胞的扩散区域。后中胚层和后内脏内胚层的运动之间有关系吗？如果实验性地解决这个问题会将修订时间延长到2个月以上，那么作者至少应该讨论这个问题。

2） Kwon等人（2008年）还认为，远端内脏内皮细胞与最终内皮细胞相互嵌入。这一现象在作者的实验中明显吗？

3） Karen Downs的实验室认为，位于胚胎外区域的后部内脏内胚层细胞会脱落，并有助于胚胎外中胚层衍生物，如尿囊（Rodriguez和Downs，2017）。在目前的研究中是否观察到这种现象？胚胎外中胚层迁移是否不需要GTPase，或者这两种细胞类型之间是否存在不同的遗传冗余？至少应该对胚胎中胚层中Rho/Rac1的上游调控因子进行一些讨论。

4） 一些图包含描述每个细胞丝状体数量的图表。这是单位时间的丝状体吗？还是在一个时间点？中胚层细胞在几个小时的成像过程中只产生7个丝状伪足，这似乎是不现实的。不过，这可能是成像间隔的结果。细胞突起是非常动态的，并且每20分钟一次堆叠可能不能提供这种类型的量化所需的足够的时间分辨率。作者能否澄清这些测量是如何进行的？

5） 在基因表达谱分析实验中，将EM和ExM样本与“非中胚层对照”进行比较——这些是什么类型的组织？为什么它们与胚胎中胚层而不是ExM聚集在一起？

6） 在描述这些分析实验的结果时，作者讨论了某些GO术语和基因簇在差异表达基因中的富集，但尚不清楚与这些术语/簇相关的基因在ExM和EM中的表达是增加还是减少。图4补充图1A中的情况也是如此，其中显示了每个富集项的p值，但没有给出ExM或EM中增加或减少的信息。

7） 本报告的一个主要结论是“胚外中胚层运动是……GTPase依赖性的”。然而，没有提供量化来支持这一关键发现。尽管在RhoA和Rac1的胚外区域可以看到ExM细胞；T-cre条件KO胚胎，尚不确定这些细胞的数量是否与对照胚胎相当，以及它们在迁移过程中是否表现出类似的动力学。作者已经证明了他们能够量化迁移中胚层细胞的突起大小和数量、迁移速度、持久性等。应分析Rac1和RhoA突变ExM细胞的细胞轨迹和ExM细胞迁移速度，并与野生型ExM细胞进行比较，如表1所示。

8） 使用T（s）-Cre转基因系驱动原始条纹中的Cre表达。在这个系中，cre的表达是由Brachyury（T）启动子驱动的。T、 然而，也在胚胎外外胚层中表达（Rivera-Perez和Magnuson，2005；Perea-Gomez等人，2004）。我假设在T（s）-cre胚胎中，cre在胚外外胚层中不表达。如果是这样，作者需要强调的是，转基因只在原始条纹中表达。此外，请强调，使T失活的是一个随机插入的转基因系，而不是T基因座的敲除系。

9） “后视图（图1A）显示，原始条纹从近端延伸到远端，并且细胞从条纹中出来呈圆形”。上皮细胞在顶端-基部方向伸长。在这张图中，中线细胞的形状确实是圆形的。然而，目前尚不清楚这是代表细长细胞的横截面还是3D中的真正圆形。应提供其他图像或信息来支持这一结论。此外，这是证实了作者早期的观察结果还是一个新的观察结果？

10） “胚外细胞被拉长，有时覆盖整个胚胎宽度，甚至大一倍”。作者可以评论他们的第三维度吗？与胚胎细胞相比，它们更扁平吗？

同样引人注目的是，这些胚胎外细胞的体积是胚胎中胚层细胞的两倍（表2）。造成这种差异的原因是什么？原始条纹中的前驱体不同吗？还是胚胎外群体的细胞分裂更少？

11） 总的来说，通过清楚地陈述激发各个实验路线的问题并提供结论，手稿将得到改进。例如，本节的标题是“中胚层内的细胞间通信”，但没有提出任何问题。结果描述了中胚层细胞层子细胞的相对迁移行为。在本节的第二部分中，中胚层细胞在接触时的行为通常不会导致接触抑制，与之前报道的神经嵴细胞的行为相比。关于这一部分的一个担忧是，为什么它被命名为“细胞间通信”，因为没有直接证据表明除了细胞“向同一方向迁移，保持彼此靠近，并通过薄投影保持联系”以外的细胞之间的通信，应该比较子细胞和在延时开始时彼此靠近的细胞的行为。所描述的两个子细胞的行为是异常的还是碰巧彼此靠近的两个细胞的典型行为？最后，在本节末尾没有结论。

