亚历山大病的组织和细胞刚性和机械敏感性信号激活

层粘连蛋白和YAP的上调

在我们的基因筛选中，涉及感知和转导机械信号的多种途径的恢复增加了亚历山大病机械转导稳态紊乱的可能性。为了更详细地研究这种可能性，我们首先检测了层粘连蛋白，层粘连蛋白质的表达随着组织硬度的增加而增加，并在机械传递中发挥关键作用^1,24使用双标记免疫荧光技术，我们发现亚历山大病患者的星形胶质细胞中有很强的层粘连蛋白A表达，而年龄匹配的对照组中层粘连蛋白质A表达很少（图2a个). Western blot分析证实，与年龄匹配的对照组大脑相比，亚历山大病患者大脑中层粘连蛋白A的表达增加（图2亿和补充图⁷). 与患者组织数据一致，我们在亚历山大病敲除小鼠模型中观察到类似的变化¹¹与年龄匹配的对照小鼠相比，3个月大的亚历山大病模型小鼠的星形胶质细胞中Lamin A的表达显著增加（图2c、d). 相反，我们发现少突胶质细胞或神经元的层粘连A没有明显差异（补充图^2a-b、d-e). Iba1标记的小胶质细胞中没有检测到层粘连蛋白A的表达（补充图^2c、f). 层蛋白从果蝇属哺乳动物。Lamin C（LamC）是唯一果蝇属A型层粘连蛋白同源物²⁵我们发现，与年龄匹配的对照果蝇相比，20天龄亚历山大病模型果蝇的胶质细胞中LamC表达显著增加（图2e、f和补充图⁷)，但在1日龄苍蝇中没有（补充图^2克).

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图2

亚历山大病A型层粘连蛋白表达增加。一双标记免疫荧光显示，与年龄匹配的对照组（Ctrl）相比，1岁亚历山大病患者（AxD，箭头）星形胶质细胞中的A型层粘连蛋白、层粘连A/C（LA/C）表达增加。GFAP标记星形胶质细胞。比例尺为5微米。b蛋白质印迹证实，与年龄匹配的对照组相比，亚历山大病患者白质中的层粘连蛋白a表达显著增加。重制GAPDH的印迹，以说明等效蛋白质负荷。第页 = 0.0476，Mann–Whitney试验。c（c）双标记免疫荧光显示3个月大亚历山大病模型小鼠星形胶质细胞层粘连蛋白A/C（LA/C）表达增加(GFAP公司^R236小时/+，箭头）与年龄匹配的野生型同卵双胞胎对照（野生型）进行比较。GFAP标记星形胶质细胞。比例尺为10微米。d日免疫荧光强度定量显示3个月大的亚历山大病模型小鼠的层粘连蛋白A/C表达显著增加(GFAP公司^R236小时/+)与年龄匹配的野生型小鼠（WT）相比。N个 = 每个基因型3只动物。每个动物总共使用30个星形胶质细胞进行定量。第页 = 0.0126，Wilcoxon试验。e（电子）双标记免疫荧光显示LamC表达增加果蝇属亚历山大病模型苍蝇（GFAP）胶质细胞中A型层粘连蛋白的同源物^R79小时，箭头）与年龄匹配的控件苍蝇（Ctrl，箭头）相比。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。（f）Western blot显示，与年龄匹配的对照组相比，亚历山大病模型苍蝇中LamC的表达增加。重复印迹肌动蛋白，以说明等效的蛋白质负载。N个 = 8,第页 = 0.0002，Mann–Whitney试验。克使用两个功能丧失等位基因降低LamC的表达LamC公司在亚历山大病模型中，苍蝇显著降低了TUNEL分析测得的细胞死亡。N个 = 每个基因型6个*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，Kruskal–Wallis检验。小时使用功能丧失等位基因减少LamC的表达LamC公司在亚历山大病模型中，苍蝇显著减少了发生癫痫的苍蝇数量。N个 > 每个基因型100个。第页 < 0.001.χ²-测试。我使用功能丧失等位基因减少LamC的表达LamC公司在亚历山大病模型中，苍蝇拯救了非细胞自主神经细胞死亡。N个 = 每个基因型6个。第页 = 0.0152，Mann-Whitney试验。苍蝇20天大e（电子）–克,我出生1天小时

接下来，我们利用遗传学研究了LamC表达升高是否在GFAP毒性中起到致病作用。使用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）dUTP镍端标记（TUNEL）分析亚历山大病模型苍蝇的细胞死亡，我们发现使用功能丧失等位基因降低LamC表达LamC公司显著减少TUNEL阳性细胞的数量（图2克). 蛋白质印迹证实这些细胞中的LamC蛋白水平降低LamC公司突变体，GFAP无变化^R79小时水平（补充图^{2小时，我}). 此外，减少LamC的表达也显著降低了亚历山大病模型苍蝇中癫痫发作苍蝇的百分比（图2小时)，证实了LamC表达在GFAP中的重要生物学作用^R79小时毒性。非细胞自主神经元丢失是亚历山大病的一个普遍特征，在我们的苍蝇模型中进行了概述^7,21使用TUNEL和神经元标记物Elav的荧光双标记，我们发现减少LamC表达可以减少胶质细胞和神经元细胞的死亡，更显著地挽救神经元的丢失（图第2页和补充图^第2节)表明LamC表达增加会触发神经退行性变。为了直接验证这个假设，我们使用回购-GAL4并发现10天大时胶质细胞和神经元均显著死亡（补充图^{2公里–米}).

