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.2011年3月1日；22(5):593-605.
doi:10.1091/mbc。E09-10-0859。 Epub 2011年1月5日。

RhoA对皮肤发育可有可无，但对角质形成细胞的收缩和定向迁移至关重要

本·杰克逊 1, 卡琳·佩罗利尔, 埃斯本·佩德森, 阿斯特丽德·巴塞, 理查德·卡尔森, 王志鹏, 脚癣Lefen, 亚历山德拉·M·奥切森贝因, 古杜拉·施密特, 克劳斯·阿克托利斯, 阿兰娜·斯坦利, 法比奥·昆达马托, 马库斯·拉德温, 克莱门斯·罗特纳, Jolanda van Hengel公司, 绳索制动总线
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RhoA对皮肤发育可有可无，但对角质形成细胞的收缩和定向迁移至关重要

本·杰克逊等。 分子生物学细胞. .

摘要

RhoA是一种小的鸟苷-5'-三磷酸酶（GTPase），对胞质分裂、应激纤维形成和上皮细胞-细胞接触至关重要。在皮肤中，RhoA的丢失被认为是天疱疮皮肤起泡的基础。为了在体内分析RhoA功能，我们制作了RhoA基因角蛋白细胞限制性缺失的小鼠。尽管cofilin和肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化严重降低，但这些小鼠的皮肤发育正常。然而，原发性RhoA-null角质形成细胞显示出多核细胞的百分比增加，细胞间接触成熟不良。此外，我们观察到，由于RhoA-ROCK（Rho-associated protein kinase，Rho相关蛋白激酶）-MLC磷酸酶-MLC介导的细胞收缩受损，细胞扩散增加，这与Rac1无关。Rho抑制毒素进一步增加了RhoA-null细胞的多核化，但对扩散没有显著影响，这表明RhoB和RhoC与RhoA有部分重叠的功能。RhoA的丢失降低了细胞在体外的定向迁移，这是由迁移速度和定向持久性降低引起的。这些缺陷与细胞收缩减少无关，并且与ROCK无关，因为Y27632对ROCK的抑制增加了对照和RhoA-null角质形成细胞的定向迁移。我们的数据表明，RhoA和收缩在调节细胞扩散中起着至关重要的作用，并且RhoA在角质形成细胞迁移中具有与收缩无关的功能。此外，我们的数据表明，RhoA对皮肤发育是不可或缺的。