12） 关于中胚层细胞迁移细胞行为的研究结果也应在其他系统原肠胚形成研究和小鼠工作的背景下更好地呈现。鉴于作者强调集体细胞行为果蝇属和其他脊椎动物一样，中胚层细胞的蜿蜒迁移在眼底通过对John Trinkaus和Solnica-Krezel实验室对斑马鱼的开创性研究，以及Weijer实验室对鸡胚的研究，进行鱼类研究。特别是具有突出活动的单个中胚层细胞的蜿蜒定向迁移与Jessen等人2002年在斑马鱼原肠中描述的迁移非常相似。因此，Migeotte及其同事证明，在小鼠胚胎中，除了轴中胚层的插入运动外，中胚层原肠胚形成运动还需要在胚胎中胚层细胞上进行定向迁移。

此外，在思考胚胎和胚外中胚层迁移调节之间的差异时，注意到先前研究的结果可能会有所帮助，这些研究也观察到这两个种群的关键差异：

A） 在FGF8和FGFR1突变小鼠胚胎中，胚胎中胚层无法从PS迁移，但胚外中胚层可以迁移（Yamaguchi等人，1994；Sun等人，1999）。

B） 影响BMP信号传导的突变，包括BMP4、Pace/Furin和BMP受体，可以防止胚胎原始条纹的形成，但可以产生一些胚胎外中胚层（Gu等人，1999年；Song等人，1999年；Beck等人，2002年；Winnier等人，1995年）。

此外，作者注意到，翻滚行为与更直的位移交替出现，这与斑马鱼胚胎中描述的“翻滚和奔跑”运动极为相似（Diz-Munoz等人，2016）。这种相似性值得注意和引用。

参考文献：

Perea-Gomez A、Camus A、Moreau A、Grieve K、Moneron G、Dubois A、Cibert C、Collignon J。在小鼠胚胎中开始原肠胚形成之前，前后轴的方向发生了明显的改变。当前生物量。2004年2月3日；14(3):197-207.

Rivera-Pérez JA，Magnuson T.小鼠原始条纹形成之前，Brachyury和Wnt3的局部激活。开发生物学。2005年12月15日；288(2):363-71.

Rodriguez AM，Downs KM。内脏内胚层和原始条纹相互作用，构建小鼠原肠胚的胎儿-胎盘界面。开发生物学。2017年12月1日；432(1):98-124. doi:10.1016/j.ydbio.2017.08.026。

[编者注：如下文所述，在接受之前要求进一步修订。]

感谢您重新提交题为“早期小鼠胚胎胚外和胚胎区域的独特中胚层迁移表型”的工作，以供在电子生活乔纳森·库珀（Jonathan Cooper）担任高级编辑和评论编辑，对你修改后的文章给予了好评。

在这份修改后的手稿中，作者基本上解决了审稿人的问题和担忧。这份手稿极大地促进了我们对小鼠原肠胚形成期间中胚层迁移的细胞和分子机制的理解，并揭示了胚胎和胚外中胚层移动之间有趣的细胞和分子学机制。尽管手稿已经得到了改进，但在接受之前仍有一些问题需要解决，如下所述：

正如评论员建议的那样，作者分析了成对相邻细胞的运动（第三段“细胞间接触对中胚层内轨迹的影响”小节）。为了弄清楚这个场景和同时迁移的两个子单元的场景之间的区别，可以说“相邻的不相关单元对”吗？此外，作者是否观察到了与子代细胞对中观察到的细胞相连接的任何投影（参见上述小节的第二段）？这在后面的结论句中说明，但应在此处说明。

