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.2012年5月2日；32(18):6391-410.
doi:10.1523/JNEUROSCI.6221-11.2012。

反应性星形胶质细胞增生症的基因组分析

詹妮弗·L·扎马尼安 1, 徐丽君, Lynette C Foo（勒奈特·C·福）, 纳维德·努里, 泸州, 罗娜·吉法德, 本·A·巴雷斯
附属公司

反应性星形胶质细胞增生症的基因组分析

詹妮弗·L·扎马尼安等。 神经科学. .

摘要

反应性星形胶质细胞增生症的特点是在所有中枢神经系统损伤和疾病的反应下，星形胶质细胞表型发生深刻变化。为了更好地了解反应性星形胶质细胞的状态，我们使用Affymetrix基因芯片阵列，在诱导后的不同时间点，使用两种小鼠损伤模型（缺血性中风和神经炎症），分析分离的反应性星形细胞群体中的基因表达。我们发现，反应性胶质增生症包括创伤后快速但迅速减弱的基因表达诱导，并将诱导的Lcn2和Serpina3n确定为反应性星形胶质细胞的强标记物。引人注目的是，反应性星形胶质细胞表型强烈依赖于诱导损伤的类型。尽管在两种损伤模型的反应性星形胶质细胞中都有一组核心基因上调，但至少50%的基因表达改变是特定损伤类型的特异性基因。缺血中的反应性星形胶质细胞表现出一种分子表型，这表明它们可能是有益的或保护性的，而LPS诱导的反应性星状胶质细胞则表现出一个表型，这说明它们可能是有害的。这些发现表明，尽管已经确立了共同点，但星形胶质细胞反应性胶质增生是一种高度异质性状态，星形胶质细胞的活动会因特定损伤而发生改变。这就提出了反应性星形胶质细胞存在多少亚型的问题。我们的研究结果提供了两种反应性星形胶质细胞亚型的转录组数据库，这将非常有助于生成关于其功能的新的和可测试的假设，并为检测人类神经疾病中不同类型的反应性星形细胞提供新的标记物。