yes-associated protein（YAP）是一个核心核机械传感器，是河马信号传递的下游靶点（图1c个，补充表¹)这也与机械传导密切相关^26,27因此，我们评估了亚历山大病的YAP。通过双重标记免疫荧光，我们在亚历山大病患者组织的星形胶质细胞细胞核中观察到了强大的YAP表达，但在年龄匹配的对照组中没有（图3a年). Western blot分析证实了亚历山大病患者YAP的上调（图3亿和补充图⁷). 免疫染色和western blot分析证明，在亚历山大病模型小鼠的星形胶质细胞中，YAP表达也持续增加（图3c、d和补充图⁷). 约基（Yki），是果蝇属哺乳动物YAP同源物²⁸在脊椎动物模型中，我们发现20天龄亚历山大病模型苍蝇的神经胶质细胞核中Yki水平增加，但在年龄匹配的对照苍蝇中没有（图第三版，箭头）。20日龄亚历山大病模型果蝇和对照果蝇的神经元中Yki表达水平相似（图第三版，箭头）。Western blot证实20天龄亚历山大病模型果蝇中Yki的表达增加（图第3页和补充图⁷). 在1日龄果蝇中，亚历山大病模型果蝇和对照果蝇的Yki表达没有显著差异（补充图^3a年).

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图3

YAP在亚历山大病中被激活。一,c（c）双标记免疫荧光显示1岁亚历山大病患者（AxD，箭头所示一)和3个月大的亚历山大病模型小鼠(GFAP公司^R236小时/+，箭头在c（c）)，但在年龄匹配的对照组中没有。GFAP标记星形胶质细胞。箭头(c（c）)表明YAP在野生型对照小鼠中的细胞质表达较弱。b,d日Western blot显示亚历山大病患者（AxD，b)和亚历山大病模型小鼠(GFAP公司^R236小时/+,d日)与年龄匹配的对照组相比。第页 = 0.0043 (b)和0.0286(d日)Mann–Whitney测试。e（电子）双标记免疫荧光显示亚历山大病模型苍蝇（GFAP）胶质细胞核中激活的Yki表达^R79小时，箭头），但不在年龄匹配的控件（箭头）中。在亚历山大病模型苍蝇和对照组（黄色箭头）的神经元细胞胞浆中，Yki的表达类似。Repo标记胶质细胞。（f）Western blot显示，与年龄匹配的对照组相比，亚历山大病模型苍蝇中Yki的表达显著增加。N个 = 9第页 = 0.0039，Wilcoxon检验。克β-半乳糖苷酶免疫染色显示前任-lacZ公司，Yki活性报告员，在亚历山大病模型苍蝇（GFAP）的胶质细胞中^R79小时，箭头），但不在年龄匹配控件中。Repo标记胶质细胞。小时–j个β-半乳糖苷酶阳性细胞的定量(小时,i）和GFP阳性细胞(j个)显示携带Yki活动记者的亚历山大病模型苍蝇显著增加前任-lacZ公司(小时)，cycE公司-lacZ公司(我)和第个-GFP公司(j个)与年龄匹配的对照组相比。N个 ≥ 每个基因型6个。第页 = 0.0022(小时), 0.0003 (我)和0.0002(j个)Mann–Whitney测试。k,我过度表达野生型yki公司(k)或减少高功率放大器表达式(我)在两个对照组中，胶质细胞中的LamC蛋白水平增加（Ctrl:回购-加仑4/+)和亚历山大病模型苍蝇（GFAP^R79小时:回购-加仑4,无人机-GFAP公司^R79小时/+). *第页 < 0.05, **第页 < 0.01，Wilcoxon试验(k)和Kruskal–Wallis测试(我).米减少高性能操作通过TUNEL分析，使用转基因RNAi系在亚历山大病模型苍蝇中的表达显著增加了细胞死亡。N个 ≥ 每个基因型6个*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，Kruskal–Wallis检验。苍蝇20天大e（电子）–米.比例尺为5微米英寸一,e（电子）,克和10微米英寸c（c）.斑点被重新处理为GAPDH(b,d日)或肌动蛋白(（f）,k,我)说明等效蛋白质负荷

为了确定Yki表达增加是否导致Yki活性增加，我们使用了三个特征鲜明的Yki活性报告人果蝇属,前任-lacZ公司²⁹,循环E-lacZ公司³⁰、和第个-GFP公司³⁰与年龄匹配的对照苍蝇相比，所有三名记者在亚历山大病模型苍蝇中均显示出显著的上调（图3g–j)表明亚历山大病模型苍蝇的Yki活性增加。因此，多条证据支持在亚历山大病中激活YAP。