此外，在讨论的第三段中还应包括观察到无关细胞也可以遵循平行路径。

请在数字面板上指出发展阶段。

“胚外中胚层迁移是Rho GTPases独立的”小节，第三段：“……Rhoa缺失外植体的实时成像”，而“Rhoa突变原肠或胚胎外植体实时成像”。

参与者信息

Lilianna Solnica-Krezel，美国华盛顿大学医学院。

Lilianna Solnica-Krezel，美国华盛顿大学医学院。

马戈特·威廉姆斯，美国华盛顿大学医学院。

基本修订：

1） 已经表明，覆盖在后部区域的外胚层上的内脏内胚层细胞的近三分之一保持相对一致，形成向前逐渐变细的新月形（Kwon等人，2008）。Kwon及其同事建议将该地区作为信号中心。内脏内胚层的这一区域似乎覆盖了胚胎近端后部胚胎中胚层细胞的扩散区域。后中胚层和后内脏内胚层的运动之间有关系吗？如果实验性地解决这个问题会将修订时间延长到2个月以上，那么作者至少应该讨论这个问题。

内脏内胚层细胞以番茄膜为标记。我们设计了双光子实时成像的条件，以获得最佳的GFP信号，并且番茄刚好能够获得胚胎的解剖结构，从而减少光毒性。由于相对较弱的番茄信号和后部内脏内胚层细胞的形态往往相当平坦，我们无法可靠地跟踪内脏内胚层细胞的运动。

我们补充了Kwon等人提出的后部内脏内胚层的潜在信号功能（小节“中胚层细胞根据其与不同胚层的相互作用具有不同的形态”）。

2） Kwon等人（2008年）还认为，远端内脏内皮细胞与最终内皮细胞相互嵌入。这一现象在作者的实验中明显吗？

穿过条纹成为最终内胚层的细胞似乎不表达Cre，因为我们很少在内胚层观察到GFP阳性细胞，即使是在稍后的时间点（E7.75）。

转基因T（s）：：Cre系是使用由Brachyury基因调控元件组成的构建物构建的，该调控元件在融合到Cre cDNA的原始条纹中指导基因表达。它并没有概括内源性T表达的所有方面。这一观察结果与Feller等人，2008年发表的线的特征相符：图1——图补充1A，a T（s）：：Cre；头褶期的Rosa26-LacZ胚胎内胚层没有可见的蓝色细胞。

或者，Burtscher和Lickert（2009）描述了FoxA2和T沿着条纹的反平行梯度，因此T可能不会标记内胚层祖细胞，只标记中线和中胚层。我们没有做实验来区分这两种可能性。

我们澄清了T-Cre转基因株系的设计（第一段“胚胎与胚外区域中胚层迁移模式和细胞形状不同”小节），声明我们没有看到明确的内胚层，并提出了解释（“中胚层细胞根据其与不同胚层的相互作用而具有不同的形态”小节）。

3） Karen Downs的实验室认为，位于胚胎外区域的后部内脏内胚层细胞会脱落，并有助于胚胎外中胚层衍生物，如尿囊（Rodriguez和Downs，2017）。在目前的研究中是否观察到这种现象？胚胎外中胚层迁移是否不需要GTPase，或者这两种细胞类型之间是否存在不同的遗传冗余？至少应该对胚胎中胚层中Rho/Rac1的上游调控因子进行一些讨论。

如上所述，番茄表达细胞无法如此清晰地显示出来，这使得它们的追踪不可靠。此外，表明后内脏内胚层细胞分层成为胚外中胚层的实验大多是从零芽期开始进行的，而我们的大多数记录是在早条纹期和零芽期之间进行的，因此我们没有处于观察这一现象的最佳位置。

事实上，我们的数据无法区分RhoGTPase依赖性的缺失和不同的冗余。我们在手稿中对此进行了更正（最后一段“胚外中胚层迁移是Rho GTPases独立的”小节）。我们还提出RhoGTPases可能是Fgf信号传导的下游（讨论，第六段）。

4） 一些图包含描述每个细胞丝状体数量的图表。这是单位时间的丝状体吗？还是在一个时间点？中胚层细胞在几个小时的成像过程中只产生7个丝状伪足，这似乎是不现实的。不过，这可能是成像间隔的结果。细胞突起是非常动态的，每20分钟一次叠加可能无法提供这种量化所需的足够时间分辨率。作者能否澄清这些测量是如何进行的？