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数字

图1。
图1。
大脑中动脉闭塞和全身注射LPS可诱导星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化。用Aldh1l1-eGFP小鼠假手术后大脑10μm固定冰冻切片进行胶质增生标记物的免疫荧光检测(A类,E类)、MCAO(B–D类,F–H（飞行高度）)，盐水注射(我,M（M）)，或LPS注射(J–L型,N–P型). 绿色的eGFP由星形胶质细胞表达并专门标记星形胶质细胞。A–D,I–L型GFAP免疫染色鉴定的反应性星形胶质细胞呈红色，位于MCAO病变半影(A–D)和LPS处理小鼠的皮层(I–L型)伤后1d，持续1周以上。J型,K（K）箭头所示为LPS治疗小鼠皮层中的反应性星形胶质细胞斑块。E–H（E–H）,M–P公司激活的小胶质细胞，通过IBA1免疫反应增强和突起增厚确定，在同一时间过程中明显可见。MCAO病变核心星形胶质细胞中eGFP表达降低(D类，星星）。MCAO病变变形虫细胞中IBA1的强烈表达表明外周巨噬细胞浸润核心(H（H），星星）。比例尺：A–C,E–G公司,I–K,M–O型，50微米；D类,H（H）,L（左）,P（P），200微米。问-答使用来自对照组和受伤脑的单个切片对免疫荧光信号进行量化。问、脑切片中GFAP的定量(n个=4（假手术组）和1天，n个=5持续7天）显示在MCAO诱导的损伤后的第一周反应性星形胶质细胞增生增加。R（右），Iba1的量化(n个=4）脑切片显示MCAO诱导损伤后第一周激活的小胶质细胞增多。S公司、脑切片中GFAP的定量(n个=12（生理盐水），n个=13（1d），以及n个=4持续7天）显示在LPS诱导的神经炎症期间反应性星形胶质细胞增生增加。T型、脑切片中IBA1的定量(n个=21（生理盐水），n个=22，持续1d，以及n个=9，持续7天）显示LPS诱导的神经炎症期间激活的小胶质细胞增加了倍，误差条代表SEM*第页< 0.05; **第页相对于对照组，每个受伤时间点<0.01。第页7天MCAO与假GFAP的比值为0.055，因为动物之间的反应差异很大。
图2。
图2。
FACS从健康和受伤的Aldh1l1-eGFP小鼠的脑悬浮液中分离出GFP阳性细胞，产生纯星形胶质细胞群。A–D，FACS图显示了起始单细胞悬浮液的组成(A类,B类)和最终的星形胶质细胞数量(C类,D类). GFP荧光是星形胶质细胞特有的，显示在x个-轴和PI显示在年-轴。A类,B类，eGFP+星形胶质细胞占健康人起始细胞总数的15-25%(A类)并受伤(B类)脑组织。C类,D类，活eGFP细胞悬浮液的双重分选+细胞产生98.8±1.1%的最终纯星形胶质细胞群。比较星形胶质细胞和其他脑细胞类型之间探针集表达水平的条形图证实，在隔离的星形胶质细胞群中，污染水平较低。E–H（E–H），分离的细胞群表达星形胶质细胞标记(E类)但不是小胶质细胞的标记物(F类)，神经元(G公司)和少突胶质细胞(H（H）). Cahoy等人（2008）的神经元和少突胶质细胞.cel文件与本研究的星形胶质细胞和小胶质细胞.cl文件进行了重新规范化，以进行比较。
图3。
图3。
分离的星形胶质细胞表达反应性星形胶质细胞的经典标记物。A类在1周的过程中，从健康和受伤的大脑中分离的星形胶质细胞的基因芯片图谱中反应性星形胶质细胞基因的相对表达被绘制出来。损伤后1d，MCAO和LPS反应性星形胶质细胞中GFAP和波形蛋白（Vim）的诱导程度相似。Nestin（Nes）在MCAO反应性星形胶质细胞中诱导，但不在LPS反应性星形细胞中诱导。GFAP和波形蛋白表达在损伤后1周内持续升高。相反，nestin表达是短暂的，在损伤后第7天降至基线水平。误差条代表SEM。B–Q，对接受对照手术的Aldh1l1-eGFP小鼠大脑10μm固定冰冻切片进行反应性星形胶质细胞标记物的免疫荧光检测(B类,F类)、MCAO(C–E类,G–I型)，盐水注射(J型,N个)，或LPS注射(K–M公司,O–Q公司). eGFP在星形胶质细胞中表达并标记。B类,J型,F类,N个反应性星形胶质细胞标记物表达最低（波形蛋白；B类,J型)或不表达（nestin；F类,N个)在健康组织中。D类,E类,L（左）,M（M），在第7天，在MCAO病变半影的星形胶质细胞中可见波形蛋白的强烈表达(D类,E类)损伤后和7天后LPS处理皮质的星形胶质细胞(L（左）,M（M）).H（H）,我损伤后7d，MCAO半影星形胶质细胞表达nestin。白星表示星形胶质细胞失去GFP表达的MCAO核心区域。O–Q公司Nestin在LPS处理的皮层中不表达。比例尺：B–D类,F–H（飞行高度）,J–L型,N–P型，50微米；E类,我,M（M）,问，200微米。
图4。
图4。