为了研究YAP是否通过我们模型中的经典Hippo途径激活，我们首先采用遗传方法，并使用转基因RNAi株降低Yki上游负调控因子Hippo（Hpo）的表达。Western blot证实Hpo击倒苍蝇中Yki表达增加，而GFAP无变化^R79小时水平（补充图^3b、c). 此外，使用双标记免疫荧光技术，我们发现在亚历山大病模型苍蝇中，这些激酶的活性形式磷酸化Hpo和磷酸化-Wts的表达在胶质细胞的胞浆中减少（包装物标记胶质膜，Repo标记胶质细胞的细胞核）（补充图^三d-g，总建筑面积^R79小时，箭头）与年龄匹配的对照苍蝇（补充图^3d克、Ctrl、箭头）。总之，这些数据表明了我们模型中YAP的规范性调节。

为了确定Yki（一种转录辅激活子）是否能够调节LamC的表达，我们在果蝇属使用回购-加仑4司机³¹在对照组和亚历山大病模型苍蝇中，LamC表达随着Yki表达而显著增加（图3公里和补充图⁷). 与这些发现一致，使用转基因RNAi系减少Yki、Hippo（Hpo）上游负调控因子的表达，也会显著增加对照和Alexander病模型苍蝇中LamC的表达（图3升和补充图⁷). 支持Yki在LamC上游的作用，当我们降低对照组和亚历山大病模型苍蝇的LamC表达时，我们没有发现Yki表达的变化（补充图^3小时). 接下来，我们询问河马信号的基因操作是否会改变GFAP^R79小时毒性。我们发现减少GFAP中Hpo的表达^R79小时通过TUNEL分析，转基因果蝇显著增加了细胞死亡（图300万)形态学分析包括神经元和胶质细胞的死亡。

然后我们确定增加野生型GFAP水平是否可以改变机械传导信号通路。使用双标记免疫荧光技术，我们发现人类野生型GFAP转基因小鼠星形胶质细胞中的层粘连蛋白A和YAP的表达显著增加¹²与年龄匹配的同窝对照组相比（补充图⁴a-b）。同样，我们发现Yki和LamC在果蝇属野生型人GFAP在胶质细胞中的表达²¹（补充图⁴c-d）。

细胞骨架机械传导信号改变

为了研究增加的GFAP激活Hippo信号和增加LamC表达的机制，我们研究了细胞骨架机械传感器，特别是肌动蛋白细胞骨架和整合素局部粘附信号（图1b、c). 应力纤维是丝状肌动蛋白（F-actin）束，是细胞中的力发生器，介导机械传递和YAP活化^26,32以前对亚历山大病模型小鼠培养的原代星形胶质细胞的研究表明，应激纤维组织发生了改变¹⁴为了在体内检测肌动蛋白细胞骨架，我们用荧光阴茎倍体蛋白对亚历山大病模型小鼠的脑组织进行染色，以标记F-actin。我们发现，与对照组相比，亚历山大病模型小鼠中可见肌动蛋白束的星形胶质细胞百分比显著增加（图4a类，补充图^5a级和补充数据²). 类似地，通过表达LifeactRFP³³，一种F-actin标记，特别是在使用回购-加仑4司机，我们观察到亚历山大病模型苍蝇与对照苍蝇相比，胶质细胞中的肌动蛋白束显著增加（图4b个).

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图4

突变GFAP诱导的细胞机械传导改变。一3个月大亚历山大病模型小鼠星形胶质细胞中F-actin束形成增加(GFAP公司^R236小时/+，箭头）。磷脂酶染色标记F-actin。GFAP标记星形胶质细胞。DAPI标记细胞核。比例尺为2微米。N个 = 4（野生型）和5(GFAP公司^R236小时/+). 每只动物共有50个星形胶质细胞用于定量。第页 = 0.0159，Mann-Whitney试验。见补充数据²用于三维重建。b突变GFAP转基因果蝇（GFAP）胶质细胞中丰富的肌动蛋白束^R79小时，箭头）标记为LifeactRFP。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。N个 ≥ 每个基因型6只动物。第页 = 0.0012，Mann-Whitney试验。c（c）Western blot显示，与年龄匹配的对照组相比，突变GFAP转基因果蝇中Shot的表达增加。N个 = 6第页 = 0.0313，威尔科森试验。d日基因还原射击亚历山大病模型苍蝇中的表达降低了含有F-actin的胶质细胞的百分比。LifeactRFP标签F-actin。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。N个 ≥ 每个基因型6个*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，Kruskal–Wallis检验。e（电子）免疫荧光显示，在亚历山大病模型苍蝇（GFAP）的胶质细胞中，整合素（箭头）沿着F-actin增加并聚集表达^R79小时，箭头），但不在年龄匹配的控件中。Repo标记胶质细胞。比例尺为5微米。（f）Western印迹显示，与年龄匹配的对照相比，携带整合素连接激酶（Ilk）GFP蛋白陷阱报告基因的亚历山大病模型苍蝇中GFP的表达增加。N个 = 4第页 = 0.0286，Mann-Whitney试验。克–j个增加的转录水平拉纳（层粘连蛋白α亚单位），车道B1（层粘连蛋白β亚单位），车道B2（层粘连蛋白γ亚基）和文丘林(文斯)与年龄匹配的对照果蝇相比，突变GFAP转基因果蝇*第页 < 0.05, **第页 < 0.01，Mann-Whitney试验(克,我)和Wilcoxon试验(小时,j个).k,我双标记免疫荧光和western blot显示3个月大的亚历山大病模型小鼠磷酸化黏着斑激酶（phospho-FAK）表达增加(GFAP公司^R236小时/+)与年龄匹配的野生型窝友对照组相比。GFAP标记星形胶质细胞。顶部两行的比例尺为10微米，插图为2微米(k).N个 = 4,第页 = 0.0221 (我). 苍蝇20天大b–j个.印迹被重新标记为肌动蛋白(c（c）,（f）)或GAPDH(我)说明等效蛋白质负荷

