Regulation of the Rac GTPase pathway by the multifunctional Rho GEF Pebble is essential for mesoderm migration in the Drosophila gastrula

doi:10.1242/dev.026203

.2009年3月；136（5）：813-22。

doi:10.1242/dev.026203。 Epub 2009年2月11日。

多功能Rho-GEF卵石对Rac-GTPase通路的调节对果蝇原肠胚中胚层迁移至关重要

安德烈亚斯·范·Impel¹, 萨宾·舒马赫, 玛格丽特·德拉加, 汉斯·马丁·赫兹, 约格·格罗珊斯, H阿诺·朱勒

附属公司

PMID： 19176590
预防性维修识别码：项目经理2685947
DOI（操作界面）： 10.1242/dev.026203

多功能Rho-GEF卵石对Rac-GTPase通路的调节对果蝇原肠胚中胚层迁移至关重要

安德烈亚斯·范·Impel等。开发. 2009年3月.

.2009年3月；136(5):813-22.

doi:10.1242/dev.026203。 Epub 2009年2月11日。

作者

安德烈亚斯·范·Impel¹, 萨宾·舒马赫, 玛格丽特·德拉加, 汉斯·马丁·赫兹, 约格·格罗珊斯, H阿诺·朱勒

附属

¹英国邓迪大学生命科学学院细胞与发育生物学系。

PMID： 19176590
预防性维修识别码：项目经理2685947
DOI（操作界面）： 10.1242/dev.026203

摘要

果蝇鸟嘌呤核苷酸交换因子Pebble（Pbl）对原肠胚形成期间的胞质分裂和细胞迁移至关重要。在分裂细胞中，Pbl促进细胞皮层的Rho1活化，导致可收缩的肌动蛋白环的形成。Pbl在原肠胚形成期间由成纤维细胞生长因子触发的中胚层扩散中的作用尚不清楚，其靶点和亚细胞定位尚不清楚。为了解决这些问题，我们在胚胎中进行了域功能研究。我们发现，在迁移的中胚层细胞中，Pbl定位于细胞核和细胞皮层，并发现除了PH域外，蛋白质的保守C末端尾部对皮层定位至关重要。此外，我们还表明Rac通路在中胚层迁移过程中起着重要作用。遗传和生化相互作用表明，在中胚层迁移过程中，Pbl通过激活Rac依赖性途径发挥作用。此外，获得功能和拯救实验表明，Pbl的C末端尾部对Rho1-Rac-依赖通路的选择性激活具有重要的调节作用。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
**Pbl构造的域组织。**所有构造都是派生的来自编码Pbl-a亚型的cDNA。构造的范围是表明。从N到C末端的结构域是BRCT（BRCA1羧基末端结构域）、NLS（核定位序列）、PEST（富含脯氨酸、谷氨酸酸、丝氨酸和苏氨酸）、DH（Dbl同源性）、PH（Pleckstrin同源性域）和C项（羧基末端尾部）。第页^ΔN项_V531D和Pbl^{DH-PH_V531D型}代表无催化活性的变体。比例bar：100个氨基酸。

**图2。**
**中胚层扩展缺陷的修复潜力*pbl（可编程逻辑）*突变体由Pbl构造。**(A类)Eve在11个节段的背侧表达野生型中胚层细胞簇（箭头）。(B类)在*pbl（可编程逻辑）^三*变种，夏娃星团的数量很大减少（用箭头标记的背部位置）。转基因*无人机：：Pbl^n个*构造以*pbl（可编程逻辑）^三*突变体使用*两倍：：Gal4*. (C类)全长Pbl表达几乎完全挽救*pbl（可编程逻辑）^三*突变胚胎。(天)第页^ΔBRCT表达式。(E类)铅^ΔN项表达；箭头表示表达Eve的中胚层细胞。(F类)第页^{DH-PH（DH-PH）}表达式。(**G公司**)第页^{DH-PH_V531D型}表达式。(**H（H）**)第页^{DH（决断高度）}表达式。(我)第页^ΔC项表达式。(J型)各种构建体抑制的量化：(*pbl（可编程逻辑）^三*纯合子，黑色；Pbl-A，白色；铅^ΔBRCT，黄色；第页^ΔN项，深蓝色；第页^{DH-PH（DH-PH）}，红色；第页^{DH-PH_V531D型}，灰色；第页^{DH（决断高度）},绿色；第页^ΔC项，淡蓝色）。该图描述了展示胚胎的比例*eve-阳性*中的半部分显示了不同的基因型（数值显示在表1）。

