Expression of podocalyxin separates the hematopoietic and vascular potentials of mouse embryonic stem cell-derived mesoderm

doi:10.1002/stem.1536

.2014年1月；32(1):191-203.

doi:10.1002/stem.1536。

podocalyxin的表达分离小鼠胚胎干细胞源中胚层的造血和血管潜能

张海兰¹, 约翰·尼维斯, 斯图亚特·弗雷泽, 琼·伊塞恩, 杜瓦拉斯泛神经炎, 德米特里·帕帕琴科, Sunita L D’Souza公司, 伊霍尔·勒米什卡, 迈克尔·A·戴尔, 玛格丽特·H·拜伦

附属公司

PMID： 24022884
预防性维修识别码：项目经理3908821
DOI（操作界面）： 2002年10月10日/第153条

鬼臼毒素的表达分离小鼠胚胎干细胞来源的中胚层的造血和血管潜能

张海兰等。干细胞. 2014年1月.

.2014年1月；32(1):191-203.

doi:10.1002/stem.1536。

作者

张海兰¹, 乔纳森·尼维斯, 斯图亚特·弗雷泽, 琼·伊塞恩, 杜瓦拉斯泛神经炎, 德米特里·帕帕琴科, Sunita L D’Souza公司, 伊霍尔·勒米什卡, 迈克尔·A·戴尔, 玛格丽特·H·拜伦

附属

¹美国纽约州纽约市西奈山医学院医学系；美国纽约州纽约市西奈山医学院Tisch癌症研究所。

PMID： 24022884
预防性维修识别码：项目经理3908821
DOI（操作界面）： 10.1002/第1536项

摘要

在小鼠胚胎和正在分化的胚胎干细胞中，造血细胞、内皮细胞和心肌细胞系来源于Flk1+中胚层祖细胞。在这里，我们报告称，作为唾液幻觉CD34家族成员的Podocalyxin（Podxl）的表面表达可用于将4.75天分化胚状体的Flk1+细胞细分为发育为不同中胚层谱系的群体。最终造血潜能仅限于Flk1+Podxl+人群，而Flk1-阴性Podxl+人群仅显示原始红系潜能。Flk1+Podxl阴性人群包含内皮细胞和心肌细胞潜能。Podxl表达可区分7.5、8.5和9.5天小鼠胚胎中的Flk1+中胚层群体，是祖细胞期原始红细胞的标记。这些发现确定Podxl是分离不同中胚层谱系的有用工具。

关键词：内皮细胞；Flk1；消化；造血；中胚层诱导；小鼠胚胎干细胞；多能干细胞；鬼臼毒素；血管发育。

©AlphaMed出版社。

PubMed免责声明

利益冲突声明

潜在利益冲突的披露：作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。Podxl在EB分化过程中分离Flk1+中胚层种群的表达**
E14 ES细胞被诱导分化为EB，并在指定日期收获。为了分类，EB分散到单个细胞中，并用抗Flk1和抗Podxl抗体染色。（A）流式细胞术分析显示基于Podxl表达的Flk1+分化ES细胞的细分。方框突出显示在d4.75时Flk1 SP和DP种群的明显分离。（B）重新聚集和培养后分类人群的代表性流式细胞术分析。在指定时间采集分化EB，分离并进行抗体染色和FACS。对分类群体（DN、Flk1-SP、Podxl1-SP和DP）进行重新聚集和培养20小时，然后使用流式细胞仪进行分析。在再培养过程中形成的新细胞群被装箱。d3.5 DP群体太小，无法进行分析，因此未在本图中显示。该实验重复了三次，结果具有可比性。

**图2。分类细胞群的中胚层特征**
分离EB，用Flk1和Podxl抗体染色，并对FACS进行分类，以分离四个群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）中的每一个。分离总RNA，并用QRT-PCR分析标记基因的表达。每个基因的表达被标准化为*Gapdh公司*ESC，未分化ES细胞；未分类，未分类d4.75 EB。（A）分类后的细胞群体没有表达多能性标记*Sox2系统*和纳克（B）新生中胚层标记的差异表达T型和肠系膜标志物*混合物1*和*Gsc公司*.（C）中胚层标记的差异表达*Flk1，扭转*（侧板中胚层），*Tbx6型*和*Pdgfra公司*（近轴中胚层），*福克斯2*（轴性中胚层），以及*Gata4型*（心脏前中胚层）。所有QRT-PCR检测至少进行了三次；每个标记都显示了一个具有代表性的结果。

**图3。Podxl-SP人群具有原始红细胞生成潜能**
（A）进行EryP-CFC分析以评估d4.75 EB人群的原始红细胞生成潜能。将分选的细胞（20000）接种在提供有EPO的甲基纤维素中，并在4d后对EryP集落进行评分。原始红细胞电位主要存在于Podxl-SP人群中。使用非配对双尾Student t检验（***p<0.001）分析3个独立实验的数据。（B）对d4.75 EB人群中胚胎（βh1和εY）和成人（β1或βmaj）β样珠蛋白基因表达的QRT-PCR分析。每个基因的表达被标准化为*Gapdh公司*.

