跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2011年4月15日；22(8):1274-89.
doi:10.1091/mbc。E10-08-0699。 Epub 2011年2月23日。

波形蛋白组织调节跛足的形成

布莱恩·特·赫尔芬德 1, 梅丽莎·门德斯, S N Prasanna Murthy公司, 戴尔·K·舒马克, 鲍里斯·格林, 萨莱穆拉·马哈马德, 尤利·阿埃比, 塔贾娜·韦迪格, 易一物, 克劳斯·M·哈恩, 稻垣正树, 哈拉尔德·赫尔曼, 罗伯特·D·戈德曼
附属公司

波形蛋白组织调节跛足的形成

布莱恩·特·赫尔芬德等。 分子生物学细胞. .

摘要

波形蛋白中间丝（VIF）延伸至迁移成纤维细胞的后部和核周区域，但只有非丝状波形蛋白颗粒存在于跛足区域。相反，VIF网络延伸至血清缺乏或非运动成纤维细胞的整个细胞外围。在血清中加入或激活Rac1后，VIF在Ser-38（p21活化的激酶磷酸化位点）被迅速磷酸化。波形蛋白的磷酸化与VIF在形成跛足足的细胞表面的分解和从细胞表面的回缩相一致。此外，光活化Rac1的局部诱导或波形蛋白模拟肽（2B2）的微量注射在随后形成跛足的位置分解VIF。当波形蛋白组织被显性负性突变体或沉默破坏时，极性就会丧失，如环绕整个细胞的跛足足形成以及细胞运动性降低所证明的。这些发现表明VIF与跛足形成之间存在拮抗关系。