为了探讨亚历山大病中GFAP和肌动蛋白细胞骨架之间的直接联系，我们重点研究了spectraplakin蛋白，这是一个与F-actin和中间丝相互作用的巨型细胞骨架连接蛋白家族³⁴亚历山大病患者的波谱蛋白plectin水平升高，并且plectin共同定位于亚历山大病的特征包涵体，即罗森塔尔纤维¹⁶为了确定GFAP是否通过spectraplakin促进F-actin的稳定，我们利用果蝇属亚历山大病模型。苍蝇具有单光谱拉金正交图，短停（Short stop）³⁴与亚历山大病患者的果胶水平增加类似，我们发现与对照组相比，亚历山大病模型苍蝇的Shot表达增加（图4c类和补充图⁷). 然后，我们使用功能丧失等位基因或转基因RNAi系降低Shot的表达，并观察到肌动蛋白束的数量显著减少（图第4天)证明spectraplakin蛋白Shot控制GFAP中的F-actin水平^R79小时转基因亚历山大病模型苍蝇。Western blotting证实修饰物中Shot表达减少，GFAP水平无变化（补充图^5b、c). 此外，我们发现当我们使用回购-加仑4驱动程序，确认spectraplakin可以控制机械敏感性蛋白质的水平（补充图^5天).

整合素介导的局灶性粘附复合体是从细胞外基质到肌动蛋白细胞骨架的机械力的关键转换器¹转录谱分析表明，在亚历山大病模型小鼠中整合素基因的表达增加¹³类似地，我们观察到其中一个的免疫染色增强果蝇属与对照动物相比，亚历山大病模型苍蝇的神经胶质细胞中的整合素亚基（肌球蛋白）以及整合素与肌动蛋白束的共定位（图第4页). 我们通过检测内源性GFP标记的整合素连接激酶（Ilk）水平，证实了整合素途径在western blotting上的上调³⁵（图第4页和补充图⁷). 除了整合素蛋白外，我们还检测了细胞外基质蛋白（ECM）和细胞内局灶性粘附成分。层粘连蛋白是由胶质分泌的大型异源三聚体蛋白，由α、β和γ亚单位组成³⁶我们发现编码一条α链的基因的转录水平(拉纳)，γ亚单位(车道B1)和γ亚单位(车道B2)与对照苍蝇相比，亚历山大病模型苍蝇的死亡率都显著增加（图4g-i）。类似地，vinculin，一种细胞内整合素连接蛋白¹也在GFAP中转录上调^R79小时转基因果蝇与年龄匹配的对照组相比（图第4节). 此外，使用双标记免疫荧光和免疫印迹技术，我们发现与野生型同窝对照组相比，亚历山大病模型小鼠的星形胶质细胞中磷酸化黏着斑激酶（FAK）蛋白的表达显著增加（图4k，升和补充图⁷).

亚历山大病模型中大脑僵硬度增加

上述数据表明，从跨膜整合素介导的局灶黏附复合体到核效应器YAP和层粘连A/C的机械传导介质发生了变化。为了直接研究亚历山大病脑组织的机械特性，我们进行了一系列工程和细胞生物学实验。首先，我们测量了亚历山大病小鼠模型的脑组织弹性。旋转流变仪是一种经过验证且广泛应用的技术，用于测量多种样品类型（包括软组织）的粘弹性³⁷.我们测量了750的组织弹性 含有亚历山大病模型小鼠和年龄匹配的野生型同窝对照小鼠海马的μm厚脑切片（图5a级). 亚历山大病模型小鼠的组织硬度显著增加（571.7 ± 34.74 Pa）与对照小鼠（446.8 ± 20.95 Pa）（图5亿和补充图^第6页).

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图5

亚历山大病实验模型中大脑僵硬增加。一示意图显示750的弹性测量 使用旋转流变仪对μm厚的小鼠大脑切片进行检测。b亚历山大病模型小鼠的脑组织硬度显著增加(GFAP公司^R236小时/+)与年龄匹配的野生型窝友对照组相比。老鼠4个月大。N个 = 每个基因型4个。第页 = 0.0286，Mann-Whitney试验。c（c）示意图显示了体外3D-胶原蛋白基质培养果蝇属大脑。已解剖果蝇属大脑分别在单独培养基或3D-胶原基质中培养40个 25小时 分析前为°C。d日LamC表达随胶原基质浓度（硬度）增加而呈剂量依赖性增加。基因型：回购-加仑4/+（Ctrl）。e（电子）Yki表达随胶原基质浓度（硬度）增加而呈剂量依赖性增加。基因型：回购-加仑4/+（Ctrl）。（f）亚历山大病模型苍蝇脑中LamC的表达在4岁时显著高于对照苍蝇脑 mg/ml胶原蛋白基质。基因型：Ctrl:回购-加仑4/+；GFAP公司^R79小时:回购-加仑4,无人机-GFAP公司^R79小时/+. *第页 < 0.01.克4岁时培养的亚历山大病模型苍蝇脑中Yki表达的增加显著高于对照苍蝇脑 mg/ml胶原蛋白基质。基因型：Ctrl:回购-加仑4/+; GFAP公司^R79小时:回购-加仑4,无人机-GFAP公司^R79小时/+. *第页 < 0.01. 所有面板中的苍蝇都是1-3天大的