反应性星形胶质细胞群体的基因芯片分析提示了反应性星形细胞的新标记物。A类,B类，相对表达式，在日志上2来自Affymetrix基因芯片小鼠基因组430 2.0阵列的所有探针组的比例在散点图上表示。比较LPS注射动物和盐水注射动物星形胶质细胞的表达(A类)并将接受MCAO的动物的星形胶质细胞与接受假手术的动物的胶质细胞的表达进行比较(B类). 上的反应性星形胶质细胞群年-轴与静止的星形胶质细胞在x个-轴。每个点代表一个探针组。LPS和MCAO反应性星形胶质细胞中诱导的探针组用红点表示；在LPS和MCAO反应性星形胶质细胞中被抑制的探针组由蓝点表示。C类，使用263个基因通过层次聚类生成热图，这些基因的表达在损伤后1天显著诱导超过4倍。静态和反应性星形胶质细胞复制的树状图用欧氏距离表示。每个探针组的相对表达由颜色强度表示，其中蓝色表示低表达，红色表示高表达。D–T型,现场在新鲜冷冻的健康人冠状脑切片上用探针杂交两种已鉴定的反应性星形胶质细胞标记物(D–G，放大高-低)并受伤(M–P公司，放大问-答)老鼠。盐水注射小鼠和假手术小鼠的对照切片均不表达Lcn2(H（H）和我放大框D类和E类)或Serpina3n(K（K）和L（左）放大框F类和G公司). 注射LPS后1天，整个皮层的星形胶质细胞表达Lcn2(问是放大框M（M）)MCAO后1d病变半影的星形胶质细胞(R（右）是放大框N个). 注射LPS后1d星形胶质细胞中表达Serpina3n(S公司是放大框O（运行）)或MCAO(T型是放大框P（P）). 红色箭头表示星形胶质细胞星状形态的细胞(问-答). 比例尺：D–G型,M–P公司，1000微米；高-低,问-答，50微米。
图5。
图5。
随着时间的推移，反应性星形胶质细胞中诱导的基因表达。A类，在7天内MCAO反应性星形胶质细胞中显著上调的前317个基因使用k个-指采用标准皮尔逊相关系数的方法。每行代表一个基因在MCAO后假手术、第1天、第3天和第7天的相对表达。基因分为六种表达模式，包含14–135个成员，如图1–6所示。B类，第3组中的多种基因在第1天受到强烈诱导，并在第7天迅速下调至近静态水平。Lcn2下调至近基线水平。Serpina3n表达在第7天仍然升高。C类，趋化因子亚群（CXCL1、CXCL2和CXCL10）的表达在1周内保持升高（第5组表达模式）。相反，巨噬细胞趋化因子CCL2遵循第3组的表达模式，在该模式下，表达被迅速调节。D类,现场健康和受伤小鼠冠状脑切片的杂交证实了基因芯片表达谱显示的时间进程。第1行（MCAO）和第2行（LPS），伤后1d Lcn2上调，但迅速下调；第3行（MCAO）和第4行（LPS），Serpina3n在损伤后1天上调，7天后下调，但仍保持上调。比例尺，100μm。
图6。
图6。
反应性星形胶质细胞显示细胞周期基因的延迟和短暂上调，表明损伤后适度增殖。细胞周期基因在反应性星形胶质细胞中随时间的相对表达用线形图表示。MCAO后1d早期细胞周期蛋白D表达上调。晚期细胞周期基因和增殖标记ki67的表达在第3天上调。所有细胞周期基因表达在MCAO后第7天恢复到基线水平。
图7。
图7。
LPS和MCAO反应性星形胶质细胞具有重叠但不同的诱导基因集。A类维恩图显示，263个基因在LPS和/或MCAO反应性星形胶质细胞中的分布显著上调超过四倍。LPS反应性星形胶质细胞中有113个基因上调了4倍以上。MCAO反应性星形胶质细胞中有205个基因上调4倍以上。这两种类型的反应性星形胶质细胞共有56个基因。B类,C类，饼图显示了MCAO的基因本体分类(B类)和LPS(C类)反应基因集。细胞外基质修饰和免疫反应是突出的类别。
图8。
图8。
MCAO反应性星形胶质细胞和LPS反应性星形细胞表达不同水平的细胞外结合/粘附/修饰基因。A类，使用细胞外结合/粘附/修饰基因通过分级聚类生成热图，所述细胞外结合/粘附/修饰基因的表达在任一损伤后1天被显著诱导超过4倍。静态和反应性星形胶质细胞复制的树状图用欧氏距离表示。显示相对表达式，其中蓝色表示较低的表达式，红色表示较高的表达式。LPS反应性星形胶质细胞和MCAO反应性星形细胞以不同的方式修饰细胞外间隙。B类条形图显示了MCAO反应性星形胶质细胞（蓝色）和LPS反应性星形细胞（红色）中类内基因的折叠诱导。对一个类别内的所有重复进行平均，以获得折叠诱导。虽然MCAO和LPS反应性星形胶质细胞之间有相似之处，但它们之间的基因表达诱导模式有很大差异。
图9。
图9。