**图4。DP人群具有明确的造血潜能**
（A）多系祖细胞分析评估分类d4.75 EB细胞群的造血潜能。将细胞（10000）接种在含有细胞因子的甲基纤维素中。第5天对EryD菌落进行评分，第10天对其他菌落进行得分。使用非配对双尾Student t检验分析了3个独立实验的数据。DP群体产生的最终造血集落数量显著高于其他任何群体（*p<0.0001；**p<0.05）。EryD，明确的红细胞；巨核细胞；Mac，巨噬细胞；E/Mac，混合红细胞/巨噬细胞；和E/Mega，混合红细胞/巨核细胞集落。（B）造血和内皮转录因子编码基因表达的QRT-PCR分析。从分类的d4.75 EB群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）中分离出总RNA，并使用QRT-PCR进行分析。每个基因的表达被标准化为*Gapdh公司*该实验进行了三次，结果具有可比性。ESC，未分化ES细胞；未分类，未分类d4.75 EB。（C）通过流式细胞术分析分选的d4.75 EB人群的C-Kit和CD41表达。这个实验重复了三次，结果相当。（D）在IV型胶原上再培养3d后，d4.75 EB群体上Flk1和CD41的代表性流式细胞术分析。该实验进行了4次，结果具有可比性。将由DP和Flk1-SP群体形成的CD41+细胞装箱。

**图5。Flk1-SP和DP人群显示内皮潜能**
（A）分选的d4.75细胞群（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）在IV型胶原上培养3d，并用流式细胞术分析内皮标记物CD31（Pecam1）的表达。该实验进行了4次，结果具有可比性。（B）果胶的代表性免疫染色1。将分选好的d4.75细胞群（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）在VEGF（5 ng/ml）存在下在IV型胶原上重新培养3d，然后用抗Pecam1（初级）抗体和Alexa Fluor 568山羊抗鼠二级抗体染色。比例尺，50微米。（C）代表性DiI-Ac-LDL摄取分析。分选的d4.75细胞群（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）在VEGF存在下在IV型胶原上重新培养3d，然后与DiI-Ac-LDL（10 mg/ml）孵育4小时。比例尺，50微米。（D） Matrigel上毛细结构的形成。将分选好的d4.75群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）培养在Matrigel上，并加入VEGF和bFGF。培养后6小时采集图像。（B）和（C）中的分析进行了3次，结果具有可比性。重复两次（D）中所示的分析，结果具有可比性。C166是一种用作阳性对照的小鼠内皮细胞系。

**图6。Flk1-SP人群包含心脏电位**
在StemPro-34无血清培养基中重新聚集分类的d4.75群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）24小时，然后在VEGF和bFGF存在下重新培养聚集物4天。对聚集体形成的总菌落和收缩菌落进行评分。（A）心脏中胚层标志物表达的QRT-PCR分析。从分类的d4.75 EB群体（DN、Flk1-SP、Podxl-SP和DP）中分离出总RNA，并使用QRT-PCR进行分析。每个基因的表达被标准化为*Gapdh公司*该实验进行了两次，结果具有可比性。ESC，未分化ES细胞；未分类，未分类d4.75 EB。（B）两个独立实验的结果显示为跳动菌落数/总菌落数。（C）使用大鼠抗鼠cTnT（初级）和Alexa Fluor 488山羊抗鼠（次级）抗体对Flk1-SP细胞聚集体形成的集落进行免疫染色。（比例尺，100微米）

**图7。Podxl标记小鼠胚胎中的原始红细胞群**
转基因*血红蛋白*：：将H2B-GFP胚胎（E7.5、8.5和9.5）分离为单个细胞进行流式细胞术分析。（A） Podxl和Flk1在E7.5-E9.5小鼠胚胎中的表达。正如分化ES细胞所观察到的那样（图1），发育中的小鼠胚胎在每个阶段都包含Flk1-SP、Podxl-SP和DP群体。（B） Flk1在E7.5时在EryP/GFP+细胞的显著亚群表面表达，但在E8.5和E9.5时，在绝大多数EryP中不表达。相反，当几乎所有EryP都是Podxl+时，GFP+EryP上Podxl的表达从E7.5显著增加到E8.5。（C）造血标志物CD41的表达在每个发育阶段都与GFP荧光密切相关，表明大多数EryP表达CD41。Podxl+CD41+种群被装箱。底部的直方图显示了CD41表达从E7.5到E9.5的变化。面板A-C中显示的实验重复了两次，结果相当。

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