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.2012年11月至12月；91(11-12):923-929.
doi:10.1016/j.ejcb.2012.04.002。 Epub 2012年5月31日。

组织诱导的Lifeact表达可可视化体内外肌动蛋白动力学

汉娜·沙赫特纳 # 1, 李安（Ang Li） # 1, 大卫·史蒂文森 1, 西蒙·D·J·卡拉米纳斯 1, 史蒂夫·托马斯 2, 史蒂夫·普·沃森 2, 迈克尔·西克斯 三, 罗兰·威利奇·索尔德纳 4, Douglas Strathdee公司 1, 劳拉·马切斯基 1
附属公司

组织诱导的Lifeact表达可可视化体内外肌动蛋白动力学

汉娜·沙赫特纳等。 Eur J细胞生物学. 2012年11月至12月.

摘要

我们在此描述了表达Lifeact-GFP（一种报告丝状肌动蛋白动力学的肽）的条件性诱导小鼠模型的开发和表征。我们用这个模型研究了血小板、巨核细胞和成黑素细胞，我们提供了证据证明Lifeact-GFP在体外研究这些细胞类型时是一个有用的报告者。就血小板和巨核细胞而言，这些细胞无法通过传统方法转染，因此有条件激活Lifeact可以研究这些活细胞中的肌动蛋白动力学。我们研究了来自胚胎的天然皮肤外植体中的黑色素母细胞，以便可视化胞质分裂和迁移期间的活性肌动蛋白动力学。我们的研究表明，缺乏小GTPase Rac1的黑色素母细胞在胞质分裂后新伪足形成延迟，这是之前报道的这些细胞胞质分裂延迟的原因。因此，通过使用这种小鼠模型，我们能够深入了解细胞的肌动蛋白动力学，而以前只能使用固定标本或从其自然组织环境中分离出来进行研究。

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数字

图1
图1。表达Lifeact-GFP的小鼠巨核细胞、血小板和黑素细胞
（A） 条件性Lifeact-GFP小鼠的遗传背景。条件EGFP-Lifeact表达的构建被恢复为高功率放射治疗轨迹。使用CAG lox-stop-lox转基因调节Lifeact-GFP的表达。pA：poly A尾巴，粉红色盒子：人类高功率放射治疗启动子和外显子1高功率放射治疗基因，蓝盒：高功率放射治疗基因。（B） Pf4Cre Lifeact-GFP Mk，Mk在基底膜上实时扩散1小时，每分钟拍摄一次图像。插图中突出显示了足细胞。（C） 在添加1U/ml凝血酶之前，Pf4Core Lifeact-GFP血小板在纤维蛋白原上扩散7分钟的实时TIRF电影，每5秒拍摄一次图像。（D） TyrCre Lifeact-GFP黑素细胞在纤维连接蛋白涂层覆盖玻璃上迁移的F-actin动力学的活细胞成像。每5分钟拍摄一次图像。比例尺代表10μm。
图2
图2。皮肤外植体中黑色素细胞的特异性TyrCre Lifeact-GFP信号
（A） 上图：皮肤外植体中的TyrCre Z/EG和TyrCr Lifeact-GFP成黑素细胞图像。细胞突起中可见Lifeact-GFP表达；黄色箭头指向F-actin闪光的示例。底部：Lifeact GFP信号的密度分析，箭头位于峰值Lifeact GFP强度。（B） 皮肤外植体中单个黑色素细胞迁移的2小时轨迹。（C） 从3个外植体的每个外植体中提取20个细胞，绘制出2小时以上的相对迁移速度和持续时间。误差条表示平均值±SEM。比例尺表示10μm。
图3
图3。接受胞质分裂的TyrCre Lifeact-GFP对照和TyrCre Lifeact-GFP Rac1 f/f皮肤外植体的黑色素细胞
（A） TyrCre Lifeact-GFP对照组中黑色素细胞活细胞成像的代表性静态图像，TyrCr Lifect-GFP Rac1 f/f皮肤外植体进行胞质分裂，时间间隔如图所示。红色方框表示犁沟的开始，黄色方框表示子细胞形成的第一个突起，如黄色箭头所示。（B） 量化母细胞成圆和沟形成、沟形成和突起形成以及突起形成到分离两个子细胞之间的持续时间。误差条表示至少15个分区的平均值±SEM。**，P<0.01。比例尺代表10μm。
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