接下来，我们对苍蝇大脑进行了体外三维（3D）胶原基质培养³⁸.当我们培养果蝇属大脑中胶原蛋白基质的浓度不断增加，刚度已确定（56 2 Pa mg/ml胶原蛋白；268 4 Pa mg/ml胶原蛋白和1079 6 Pa 用流变仪测量的胶原蛋白mg/ml）（图5厘米)，我们发现LamC和Yki的表达呈剂量依赖性上调（图5d，e和补充图⁷). 利用透射电子显微镜，我们发现成熟的胶原纤维附着在神经板层，即细胞外基质富含胶原蛋白的层³⁹围绕果蝇属大脑，在我们的三维胶原培养条件下，如两幅有代表性的图像所示（补充图^6b、c). 因此，在我们的实验中，大脑被合理地直接固定在培养基上。这些发现表明果蝇属大脑可能会对机械刺激作出反应，而LamC和Yki可能会对培养基硬度作出反应，尽管还需要更多实验来证实大脑和培养基之间的机械相互作用。接下来，我们询问亚历山大病模型苍蝇大脑对改变的矩阵刚度的反应是否与对照苍蝇大脑不同。为了解决这个问题，我们培养了对照组和GFAP的大脑^R79小时胶原基质僵硬的转基因果蝇（268只 Pa）促进了LamC和Yki的上调。我们发现，在亚历山大病模型苍蝇大脑中，LamC和Yki的表达显著高于对照苍蝇大脑（图5英尺，克和补充图⁷). 这些发现表明GFAP^R79小时胶质细胞的表达使大脑对改变的机械应力敏感，尽管不能排除基质胶原浓度增加的应力依赖效应。

基因组尺度遗传筛选

为了确定在亚历山大病中改变GFAP毒性的途径和分子，我们使用来自布卢明顿的所有可用转基因RNAi株进行了无偏见的正向遗传筛选果蝇属库存中心（5767条线路）和少量来自维也纳的线路果蝇属资源中心（172行）。在5939个品系中，94%的基因与人类同源。将转基因RNAi株系与亚历山大病测试株（基因型：回购-加仑4,无人机-GFAP公司^R79小时,无人机-CD8（CD8）-帕普-维纳斯/TM3公司,某人)其中包含Williams等人开发的转基因半胱天冬酶报告子。²²。通过使用对切割的人类PARP特异的抗体（E51，Abcam）监测报告者的切割来评估毒性。在组织切片上使用免疫组织化学方法评估第一批2061个转基因RNAi株的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解；其余的线用斑点杂交法进行了测试。对所有潜在点击的GFAP水平进行了检查，那些改变GFAP水平的被排除在最终修改列表之外。此外，具有非特异性（GFAP）的增强子^R79小时（独立）毒性也被排除在最终列表和与回购-加仑4（18%的受试品系）未进行进一步调查。

Prize-collecting Steiner森林算法（PCSF）

PCSF算法²³用于识别预测参与亚历山大病发病机制的蛋白质网络。给定有向或无向网络G公司(V（V）,E类,c（c）(e（电子）),第页(v（v）))，其中c（c）(e（电子）)是边缘的成本e（电子） ∈ E类和第页(v（v）)是节点的奖品v（v） ∈ V（V），我们寻求最大化收集的奖品，同时最小化连接奖品所需的边缘成本。更正式地说，PCSF算法旨在找到森林解决方案如果(V（V）_如果,E类_如果)使目标函数最大化：

第一学期是如果，按模型参数缩放β第二个术语是成本函数，其目的是仅包括如果如果目标函数被最小化。最后一个术语允许包含κ通过引入根节点实现树v（v）₀通过权重连接到其他每个节点ω因此，该算法可以识别连接的奖品节点，以及数据强烈隐含的“斯坦纳节点”。

在这项研究中，我们分配了奖金第页(v（v）)根据修改GFAP的幅度对每个修改器进行修改^R79小时毒性。通过DRSC综合正交预测工具（DIOPT）鉴定人类同源物。对抑制或增强毒性读数的修饰物给予相同的正奖励值。边缘的成本c（c）(e（电子）)根据先前人类相互作用数据库中定义的物理蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的置信度进行分配。特别是，我们使用了iRefIndex版本13，该版本根据关于蛋白质相互作用的出版物、用于检测相互作用的实验方法以及相互作用的类型对蛋白质相互作用进行评分⁶⁸.