这确实令人困惑。它是“每个细胞每个时间点的丝状体”。图例中已对此进行了说明。

5） 在基因表达谱分析实验中，将EM和ExM样本与“非中胚层对照”进行比较——这些是什么类型的组织？为什么它们与胚胎中胚层而不是ExM聚集在一起？

非中胚层对照包含所有非GFP细胞的混合物，包括胚外外胚层、外胚层和内脏内胚层，可能还有一些未标记的中胚层细胞。我们没有详细分析这些数据，因为样本之间的结果非常不一致，可能是因为不同样本中每个群体的细胞比例不相等，因为我们没有从每个胚胎池收集所有非GFP细胞。胚胎控制往往更接近胚胎中胚层，这可能是因为大多数细胞可能起源于外胚层。由于没有讨论这些样本的数据，我们将其从tSNE图和表3中删除。

6） 在描述这些图谱实验的结果时，作者讨论了差异表达基因中某些GO术语和基因簇的富集，但尚不清楚与这些术语/簇相关的基因在ExM和EM中的表达是增加还是减少。图4补充图1A中的情况也是如此，其中显示了每个富集项的p值，但没有给出ExM或EM中增加或减少的信息。

GO是根据差异调节基因列表进行的，无论哪个方向。现在，QLF列表已根据更高表达式的区域分为两部分，并基于这两个列表执行GO。该分析如图4补充图1A所示，并在正文中描述（第1段“胚胎和胚外中胚层分子特征”小节）。

7） 本报告的一个主要结论是“胚外中胚层运动是……GTPase依赖性的”。然而，没有提供量化来支持这一关键发现。尽管在RhoA和Rac1的胚外区域可以看到ExM细胞；T-cre条件KO胚胎，尚不确定这些细胞的数量是否与对照胚胎相当，以及它们在迁移过程中是否表现出类似的动力学。作者已经证明他们有能力量化迁移中胚层细胞突起的大小和数量、迁移速度、持续性等。应分析Rac1和RhoA突变ExM细胞的细胞轨迹和ExM细胞迁移速度，并与野生型ExM细胞进行比较，如表1所示。

为了整合指向GTP酶依赖性差异的数据，我们增加了对实时成像数据的定量分析。

在原肠胚形成早期，GFP阳性细胞的数量在野生型胚胎中差异很大，这是由于T-Cre表达的嵌合性。因此，比较野生型和突变型胚胎的细胞数量是不现实的。

然而，我们可以分割突变胚胎中的细胞，并记录细胞形状和运动的定量数据。我们在突变体的胚胎和胚外区域分割中胚层细胞。由于突变胚胎的形状不规则，很难完全注册。由于可用的细胞数量相对较少，我们尽可能长时间地跟踪它们，这导致了不同的观察时间。因此，我们无法直接比较净位移和行程位移。尽管如此，与野生型胚胎相比，Rho和Rac突变体的胚胎中胚层细胞速度显著下降，但胚外中胚层的细胞速度没有显著下降。数据已添加到图6补充1（图6补充1-源数据1和2）中，并在手稿中进行了描述（“胚外中胚层迁移与Rho GTP酶无关”小节，最后一段）。

此外，我们对Rac1fl/ko进行了实时成像；mTmG；Sox2-Cre胚胎，并证实存在GFP阳性的胚外中胚层细胞分散在胚外区域，而GFP阳性中胚层的细胞局限在胚胎区域原始条纹附近的隆起处（“胚外中层迁移是Rho-GTP酶独立的”小节，最后一段）。这些图像已添加到图6补充图2中。

8） 使用T（s）-Cre转基因系驱动原始条纹中的Cre表达。在这个系中，cre的表达是由Brachyury（T）启动子驱动的。T、 然而，也在胚胎外外胚层中表达（Rivera-Perez和Magnuson，2005；Perea-Gomez等人，2004）。我假设在T（s）-cre胚胎中，cre在胚外外胚层中不表达。如果是这样，作者需要强调的是，转基因只在原始条纹中表达。此外，请强调，使T基因座失活的是一个随机插入的转基因株系，而不是敲入株系。