**图3。**
**截断的Pbl结构对中胚层的主导作用形态发生。**(**A-R公司**)用抗Twi抗体对胚胎进行染色并被描述为整体底座（A-L）或横截面[M-R；切片取自30%至60%胚胎长度早期阶段8（M，O，Q）和阶段9（N，P，R）]。侧视图和腹视图在早期阶段8显示为整个底座（A、C、E、G、I、K）或晚期8（B、D、F、H、J、L）。Pbl构建体在中胚层使用*twi:：Gal4；Dmef：：镀锌4*。与野生动物相比型（A、B、M、N），Pbl过度表达^ΔN项中的个结果中胚层细胞留在表面的胚胎（C、D、O、P）。Pbl过度表达^ΔBRCT（E、F）或Pbl^{DH（决断高度）}（G、H）不影响中胚层的早期发育。的过度表达第页^{DH-PH（DH-PH）}主要导致中胚层扩张过程中的缺陷（I、J、Q、R）。（K，L）催化失效Pbl^{DH-PH_V531D型}作为对照的突变体。

**图4。**
**Pbl在间期细胞中的细胞皮层定位。**胚胎用抗-HA（A、D、G、J、M中为红色）和抗-Twi（B中为绿色）固定并染色B、 E、H、K、N）、抗Pbl抗体（P、Q中为红色）或DAPI（L中为蓝色）。已合并图像以C、F、I、L、O显示(**A-C公司**)Pbl-HA在中胚层使用*twi:：Gal4，Dmef:：Gal 4*驾驶员。这些图像代表47个光学截面0.16μm间隔（7.5μm）的z投影总计）。类似数据集的3D重建如电影1所示；笔记Pbl-HA在细胞核的强烈定位和细胞突起的染色前缘（A、C）。Pbl-HA在小鼠中胚层细胞中表达*pbl（可编程逻辑）^三*纯合胚胎*两倍：：Gal4*.(**D-F公司**)前缘的细胞突起被染色。累计HA染色可见于分裂细胞中。(**G-I公司**)箭头表示单元格在胞质分裂的不同阶段；注意细胞染色的积累分裂中胚层细胞的皮层。(**J-O公司**)Pbl-HA的高放大倍数染色以突出中胚层分裂沟的定位细胞；箭头表示Pbl-HA在解理沟和中心主轴。(**P（P）**,问)内源性Pbl蛋白染色抗Pbl抗体。单个光学部分用P表示，仅需注意细微之处与抗体染色的皮层联系（箭头）。投影属于*z（z）*-Q中的系列（56个截面超过16μm）表现出显著的Pbl的核定位和细胞皮层的偶发染色（箭头）。(**R（右）**)延时的静态图像（间隔20秒）胚胎发育后期血细胞中Pbl-GFP的序列；请注意，Pbl-GFP动态定位于细胞皮层和富含肌动蛋白的小孢子（参见补充材料中的电影2）。

**图5。**
**Pbl构造的本地化。**表达了标记的Pbl结构中胚层细胞中*twi:：Gal4，Dmef:：Gal 4*.以下抗体染色用于检测标记蛋白：抗Myc（A、B中为红色）、抗HA（C-P为红色）和抗GFP（Q、R为红色）。抗Twi染色（绿色）标记中胚层细胞和合并图像显示在D、F、H、J、L、N、P、R中。(A类,B类)第页^ΔBRCT积聚在细胞核中在细胞皮层也检测到少量（箭头所示）。(C类,天)第页^ΔC项定位于细胞核和皮层蛋白定位很低的细胞质（用箭头标记）。(E类,F类)HA-标签页^ΔN项积累显著位于细胞皮层；请注意，此构造也会干扰胞质分裂（箭头表示多核细胞）。(**G公司**,**H（H）**)HA-标签页^{DH-PH（DH-PH）}以点状的方式出现在皮层（箭头）。(我,J型)的表达和本地化第页^ΔN项_V531D.(**K（K）**,**L（左）**)表达式和Pbl本地化^{DH-PH_V531D型}. (**M（M）**,N个)第页^{DH（决断高度）}定位于细胞质。(**O（运行）**,**P（P）**)第页^C术语定位于细胞皮层。(问,**R（右）**)Pbl的本地化^PH-GFP公司中胚层细胞；注释累积时间细胞皮层（箭头）。

**图6。**
**差异化救援和本地化第页**^Δ**^C术语.**第页^ΔC项在野生型（A-F）胚胎中表达，并用抗HA抗体染色（红色，A-F）双抗体（绿色）和DAPI（蓝色）；合并的图像如所示B、 D、F(**A-F公司**)Pbl的累积^ΔC项在牢房里分裂细胞中的皮层（用A、B中的箭头标记）。（C-F）高倍率第页，共页^ΔC项劈裂沟的定位单元格（箭头）。(**G公司**,**H（H）**)*两倍：：CD2*（红色）和Twi（绿色）英寸野生型（G）和*pbl（可编程逻辑）^三*纯合胚胎；如图所示以前的细胞突起在*pbl（可编程逻辑）^三*突变体（舒马赫等人，2004年）。(我,J型)Pbl的表达^ΔC项在里面*pbl（可编程逻辑）^三*纯合胚胎也表达*twi:：CD2。*（一）单光学切片显示多核细胞（箭头）。（J）*z（z）*-投影（12个截面，0.4μm；总计4.9μm）胚胎如I所示，显示迁移中胚层细胞的前缘；笔记前缘处的细胞突起（J中的箭头）。