我们首先运行参数网格搜索，以找到一个网络解决方案，该解决方案包括许多奖励节点，以及少数“中心”节点，或涉及许多交互的经过充分研究的节点。接下来，我们通过向每个边缘成本添加噪声，进行了一组100个随机化实验。这模拟了我们在先前交互网络中的不确定性，这增加了我们的信心，即出现在多个网络中的节点实际上参与了疾病路径。我们最终的PCSF网络解决方案是出现在至少25%随机实验中的一组节点，其边缘由PPI网络定义。我们在KEGG数据库中搜索丰富的路径，并确定PCSF解决方案中属于这些路径的节点。最后，我们可视化了关注路径的整个网络和子网络。

人体样本

来自马里兰州巴尔的摩市马里兰大学NICHD发育障碍大脑和组织库的5名对照组（平均年龄10岁，范围1–27岁；2名女性和3名男性）和6名亚历山大病患者（平均年龄8岁，范围1-27岁；3名女性和三名男性）的冷冻额叶皮层。亚历山大病患者的GFAP突变包括R79C、R239C、R39H（2例）和K63E。所有病例都有亚历山大病的典型神经病理学表现，包括多个罗森塔尔纤维。病例组和对照组的死后间隔具有可比性，<24 h在所有情况下。为了进行免疫染色分析，在石蜡包埋之前，将组织解冻并固定在4%多聚甲醛中过夜。

转基因小鼠

四个月大（图5a、b)和3个月大（图2c、 日期：，​d、 3c、，三c、 日期：，4a、k、l，补充图^二维-f、，^5a级)男性GFAP公司^R236小时/+老鼠¹¹在FVB/N背景下进行研究。性别和年龄相匹配的野生型同窝交配被用作对照。三个月龄GFAP^重量小鼠（Tg73.7）¹²在FVB/N背景下，补充图中使用了年龄匹配的野生型同卵双胞胎^4a、b所有程序均由威斯康星大学麦迪逊分校和布里格姆女子医院研究生院动物护理和使用委员会批准。

诱导多能干细胞

亚历山大病iPS细胞来源于GFAP基因R88C突变患者的成纤维细胞⁴⁰.通过CRISPR/Cas9基因编辑（准备中的J.Jones和S.Zhang）制作校正的对照系。所有细胞在37 °C，大气保持在5%O₂和5%CO₂iPSC保存在E8培养基中的matrigel（Waisman Biomanufacturing）上。细胞在ROCK抑制剂存在下每隔6-7天传代一次，以促进细胞存活。神经诱导主要通过单层双SMAD抑制进行⁶⁹玫瑰花结中的神经上皮细胞在神经诱导开始后15天被提起，并繁殖以产生星形胶质细胞，如前所述⁷⁰用胰蛋白酶（Gibco）酶消化六个月的星形胶质细胞祖细胞，并将其作为单个细胞进行成熟。在免疫染色之前，细胞被镀在涂有基质凝胶的玻璃盖玻片上。成熟培养基由含有1×N的DMEM/F12组成₂，1×NEAA，1×谷氨酰胺，1×pen-strep，新鲜添加10 ng/mL BMP4和10 纳克/毫升CNTF。实验前一周内，每隔一天彻底更换一次培养基。

免疫组织化学、免疫荧光和TUNEL分析

对于组织切片，成年苍蝇被固定在福尔马林中，并被石蜡包埋。总共4个 在整个苍蝇大脑上制备μm系列额叶切片，并将其放置在单片玻璃载玻片上。在一些研究中果蝇属脑制剂被交替使用。将小鼠和人类样品固定在4%的多聚甲醛中，嵌入石蜡中，并切片，厚度为6 微米。用于阴茎倍体蛋白染色的小鼠组织固定在4%多聚甲醛中，然后在6 μm厚度。在进行免疫染色之前，将从iPS细胞分化出来的星形胶质细胞也固定在4%多聚甲醛中。

为了进行免疫染色，石蜡切片经过二甲苯、乙醇和水处理。在封闭之前，通过在pH 6.0的柠檬酸钠中煮沸进行抗原回收。在含有0.3%Triton X-100和2%牛奶的PBS中封住载玻片 h，然后与适当的一级抗体孵育过夜。

使用的主要抗体为：1:100的抗层粘连A/C（sc6215，Santa Cruz Biotechnology）；抗LamC（LC28.26，发育研究杂交瘤库），1:100；抗Elav（9F8A9，发育研究杂交瘤库），1:5；1:100抗YAP（14074，细胞信号技术）；安提·伊基（J.Zeitlinger），1:500；1:500抗β-半乳糖苷酶（z3781，Promega）；1:100抗GFP（N86/6，NeuroMab）；活性染色555卵磷脂（PHDH1-A，Cytosketon Inc.），1:100；1:5000抗GFAP（Z0334，DAKO）；1:500抗GFAP（N206/8，NeuroMab）；抗Repo（8D12，发育研究杂交瘤库），1:5；1:5抗整合素（CF.6G11，发育研究杂交瘤库）；1:1的抗包装物（10D3，发育研究杂交瘤库）；1:100的抗磷酸化Hpo（3681，细胞信号技术）；抗磷酸-Wts（8654，细胞信号技术），1:250。对于免疫组织化学，使用DAB（Vector Laboratories）作为染色剂进行生物素结合二级抗体（1:200，Southern Biotech）和亲和素-生物素过氧化物酶复合物（Vectastain Elite，Vector Laboratories。对于免疫荧光研究，使用适当的Alexa荧光缀合的第二抗体（Alexa 488、Alexa 555或Alexa 647）（1:200，Invitrogen）。至少在三只动物中复制了所有免疫染色数据，并显示了具有代表性的图像。