请参阅对第2点的回应。我们检查了mTmG；T-cre胚胎介于E6.25和E6.5之间，尚未在胚胎外外胚层中发现任何GFP阳性细胞。

9） “后视图（图1A）显示，原始条纹从近端延伸到远端，并且细胞从条纹中出来呈圆形”。上皮细胞在顶端-基部方向伸长。在这张图中，中线细胞的形状确实是圆形的。然而，目前尚不清楚这是代表细长细胞的横截面还是3D中的真正圆形。应提供额外的图像或信息来支持这一结论。此外，这是证实了作者早期的观察结果还是一个新的观察结果？

它表示瓶形细胞圆形部分的横截面。这证实了早期的观察结果，尤其是Williams等人的观察结果。文本中已明确指出（第二段“胚胎与胚外区域中胚层迁移模式和细胞形状不同”小节）。

10） “胚外细胞被拉长，有时覆盖整个胚胎宽度，甚至大一倍”。作者可以评论他们的第三维度吗？与胚胎细胞相比，它们更扁平吗？同样引人注目的是，这些胚胎外细胞的体积是胚胎中胚层细胞的两倍（表2）。造成这种差异的原因是什么？原始条纹中的前驱体不同吗？还是胚胎外群体的细胞分裂更少？

胚外细胞更大、更长。体积的增加大于表面的增加，这表明它们并不平坦。

我们量化了延时记录中的细胞分裂。在平均360分钟内，从4个处于条纹中期的不同胚胎中观察到胚胎和胚外中胚层细胞，并记录了分裂事件。未考虑靠近胚胎/胚外界面迁移的细胞，以避免错位。分裂事件计数按每个区域GFP阳性细胞总数进行标准化。我们确实发现，与胚外中胚层相比，胚胎中的分裂频率更高。该数据已添加到文本中（第四段“胚胎与胚外区域中胚层迁移模式和细胞形状不同”小节），如图1-图补充1所示（图1-补充1-源数据1）。

11） 总的来说，通过清楚地陈述激发各个实验路线的问题并提供结论，手稿将得到改进。例如，本节的标题是“中胚层内的细胞间通信”，但没有提出任何问题。结果描述了中胚层细胞层中子细胞的相对迁移行为。在本节的第二部分中，中胚层细胞在接触时的行为通常不会导致接触抑制，与之前报道的神经嵴细胞的行为相比。关于这一部分的一个担忧是，为什么它被命名为“细胞间通信”，因为没有直接证据表明除了细胞“向同一方向迁移，保持彼此靠近，并通过薄投影保持联系”以外的细胞之间的通信，应该比较子细胞和在延时开始时彼此靠近的细胞的行为。所描述的两个子细胞的行为是异常的还是碰巧彼此靠近的两个细胞的典型行为？最后，本节末尾没有结论。

我们修改了小节标题（“细胞间接触对中胚层内轨迹的影响”），并为该段添加了引言和结论。

对紧邻的成对细胞进行分割和跟踪。在胚胎区，成对中胚层细胞在152分钟内以相同方向（角度：9.9°±2.77）移动了相似的距离（净位移比：0.88±0.03，n=13对来自4个胚胎）。成对电池之间的行程位移比和最终距离分别为0.75±0.04和15.2µm±3.84µm（图3源数据3）。所有的值都与观察到的子细胞位移相似，因此子细胞的行为实际上类似于两个恰好彼此靠近的细胞的行为。该数据包含在“细胞间接触对中胚层内轨迹的影响”小节的第三段中。

12） 关于中胚层细胞迁移细胞行为的研究结果也应在其他系统原肠胚形成研究和小鼠工作的背景下更好地呈现。鉴于作者强调集体细胞行为果蝇属约翰·特林考斯（John Trinkaus）和其他脊椎动物的开创性研究记录了中胚层细胞在底栖鱼类和斑马鱼中的蜿蜒迁移，索尼卡·克雷泽尔（Solnica-Krezel）实验室的研究记录了斑马鱼的中胚叶细胞，韦杰尔实验室（Weijer laboratory）的研究也记录了在鸡胚中的中胚层细胞。特别是具有突出活动的单个中胚层细胞的蜿蜒定向迁移与Jessen等人2002年在斑马鱼原肠中描述的迁移非常相似。因此，Migeotte及其同事证明，在小鼠胚胎中，除了轴中胚层的插入运动外，中胚层原肠胚形成运动还需要在胚胎中胚层细胞上进行定向迁移。