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数字

图1：
图1：
RhoA基因角蛋白细胞限制性缺失小鼠的产生。（A） 靶向方案显示了野生型RhoA基因（wt）、靶向构建物（载体）、带floxed neo-TK盒的重组RhoA基因组（用neo；白盒floxed）、floxed RhoA转基因（floxed基因）以及在纯合重组靶向构建体并去除floxed外显子3后的敲除等位基因（ko）。相应的等位基因通过以下方式区分后面的III消化和使用外部5′探针的Southern blot杂交，从而检测到指示的片段大小（方案右侧显示了Southern-blot杂交的示例）。（B） RhoA基因（ko）角质形成细胞限制性缺失的小鼠无明显表型。（C） Western blot分析显示，与对照组相比，RhoA缺陷小鼠（ko）表皮中RhoA的有效丢失，但RhoB蛋白的代偿性增加（con；n=3；*p<0.05）。（D） 5月龄RhoA fl/fl K5 Cre（ko）和对照（con）小鼠背部皮肤的苏木精和伊红染色石蜡切片显示皮肤结构正常。
图2：
图2：
RhoA-null表皮的正常分化和细胞-细胞连接。分析5月龄小鼠背部皮肤冷冻切片中是否存在角蛋白14（a，a′）、角蛋白10（b，b′）、氯化蛋白（c，c′）、角蛋白6（d，d′）、E-钙粘蛋白（E，E′）、结蛋白（f，f′）和ZO-1（g，g′）。α6整合素的反染色表示DEJ（a-d，a′-d′）。细胞核由DAPI可视化。（巴=50μm）
图3：
图3：
RhoA-null表皮的正常超微结构。透射电镜检查2月龄小鼠对照组（a-d）和RhoA缺乏组（a′-d′，d〃）表皮的超微结构。（a，a′）在低倍镜下，在对照组（a）中，在没有Rho a（a′）的情况下，表皮（e）可识别为与下层真皮（星号）很好区分的层。比例尺=2μm。（b，b′）在对照组（b）和RhoA-缺乏组（b′）表皮中，这些图像描绘了角质形成细胞（k）紧密地贴附于结构基底膜（黑色箭头），并通过半桥粒（箭头）与其相连。比例尺=500 nm。（c，c′）DEJ放大倍率更高。对照组（c）和RhoA缺乏组（c′）表皮基底膜（黑箭头）和半桥粒（箭头）结构正常。黑色/白色箭头=桥粒。比例尺=500 nm。（d，d′，d〃）正常结构的桥粒（黑色/白色箭头）在对照组（d）和RhoA缺乏组（d′，d〃）表皮中可见。比例尺=500 nm。
图4：
图4：
RhoA-null表皮中MLC和cofilin的磷酸化降低。通过Western blot检测RhoA-null和对照表皮的（A）MLC和pMLC以及（B）cofilin和p-cofilin.（n=3，*p<0.05）。
图5：
图5：
在没有RhoA的情况下，体外成熟细胞-细胞接触形成缺陷。通过与高钙生长介质孵育12小时，在融合单层中诱导成熟细胞-细胞接触的形成。用免疫荧光法对细胞进行ZO-1、闭塞素和F-actin染色（闭塞素和F-actin是双重染色）。所示为共聚焦图片（A）和通过共聚焦图片的z堆叠的ZO-1切片（B）。Western blot分析显示培养的RhoA-null角质形成细胞中的闭塞蛋白数量减少，ZO-1水平不变（C；n=6/6；p<0.05）。（C） 体外诱导RhoA基因敲除和高钙处理后ZO-1的免疫荧光。
图6：
图6：
RhoA缺乏时多核细胞数量增加。（A） 原代角质形成细胞体外培养并固定，细胞核用DAPI染色。RhoA-null角质形成细胞（ko；n=11）与对照细胞（con；n=13）相比，多核细胞（箭头）数量增加。转染部分挽救的EGFP-RhoA融合蛋白（ko+EGFP-RhoA；n=2）和高循环突变型RhoA（F30L）完全挽救了表型（ko+RhoA）；n＝3）。体外RhoA敲除诱导复制了多核表型（体外ko；n=2）。（B） 培养的RhoA-null角质形成细胞中总RhoB和GTP-结合活性RhoB水平增加（n=3/3）。（C） 用Rho抑制剂C2I-NC3处理3小时后，对照组和ko角质形成细胞中的多核增加，而活化毒素CNF1和CNFY不能挽救表型。
图7：
图7：
在没有RhoA的情况下，会形成应力纤维和局部粘连。将RhoA-null（ko）和对照（con）角质形成细胞接种在玻璃上，并对丝状肌动蛋白（a，a′，c，c′）和paxillin（b，b′，c和c′）进行染色。
图8：
图8：
RhoA和ROCK介导的收缩抵消了Rac1存在和不存在时的扩散。测量原发性RhoA-null（ko）和对照（con）角质形成细胞的面积（A）在没有抑制剂的情况下，（B）在存在Rho抑制剂C2I-NC3（活化毒素CNFY和CNF1）的情况下以及（C）在存在ROCK抑制剂Y27632和MLCP抑制剂calyculin的情况下。用EGFP-RhoA融合（ko+EGFP-RhoA）或高循环突变型RhoA（F30L）转染RhoA-null角质形成细胞可挽救增加的传播表型（ko+RhoA[F30L]），而RhoA敲除诱导在体外再生缺陷（ko在体外）。（D） 培养的RhoA-null角质形成细胞中GTP-结合活性Rac1水平降低（n=3/3；p<0.05）。（E） 经Y27632处理的扩散缺陷Rac1-null角质形成细胞能够扩散。
图9：
图9：
RhoA调节体外定向角质形成细胞迁移。在存在或不存在25μM Y27632的情况下，对汇合单层进行体外划痕分析，如材料和方法，表明RhoA-null角质形成细胞定向迁移受损。（A） 所示为间隙闭合的代表性图片和间隙闭合随时间的动力学（n=3）。（B） 通过追踪单个迁移细胞并计算迁移速度和迁移曲折度（n>100）来分析间隙闭合实验的电影。（C） 培养的RhoA-null角质形成细胞中GTP-结合活性Cdc42水平降低（n=3/3）。
图10：
图10：
RhoA对体内皮肤伤口闭合并不重要。通过对照（con）和RhoA fl/fl K5 Cre（ko）小鼠背部皮肤的全厚伤口分析体内伤口闭合情况。苏木精和伊红染色用于确定平分伤口的伤口边界（箭头所示）。受伤三天后，对照小鼠和突变小鼠的伤口直径没有显著差异（六处伤口，三只小鼠）。插图显示了伤口边缘的放大效果。（B） 新分离的RhoA-null角质形成细胞中GTP-结合活性Rac1和Cdc42的正常水平（n=3/3）。
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