PubMed免责声明

数字

图1：
图1：
（A–C）运动3T3细胞中的波形蛋白，具有典型的前肢足和尾端区域。长VIF在尾部、核周区域丰富，似乎终止于板层的近端区域（C，a）。薄片（C，b）的近端部分有短细丝（波形），薄片中有明显的颗粒。跛足富含波形蛋白颗粒（C，C；A，相位对比；B，C，使用抗波形蛋白的免疫荧光。C是B的更高放大倍数）。（D–F）缺乏血清的3T3细胞主要具有僵硬的边缘，没有跛足（D）。VIF延伸至细胞边缘（D，相位对比；E，抗波形蛋白免疫荧光；F是E框中区域的放大倍数较高；细胞边缘用黄色标记）。（G–I）在将血清添加到缺乏血清的3T3细胞后的几分钟内，膜皱褶/跛足区域变得明显（G）。30分钟后，免疫荧光显示，不同形式的波形蛋白在板层/板层和尾部区域的分布与血清中维持的成纤维细胞中的分布没有区别（G，相位对比；H，抗波形蛋白；I，H中盒状区域的高倍放大；细胞边缘用黄色描记）。棒材=10μm。
图2：
图2：
活细胞和缺血清细胞内的波形蛋白组织。（A–C）在表达翡翠-黄素的活mEF中观察到板层/板层。请注意，在板层的近端区域，有一些锯齿状的颗粒存在于板层中。蓝爪藻内粒子的荧光是光敏的，并且会迅速消退（A，相位对比；B，翡翠-黄质素；C，放大倍率较高的B）。（D–O）表达翡翠-维生素的mEF边缘区域的时间序列，该区域已被血清饥饿72小时。顶行显示在（D）之前和添加血清之后的指定时间间隔（E–I）。随着膜皱褶的形成和波形的出现，VIF向核周区域收缩，一些颗粒变得可见（J–O，相位对比中的相同图像）。所示时间以分钟为单位。棒材=10μm。
图3：
图3：
添加血清后，波形蛋白-Ser磷酸化增加。（A） 免疫印迹显示，加入血清后1分钟内，波形蛋白Ser-38的磷酸化显著增加，持续时间长达60分钟。波形蛋白和肌动蛋白用作负荷控制，pSer-38印迹暴露的时间足以显示0分钟的信号。（B）血清激活后血清耗竭后波形蛋白-Ser-38磷酸化的时间进程。细胞被血清饥饿72小时（车道标记为−S）；添加血清30分钟（+S），然后将细胞替换到无血清培养基中，并在指定时间（5–240分钟）制备细胞裂解物。（C） 血清饥饿后（72 h）或血清刺激后10 min和60 min，颗粒和上清液组分之间的波形蛋白分布没有差异。（D–F）带有抗波形蛋白（D）和抗波形素pSer-38（E）的双标记免疫荧光显示，该残基在缺乏血清的3T3细胞中磷酸化程度最低（72小时；F，重叠）。（G–I）添加血清10分钟后，在3T3细胞中用抗波形蛋白pSer-38染色。请注意，整个VIF网络都被这种磷酸特异性抗体染色（G，抗波形蛋白；H，抗波状蛋白pSer-38；I，覆盖；10分钟）。（J–L）（G）中方框表示的区域的更高放大率表明，pSer-38也存在于形成椭圆台的区域的粒子和歪歪扭扭中。棒材=10μm。
图4：
图4：
PA-Rac1激活诱导波形蛋白重组。（A–D）双标记免疫荧光显示，VIF网络延伸至稳定表达PA-Rac1（A，波形蛋白；B，A中星号附近区域放大倍数较高）的无血清（72 h）mEF中的细胞外围。如抗Arp2/3（C，Arp2/3；D，覆盖）染色所示，这些细胞没有跛足。（E–H）全细胞照射后10分钟内，VIF从细胞边缘消失（E，抗波形蛋白；F，E中星号附近区域的放大倍数较高）。这种回缩与Arp2/3染色显示的环绕整个细胞的跛足形成一致（G，Arp2/3；H，重叠）。波形蛋白颗粒明显存在于板层和板层（E，F）中。细胞被固定在甲醛中，以保持板足动物体内富含肌动蛋白的结构，而不是甲醇，因为甲醇是波形蛋白的最佳固定剂（参见材料和方法). 棒材（D，H）=10μm。（一） Rac1在表达翡翠色素和PA-Rac1的血清缺乏（72小时）3T3细胞区域的局部激活。该区域包含相对较少的VIF，其朝向细胞表面。在单次脉冲辐照（红色圆圈）后的几分钟内，局部膜皱褶开始（I，照射后以指定的时间间隔进行相位对比和翡翠-维生素a覆盖）。随着跛足的形成，VIF网络似乎被分解并从细胞表面缩回（参见补充视频S2）。（J） 血清饥饿（72小时）的3T3细胞稳定表达PA-Rac1，并瞬时表达翡翠色素。VIF的厚束明显平行于细胞边缘。在仅照射该区域后，这些束似乎会从细胞表面展开和收缩。这与波形符号和粒子的形成一致，其中许多快速移动出视野（移动波形符号见星号；另见补充视频S3；顶行，按指定时间间隔拍摄的荧光图像；最下面一行，相同的图像叠加在相位对比上，以显示扩张的跛足区域）。棒材（I，J）=5μm。
图5：
图5：
PA-Rac1的激活诱导波形蛋白-Ser磷酸化。将瞬时表达PA-Rac1的（A–C）mEF的血清饥饿72小时，然后照射整个盖玻片，然后用针对波形蛋白（B）和波形蛋白pSer-38（C）的抗体进行固定和染色。表达PA-Rac1的细胞通过其mCherry标签进行识别（数据未显示；用星号表示的细胞，参见材料和方法). 请注意，VIF已从表达PA-Rac1的mEF（A，B）的外围收缩，并且在Ser-38（C）处磷酸化。相比之下，VIF在不表达PA-Rac1（没有星号的细胞）的相邻细胞中没有重组。免疫印迹显示，对稳定表达PA-Rac1（D，波形蛋白pSer-38）的细胞的无血清培养物进行照射后（72 h），pSer-39显著增加。稳定表达PA-Rac1的（E–P）mEF也进行点照射，然后固定并在指定的时间间隔进行免疫荧光处理。在光活化后立即固定的细胞中，VIF在照射区域内或仅在照射区域附近的Ser-38处磷酸化（见红色圆圈；E，相位对比；F，波形蛋白；G，波形素pSer-38；H，重叠；插图显示照射区域）。在10–20 s内，波形蛋白pSer-38的区域已经从照射点扩散开来（I，相位对比；J，波形素；K，波形肽pSer-38,L，覆盖），到45–60 s，波形酶pSer-38-在整个VIF网络中都很明显（M，相位对比度；N，波形质；O，波形蛋白pSer-38；P，覆盖）。棒材=10μm。