引言中增加了对John Trinkaus和Jessen等人工作的参考，并提供了关于Weijer实验室工作的更多细节（引言，第三段）。

此外，在思考胚胎和胚外中胚层迁移调节之间的差异时，注意到先前研究的结果可能会有所帮助，这些研究也观察到这两个种群的关键差异：

A.在FGF8和FGFR1突变小鼠胚胎中，胚胎中胚层无法从PS迁移，但胚外中胚层可以迁移（Yamaguchi等人，1994；Sun等人，1999）。

表型确实惊人地相似，应该被提及。我们在讨论中纠正了这一点（讨论，第六段）。

B.影响BMP信号传导的突变，包括BMP4、Pace/Furin和BMP受体，可以阻止胚胎原始条纹的形成，但可以产生一些胚外中胚层（Gu等人，1999；Song等人，1999年；Beck等人，2002年；Winner等人，1995年）。

在ActRIA突变体中（Gu等人，1999年），没有原始条纹，在胚胎外区域有一些间充质细胞（通过形态学而非标记进行鉴定）。在双ActRIIA/IIB突变体中没有条纹和中胚层，在IIA中^-/-IIb公司^+/-这两个地区都有一些中胚层（Song等人，1999年）。在BMP4 KO中（Winner等人，1995），也没有条纹，还有少量胚外中胚层（也通过形态学鉴定）。我们担心这种比较在这里可能会令人困惑，因为由于缺乏原始条纹，这种现象可能会有所不同。观察到的胚外中胚层细胞可能来自另一层（参见Rodriguez和Downs，2017）。Furin/Pace 4双突变体在E7.5时尺寸减小，没有羊膜、尿囊或绒毛膜，一些表达FgF8和Lhx1的中胚层突入空腔，但没有显示胚胎外中胚层的标记（Beck等人，2002）。

因此，我们宁愿不包括这些参考。

此外，作者注意到，翻滚行为与更直的位移交替出现，这与斑马鱼胚胎中描述的“翻滚和奔跑”运动极为相似（Diz-Munoz等人，2016）。这种相似性值得注意和引用。

增加了对Diz-Munoz等人工作的参考（第三段“胚胎与胚外区域中胚层迁移模式和细胞形状不同”小节）。

[编者注：如下文所述，在接受之前要求进一步修订。]

在这份修改后的手稿中，作者基本上解决了审稿人的问题和担忧。这份手稿极大地促进了我们对小鼠原肠胚形成期间中胚层迁移的细胞和分子机制的理解，并揭示了胚胎和胚外中胚层移动之间有趣的细胞和分子学机制。尽管手稿已经得到了改进，但在验收之前需要解决一些遗留问题，如下所述：

正如评论员建议的那样，作者分析了成对相邻细胞的运动（第三段“细胞间接触对中胚层内轨迹的影响”小节）。为了弄清楚这个场景和同时迁移的两个子单元的场景之间的区别，可以说“相邻的不相关单元对”吗？此外，作者是否观察到了与子代细胞对中观察到的细胞相连接的任何投影（参见上述小节的第二段）？这在后面的结论句中说明，但应在此处说明。

已对邻近细胞的术语进行了拟议更改（第一段“细胞间接触对中胚层内轨迹的影响”小节）。在双光子视频中，我们确实可以观察到细胞突起之间的接触。一些分析对来自分辨率较低的共焦视频；对于那些我们不能肯定的人。尽管如此，我们可以观察到10/12对的接触点，因此包含了一句话（第三段“细胞间接触对中胚层内轨迹的影响”小节）。

此外，不相关的细胞也可以遵循平行路径的观察结果应包含在讨论的第三段中。

讨论中包含了一句话（第三段）。

请在数字面板上指出发展阶段。

所有数字都这样做了。鉴于它们的异常发育，突变胚胎没有发育阶段；然而，在每个面板中显示的野生型同卵双胞胎的阶段都被记录下来。

“胚外中胚层迁移是Rho GTPases独立的”小节，第三段：“……Rhoa缺失外植体的实时成像”，而“Rhoa突变原肠或胚胎外植体实时成像”。

这个问题已经解决了。