MCAO反应性星形胶质细胞和LPS反应性星形细胞表达不同水平的细胞因子信号基因。A类条形图显示MCAO反应性星形胶质细胞（蓝色）和LPS反应性星形细胞（红色）中细胞因子信号基因的折叠诱导。对一个类别内的所有重复进行平均，以获得折叠诱导。促炎细胞因子CXCL1、CXCL2和CXLC10在MCAO和LPS反应性星形胶质细胞中的诱导作用类似。神经营养细胞因子LIF、IL6和CLCF1以及巨噬细胞趋化因子CCL2在MCAO反应性星形胶质细胞中被更强地诱导。B类，通过使用细胞因子信号基因对静息和反应性星形胶质细胞群体进行分级聚类，生成了一张热图，这些基因在任何损伤后1天的表达都显著诱导超过4倍。星形胶质细胞复制的树状图用欧氏距离表示。热图表示相对表达，其中蓝色表示低表达，红色表示高表达。即使在损伤模型中，星形胶质细胞对损伤的反应也会发生变化。两个重复的LPS反应性星形胶质细胞与MCAO反应性星形细胞更紧密地聚集在一起，一个重复的表达模式将其置于静止的星形胶质细胞群中。
图10。
图10。
LPS反应性星形胶质细胞更能诱导抗原提呈和补体途径。A类显示MCAO反应性星形胶质细胞（蓝色）和LPS反应性星形细胞（红色）中抗原提呈途径基因的折叠诱导。对一个类别内的所有重复进行平均，以获得折叠诱导。抗原提呈途径基因在LPS反应性星形胶质细胞中诱导2到30倍，而在MCAO反应性星形细胞中仅诱导10%到3倍。B类，利用抗原提呈途径基因通过层次聚类生成热图。树状图上静止和反应性星形胶质细胞种群复制之间的距离用欧氏距离表示。热图表示相对表达，其中蓝色表示低表达，红色表示高表达。LPS反应性星形胶质细胞簇独立于其他星形胶质细胞群。C类比较了MCAO反应性星形胶质细胞（蓝色）和LPS反应性星形细胞（红色）补体途径基因的折叠诱导。在LPS反应性星形胶质细胞中，补体基因的诱导率为4.5至34倍，而在MCAO反应性星形细胞中，仅为2.4至6.8倍。D类，五个LPS反应性星形胶质细胞复制簇中的四个根据其补体途径基因表达与其他星形胶质细胞群分离。MCAO反应性星形胶质细胞、一个LPS复制和一个静止复制显示补体通路表达的中间诱导。
图11。
图11。
ISH证实了损伤之间反应性星形胶质细胞基因表达的差异。现场对健康人冠状脑切片进行LPS和MCAO反应性星形胶质细胞潜在标记物杂交(A类,D类,G公司,J型,M（M）)和受伤(B类,C类,E类,F类,H（H）,我,K（K）,L（左）,N个,O（运行）)老鼠。A类,D类，H2-D1(A类)以稀疏细胞表达，Serping1(D类)在盐水注射小鼠的皮层中不表达。B类,E类，MCAO后一天，表达H2-D1的细胞数量增加(B类)非常稀疏的细胞表达Serping1(E类).C类,F类，LPS后一天，包括一些星形胶质细胞在内的高密度细胞表达H2-D1(C类)和Serping1(F类).G公司,J型,M（M）、S1Pr3(G公司)，第3部分(J型)，和微调受体(M（M）)在假小鼠的健康皮层中不表达。H（H）,我,K（K）,L（左）,N个,O（运行）、S1PR3(H（H）)，Ptx3毫米(K（K）)，和微调受体(N个)在MCAO后1天，MCAO半影星形胶质细胞中高表达，但在LPS注射小鼠的皮层中低于可检测限(我,L（左）,A类,). 比例尺，100μm。
图12。
图12。
受伤大脑中的反应性星形胶质细胞是异质的。在10μm新鲜冰冻切片上进行带有识别标记物Lcn2和Serpina3n的双荧光ISH。A–H，星形胶质细胞标记为绿色的Glast。反应性星形胶质细胞标记物，Lcn2(A–D)或serpina3n(E–H（E–H）)，标记为红色。反应强烈的星形胶质细胞(B类,D类,F类,H（H），红色箭头）可以在相对静止的星形胶质细胞附近看到(B类,D类,F类,H（H），红色箭头）。Lcn2的表达也局限于内皮细胞(H（H），白色箭头）。I–L型，可以看到来自FITC-酪胺和Cy3-酪胺扩增的背景信号。比例尺，50μm。
图13。
图13。
McCarthy-de Vellis星形胶质细胞表达高水平的反应性胶质增生基因。A类维恩图显示，基因在LPS和MCAO反应性星形胶质细胞中的分布显著诱导超过四倍，在MD星形胶质细胞相对于星形胶质细胞的表达显著增加四倍以上体内相对于星形胶质细胞，MD-星形胶质细胞中50%以上的星形胶质细胞反应性胶质增生基因升高体内.B类，以欧氏距离表示的树状图是通过使用263个四倍以上诱导的反应性星形胶质细胞基因对静态、反应性和MD-星形胶质细胞表达谱进行分层聚类生成的。MD-星形胶质细胞与MCAO反应性星形胶质细胞聚集最强烈，远离所有三组静止的星形胶质细胞。C类，使用基因类子集，以静态、反应性和MD-滋养细胞表达谱的欧氏距离表示的层次聚类。利用细胞因子信号基因、ECM结合/粘附基因和IL6信号通路，MD星形胶质细胞与MCAO反应性星形胶质细胞最紧密地聚集。利用补体途径和干扰素反应基因，MD-天冬氨酸细胞与LPS反应性星形胶质细胞最紧密地聚集在一起。使用转运体/通道基因、肽酶抑制剂和急性期信号，MD-天冬氨酸细胞与两种反应性星形胶质细胞聚集在一起。通过抗原提呈途径，MD-天冬氨酸细胞与静止的星形胶质细胞聚集在一起。
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