根据制造商的说明（TdT FragEL DNA片段试剂盒，Calbiochem），使用末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP缺口末端标记（TUNEL）标记以及额外的抗生物素-生物素过氧化物酶扩增步骤，观察细胞凋亡。通过检查连续的额叶切片（4 μm）每个基因型至少6只动物的整个大脑。在图中2克和300万转基因果蝇（GFAP）中TUNEL阳性细胞的数量^R79小时)带有LamC公司和Hpo公司将调节与GFAP转基因果蝇单独的百分比变化进行比较。用Alexa 488共轭链霉亲和素（Invitrogen）进行荧光TUNEL标记。对于带有细胞类型特异性标记物的TUNEL荧光双标记（胶质细胞为Repo，神经细胞为Elav），我们使用Alexa 488结合链霉亲和素（Invitrogen^2j、k). 通过将凋亡神经元细胞（TUNEL和Elav阳性细胞）的数量除以凋亡细胞的总数（所有TUNEL阳性细胞）来量化神经元细胞死亡的百分比（图第2页和补充图^200万). 每个数据点表示平均值 ± 扫描电镜。

报告人β-半乳糖苷酶阳性细胞数量的量化前任-lacZ公司,循环E-lacZ公司以及GFP阳性细胞的数量第个-GFP公司（图3小时-j)通过检查连续的额叶切片（4 μm）每个基因型至少6只动物的整个大脑。每个数据点代表平均值 ± 扫描电镜。

iPS细胞中LA/C强度、YAP N/C比率和应力纤维的量化（图6a–c类)共聚焦图像（Olympus FV1000共聚焦，LA/C和YAP的×63物镜；应力纤维的×100物镜）。对于应力纤维定量，a 10 μm x 15 在体细胞中选择μm感兴趣区域（ROI）。在ROI中计算应力纤维的数量，并使用Mann-Whitney检验进行统计。每个数据点代表平均值 ± 扫描电镜。

蛋白质斑点

制备人（额叶皮层白质）和小鼠（海马）样品，并在RIPA缓冲液（50 mM三通，150 mM NaCl，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸盐，1%NP40，pH 7.4，含蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物，Thermo Fisher Scientific），并以14000×克用于15 4时最小值 摄氏度。上清液用于免疫印迹。果蝇属大脑在1×Laemmli缓冲液（Sigma）中均质。所有样品均煮沸10分钟 100时最小值 °C，短暂离心并使用10%或4-12%凝胶进行SDS-PAGE（Lonza）。蛋白质被转移到硝化纤维素膜（Bio-Rad），用0.05%吐温-20封闭在2%牛奶中的PBS中，并用一级抗体进行免疫印迹。使用的主要抗体为：1:500的抗层粘连蛋白A/C（ab8984，Abcam）；抗LamC（LC28.26，发育研究杂交瘤库），1:100；1:100000的抗GAPDH（MA5-15738，赛默飞世尔科学公司）；抗肌动蛋白（JLA20，发育研究杂交瘤库），1:4000；anti-Yki（J.Zeitlinger），1:10000；1:50的抗射击（mAbRod1，发育研究杂交瘤库）；1:500抗GFP（N86/6，NeuroMab）；1:1000000抗GFAP（Z0334，DAKO）；抗磷酸-FAK（Tyr397）（3283，细胞信号技术），1:1000。应用适当的辣根过氧化物酶缀合的第二抗体（1:20000，Southern Biotech），并用West Femto化学发光底物（Thermo Fisher Scientific）检测信号。使用FluorChem HD2系统（ProteinSimple）拍摄图像。所有印迹至少重复三次，代表性印迹如图所示。使用NIH Image J软件定量蛋白质印迹。每个数据点代表平均值 ± 扫描电镜。

行为分析

如前所述进行癫痫分析²¹简单地说，羽化后立即收集苍蝇，并以每小瓶3-5只动物的数量保存1天，在分析前无需进一步麻醉。为了进行测试，在VWR微型涡流器上对小瓶进行10次机械刺激 s（最大速度）。癫痫发作被定义为腿或翅膀的反复收缩，或瘫痪发作持续时间>1 s.癫痫发作频率是通过将发生癫痫发作的苍蝇数量除以测试苍蝇总数来计算的。使用χ²-测试。每个数据点代表发作频率（发作苍蝇的百分比）。

小鼠脑流变仪

4个月大的小鼠的大脑切片厚度为750 牺牲后立即在振动仪1500上涂上µm。样品保存在冷的人工脑脊液中（0.135 M氯化钠，5.4 毫米KCl，5 mm Na-HEPES缓冲器，1.8 mM氯化钙₂, 1 毫米氯化镁₂). 脑切片（5–6 在应变控制旋转流变仪（ARES-G2，TA Instruments，DE）上对含有海马体的弹性进行测量。在脑切片准备好并在5内完成后立即进行测量 从牺牲中解脱出来。为了获得测量结果，在流变仪底座和5之间轻轻加载每个脑片 mm上板几何形状。5的小压力 将mN涂敷在组织上，以确保样品和几何形状之间的更好接触。在样品上施加一个小的振荡，以探测组织模量。从0.1到10的频率扫描 以1%的应变幅度执行Hz。0.1时的储存模量（G′） Hz用于比较对照组和实验组之间的大脑刚度。实验对小鼠基因型盲法进行。未使用随机分组。