图6：
图6：
模拟2B2肽在体外分解VIF，并在体内诱导褶皱。（A–C）将模拟2B2肽添加到组装1小时的重组人波形蛋白中（A）诱导解聚，解聚在添加（B）后10秒内开始，并迅速进行，以便在5分钟后主要保留ULF-like结构（C）。负染电子显微镜。棒材=100μm。（D–F）为了响应将较高浓度的2B2微量注射到缺乏血清（72小时）的mEF细胞中，VIF经常从整个细胞外围收缩（D，抗波形蛋白免疫荧光；插图，星号表示区域放大倍数较高）。注意在收缩的VIF和细胞表面之间的区域存在波形蛋白颗粒，这显示出广泛的膜褶皱。微量注射后60分钟固定细胞。（E） 在注射低浓度肽并在30–60分钟后固定的细胞中，VIF经常在注射部位附近分解，如Arp2/3染色所示，在注射部位也会形成跛足（E，双标记免疫荧光；vimentin，白色；Arp2/3，洋红；插图，星号附近区域的放大倍数较高）。相比之下，微注射扰乱肽、BSA或缓冲液的对照血清饥饿（72小时）3T3细胞或mEF没有显示其VIF分布的改变，并且没有诱导跛足（注射扰乱肽后活3T3电池中的F、GFP-波形蛋白）。（G-I）偶尔，在注射部位微量注射2B2后，上表面皱褶明显（注射前G，H，活3T3细胞；注射后10分钟）。棒材=10μm。
图7：
图7：
VIF拆卸和膜褶皱的实时成像。（A–B）用2B2肽微量注射一个表达翡翠维生素并保存在2%血清中的活mEF。微注射后，VIF网络解体并从细胞外周退出，这与大多数细胞表面的跛行活动一致（A，翡翠-维生素A和相位对比叠加，之前；B，微注射后10分钟）。（C–J，同一细胞的图像，C–G，活细胞；H–J，固定）带有扩展VIF网络（C，注射前的祖母绿-维生素和相位对比叠加；星号表示注射部位）的活的、缺血清（72小时）3T3细胞中的祖母蓝-维生素。在～30分钟内，VIF网络在微注射部位（E，C中方框所示区域）附近开始解体，VIF解体继续，在注射部位附近形成膜皱褶。这些区域也出现了吱吱声（F、G、波形蛋白；指示时间为显微注射后；D为显微注射60分钟后）。随后对相同的微注射细胞进行固定和染色，证实波形蛋白颗粒也存在于新形成的板层和板状足（H，波形蛋白；I，F-actin；J，相位对比）。所有钢筋=10μm。
图8：
图8：
微注射2B2去血清细胞VIF分解后运动改变的实时成像。（A–H，同一细胞的活相对比图像）。将保存在2%血清中的移动的mEF细胞与2B2相对皱褶区域进行微注射（A，箭头标记微注射部位）。在～10分钟（D，15分钟）内，微注射部位附近出现小的膜突起。随着时间的推移，这个跛足细胞变得更加突出，最终这个细胞开始向新形成的跛足细胞的方向移动（A–H，注意A中细胞上方和B中细胞下方的回缩纤维；参见补充视频S4）。棒材=100μm。
图9：
图9：
板翅目在血清缺乏的波形蛋白mEF中是活跃的。（A–C，血清饥饿[72 h]mEF的三重标记免疫荧光）。缺乏血清的vim中的大多数VIF+/+mEF延伸到细胞边缘（A，波形蛋白）。如Arp2/3染色所示，即使在72小时后，这些细胞中形成了较厚的应力纤维（B，actin），并且仅有～20%的细胞出现了跛足（C，Arp2/3）。（血清饥饿[72 h]vim的D–F三标记免疫荧光−/−mEF）相反，在缺乏血清（D，vimentin；E，F-actin；F，Arp2/3）的情况下，约60%的缺血清波形蛋白缺失的mEF继续形成富含Arp2/3的跛足。棒材=10μm。
图10：
图10：
细胞运动需要一个有组织的波形蛋白网络。表达显性负波形蛋白突变体GFP-vim的成纤维细胞失去其前/后极性（A，vim+/+(1–138)mEF；注意GFP信号指示GFP-vim在圆形细胞中的表达）。这些（1-138）表达细胞表现出连续的圆周褶皱，但不会易位（B，见绿色细胞路径追踪>7小时；另见补充视频S5）。相比之下，不表达显性阴性突变体的mEF细胞保持其细长形状和运动能力（B，白细胞路径追踪）。同样，稳定表达波形蛋白shRNA（C，D）的3T3细胞的运动受到抑制，而稳定表达扰乱序列（E，F）的3T3细胞则相反。棒材=100μm。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Abercrombie M.成纤维细胞运动行为的基础。实验细胞研究1961；8（补充1）：188–198。-公共医学
    1. Acloque H，Adams MS，Fishwick K，Bronner-Fraser M，Nieto MA。上皮-间质转化：改变细胞状态在发育和疾病中的重要性。临床投资杂志。2009;119:1438–1449.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Ando S、Tanabe K、Gonda Y、Sato C、Inagaki M。波形蛋白的结构域和序列特异性磷酸化诱导细丝结构的分解。生物化学。1989;28:2974–2979.-公共医学
    1. Barberis L等人。白细胞迁移受趋化因子介导的PI3Kγ依赖性波形蛋白磷酸化的调节。欧洲免疫学杂志。2009;39:1136–1146.-公共医学
    1. Bhattacharya R、Gonzalez AM、Debiase PJ、Trejo HE、Goldman RD、Flitney FW、Jones JC。β3整合素和plectin向细胞表面募集波形蛋白可调节粘附强度。细胞科学杂志。2009;122:1390–1400.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

MeSH术语