**图7。**
**Pbl的串联DH-PH结构域与Rho1和Rac GTPases相互作用。**(A类,B类)Pbl的表达^{DH-PH（DH-PH）}使用眼睛特定的*GMR:：Gal4*驾驶员（A）导致眼睛粗糙表型（B）。(C类)这种表型取决于DH结构域的催化活性，如第页^{DH-PH_V531D型}不会促进粗糙眼表型。(天)表型在*pbl（可编程逻辑）^三*杂合子。(E类)Pbl公司^{DH-PH（DH-PH）}粗视表型是苍蝇中因功能丧失突变而被抑制的杂合子ρ1. (**F-H（飞行高度）**)RhoL主要版本的共同表达（主导有效RhoL^{二十氧化二钒}和显性负RhoL^N25气体)（F，G）或降低*cdc42*（H）对表型。(我)减少这三种基因的剂量*果蝇属*Rac GT酶，*Rac1、Rac2*和材料，抑制眼部缺陷由Pbl引起^{DH-PH（DH-PH）}表达式。(J型)共同表达野生型Rac1导致表型增强；大多数苍蝇死亡成年法老和一些逃跑者孵化出来，但没有长出任何眼睛结构。(**K（K）**)Pbl的表达^ΔN项18°C时导致成人咽部致死；从蛹壳中解剖出来的动物表现出强烈的粗糙眼表型。(**L（左）**)造成的致命性Pbl的表达^ΔN项在一个*Rho1（节奏1）*杂合背景和成年苍蝇表现出强烈的粗糙眼睛表型。

**图8。**
**Pbl的交换活动^{DH（决断高度）}体外试验。**全球环境基金的结果分析绘制为^三H-GDP必然会显示GST-Rho GTPase融合蛋白在25°C下孵育20分钟后Pbl（红色）或Trio（黄色）和未标记GTP的GST-DH融合蛋白。政府间贸易（灰色）用作对照。注意Pbl DH领域对GDP的活动交换Rho1、Rac1和Rac2。

**图9。**
**Rac GTPases的调节对于中胚层的迁移至关重要。**(**A至D**)胚胎腹视图（第8阶段，生殖带延伸）对Twi染色。与野生型（A）不同，胚胎缺乏母体和Rac1和Rac2的合子贡献在中胚层表现出强烈的缺陷迁移；细胞不能横向伸展，形成紧密的聚集体（B）。这些缺陷使人联想到两者丧失后发现的表型Htl配体*FGF8类1*和*FGF8-类似2*（C） ●●●●。类似的，虽然稍弱，但在表达本构活性Rac1、Rac1^第12版，在中胚层中（D）。(**E-H公司**)早期（G）和晚期8（H）胚胎的交叉截面表达Rac1^第12版表现出强烈异常的中胚层扩张与野生型胚胎（E、F、8期早期和晚期，分别）。

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1. Carmena，A.、Gisselbrecht，S.、Harrison，J.、Jimenez，F.和Michelson，A.M.（1998年）。果蝇胚胎中胚层细胞命运渐进测定的组合信号编码。基因发展12，3910-3922。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Costa，M.、Sweeton，D.和Wieschaus，E.（1993年）。果蝇的消化：形态发生运动的细胞机制。纽约州冷泉港：冷泉港实验室出版社。
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[6] Carmena，A.、Gisselbrecht，S.、Harrison，J.、Jimenez，F.和Michelson，A.M.（1998年）。果蝇胚胎中胚层细胞命运渐进测定的组合信号编码。基因发展12，3910-3922。-项目管理咨询公司-公共医学

[7] Costa，M.、Sweeton，D.和Wieschaus，E.（1993年）。果蝇的消化：形态发生运动的细胞机制。纽约州冷泉港：冷泉港实验室出版社。

[8] Costa，M.、Sweeton，D.和Wieschaus，E.（1993年）。果蝇的消化：形态发生运动的细胞机制。纽约州冷泉港：冷泉港实验室出版社。

[9] Costa，M.、Wilson，E.T.和Wieschaus，E.（1994）。折叠原肠胚形成基因编码的假定细胞信号协调果蝇原肠胚发育期间的细胞形状变化。手机76，1075-1089。-公共医学

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