三维胶原基质培养

果蝇属在放入胶原基质之前，将大脑在冷PBS中解剖并保持在冰上。胶原基质混合物根据制造商的说明（Corning collagen I，354249）制备。简单地说，使用1×PBS将胶原蛋白稀释至所需浓度。然后通过添加1中和胶原蛋白 N氢氧化钠。混合物放在冰上直到可以使用。体积40 将每个样品的胶原蛋白基质混合物μl添加到冰镇盖玻片上，并添加3-4果蝇属大脑被小心地嵌入基质中。25岁时胶原蛋白凝胶固化后 °C，培养基(果蝇属S2中等，1%10 k U/ml青霉素，10 添加mg/ml链霉素，10%胎牛血清），在25℃培养大脑 40°C 小时。

电子显微镜

在胶原蛋白基质中培养的大脑固定在2%甲醛/2.5%戊二醛（Polysciences）中。在碳酸钙缓冲液中清洗后，大脑在1%四氧化锇（电子显微镜科学）/1.5%亚铁氰化钾（MP生物医学）中孵育1 h、 30%醋酸铀酰 min，然后通过70、90和100%乙醇溶液进行处理。然后将大脑在环氧丙烷中孵育1 h、 嵌入Epon中，60℃聚合3天 摄氏度。用Tecnai G切割并检查薄片²加速电压为80的Spirit BioTWIN透射电子显微镜 千伏。

共焦显微镜

所有荧光图像均在共焦显微镜上拍摄（哈佛神经发现中心增强神经成像核心设施的徕卡SP8×共焦显微镜或哈佛医学院神经生物学成像设施的奥林巴斯Fluoview 1000共焦显微镜（NIH-NINDS P30NS072030）。使用相同的激光设置对对照样品和实验样品进行成像。对于小鼠组织中的F-肌动蛋白图像（图4a类和补充图^5a级)使用惠更斯软件对共聚焦图像进行反褶积。

实时PCR

从20日龄婴儿中分离出RNA果蝇属大脑（每个样本16个大脑）使用齐阿唑（Qiagen），并根据制造商的说明使用高容量cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）进行逆转录。根据制造商的说明，在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems）中，使用SYBR Green PCR Master Mix（应用生物系统）进行实时PCR并进行监测。果蝇属核糖体蛋白RpL32型用作对照。每个数据点代表平均值 ± 扫描电镜。

底漆：

拉纳：5′-CCAGGGCATGAAATTCAATGAAGTC-3′；5′-GGTCTTGCATAATCCGTGGACT-3′

车道B1：5′-CTCGCGGAGAGATCTGCA-3′；5′-TTGTACGGATCATGCTTGGTCTCC-3′

车道B2：5′-GGCACAGAAATGTCTGCCAG-3′；5′-CTGCTCCACACAGGTATAGTTGACTC-3′

文斯：5′-GCATCTTTCCAACCAACATGCCGA-3′；5′-CGATCAGAGCGCGTGTGGC-3′

32卢比：5′-GACCATCCGCCCAGCATAC-3′；5′-CGGCGACGCACTCTGT-3′

统计分析

使用GraphPad Prism 6软件进行统计分析。每个数据点代表平均值 ± SEM。对于两组的比较，参数(t吨-测试）或非参数（Mann-Whitney测试或Wilcoxon测试）测试。为了比较三组或更多组，在适当的情况下进行了参数单向方差分析或非参数Kruskal–Wallis/Friedman检验。这个χ²-试验用于癫痫发作行为分析。N个和第页-值显示在图图例中。第页 < 0.05被认为具有统计学意义。样本量是根据统计显著性所需的最小数量或实验室/文献中的以往经验确定的。未计算各组内的方差，但假设相似。所有实验的数据都是随机收集和处理的，但没有进行正式的随机化。鉴于所进行实验的性质，数据收集和分析不是盲目进行的。

从布卢明顿获得的飞行股票果蝇属维也纳库存中心（NIH P40OD018537）果蝇属资源中心、L.Wallrath、A.Laughon、J.Jiang和N.Tapon参与了本研究。我们感谢哈佛大学医学院的转基因RNAi项目（TRiP）（NIH-NIGMS R01GM084947）制作转基因RNA干扰库。单克隆抗体从NICHD赞助开发的发育研究杂交瘤库中获得，该库由爱荷华大学、爱荷华市生物系、IA 52242和加州大学戴维斯分校/NIH NeuroMab设施维护。J.Zeitlinger善意地提供了果蝇属Yki抗体。人体组织来自马里兰州巴尔的摩马里兰大学NICHD发育障碍大脑和组织库。这项工作得到了NIH-NICHD P01HD076892、波士顿儿童医院智力和发育障碍研究中心（NIH-NICHAD U54HD090255）的支持以及韦斯曼中心（NIH-NICHD U54HD090256）、国家科学基金会（DMR-1310266）、哈佛材料研究科学与工程中心（DMR-1420570）、NIH P01HL120839-03和NIH P010GM096971。