反应性星形胶质细胞增生症导致自发性癫痫发作

患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠出现自发癫痫

已知癫痫灶含有反应性星形胶质细胞(达安布罗西奥，2004；Wetherington等人，2008年；Carmignoto和Haydon，2012年；库尔特和开斋节，2012年)然而，目前尚不清楚它们是神经元功能障碍的结果还是积极的贡献者(Verkhratsky等人，2012年). 自从腺病毒诱导的星形胶质细胞增生症后观察到海马神经元超兴奋性(Ortinski等人，2010年)，我们试图调查β1中广泛存在的星形胶质细胞增生症^−/−小鼠出现自发癫痫发作。

为了评估大脑皮层的总体活动，我们记录了β1不同年龄组的颅下皮层脑电图^−/−小鼠和对照组。记录脑电图（22–258小时连续记录），同时对每只动物进行录像（参见表1所有β1的列表^−/−动物和各自的记录时间）。

我们观察到β1的脑电图活动高度异常^−/−小鼠与对照鼠的比较(图2一). 这种活动包括强直阵挛性发作，伴有明显的抽搐表型(图2b条,天)以及频繁的发作间期穿刺(图2c（c）,e（电子）). 58%的β1出现强直阵挛性发作^−/−动物（29/50只），而对照组同窝小鼠（0/48只）从未观察到癫痫发作。我们记录了四个不同年龄组（4周和5-6周、2-3个月和6个月以上）的脑电图，发现5-6周龄动物的癫痫发病率最高(图2（f）). 然而，不同年龄组的癫痫发作频率没有显著差异（ROUT异常值检验、Kruskal-Wallis检验、，第页=0.297，邓恩多重比较检验；图2克). 考虑到癫痫发作平均每1-2天只发生一次，记录周期可能并不总是足够长，无法计算准确的癫痫发作频率(表1). 因此，我们可能高估了没有癫痫发作的动物数量。

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图2。

患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠出现自发性癫痫发作和发作间期发作。一，脑电图记录显示β1的脑电图活动异常^−/−与对照组小鼠进行比较。b条，β1活性异常^−/−小鼠表现为自发性强直-阵挛发作或发作间期发作(c（c）).天，癫痫发作开始的高时间分辨率。在癫痫发作结束时，通常会观察到脑电图信号抑制。e（电子），发作间期峰值的高时间分辨率。（f），捕获动物的百分比在4周龄时最低，而在年龄较大的动物中增加。克, β1^−/−小鼠在48小时内平均经历一到两次癫痫发作。不同年龄组的癫痫发作频率没有显著差异。小时，发作间期峰值出现在所有年龄组中的频率都很高，β1显著增加^−/−6个月以上的小鼠。误差条参考SEM。统计显著性*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

相反，我们在几乎所有β1中观察到年龄依赖性发作间期峰值^−/−在年龄较大的小鼠中显著增加的小鼠（ROUT异常值测试，单向方差分析，第页≤0.0001，Tukey多重比较试验；图2小时). 只有14%的β1^−/−小鼠没有或很少出现发作间期峰值，而其余86%的小鼠的峰值要高得多(n个=43）与室友对照组相比(n个= 20). β1的一半^−/−很少或没有发作间期放电的小鼠（3/6）为4周龄，该年龄组表现为较轻的星形胶质细胞增生。这表明，至少在发作间期峰值和GFAP表达方面，表型的外显率较高（免疫组化分析的7%的小鼠显示GFAP表达与对照组相当，而所有其他动物的皮层灰质中GFAP水平升高，n个=28）。

为了评估GFAP免疫组化和癫痫发作频率之间的相关性，计算了这两个变量之间的Spearman相关系数。系数ρ=0.37(第页=0.006）表明GFAP水平和癫痫发作频率往往同时增加。

我们无法对小于4周的小鼠进行连续脑电图记录，因为在颅骨电极植入后，动物被单独饲养，因此它们必须处于断奶年龄才能进行手术。此外，我们在植入后等待了约5天才进行记录。我们观察到β1^−/−经过几天的记录，小白鼠经常虚弱，体重减轻。这些动物被从进一步的记录中删除。

如果不将EEG电极插入大脑或损伤脑膜，就很难将其放置在大脑表面，这可能会导致星形胶质细胞和小胶质细胞活化。在对照和β1的子集中^−/−在动物身上，我们发现植入电极会造成组织损伤(图3). 评估急性损伤如何影响对照组和β1的癫痫发作^−/−我们根据GFAP和Cd11b免疫组织化学鉴定了遭受额外损伤的动物组。我们将动物分为三组：无损伤动物、轻度损伤动物或严重损伤动物。在没有组织损伤的动物中，我们没有观察到通过Cd11b水平评估的小胶质细胞激活(图3一). 注意，电极损伤引起的小胶质细胞激活和伴随的Cd11b免疫反应性增加远远超过了我们通常在β1中观察到的轻度小胶质细胞活化^−/−动物(Robel等人，2009年). 尽管β1中GFAP水平很高，但这使我们能够识别出脑中受电极损伤的区域^−/−老鼠(图3b条). 在轻度损伤的小鼠中，电极未穿透脑组织，但与邻近脑区相比，Cd11b（和对照组中的GFAP）上调。在严重受损的动物中，电极已经穿透了脑组织。

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图3。

电极植入引起的组织损伤不影响癫痫发作表型。反应性小胶质细胞标志物Cd11b的免疫组织化学研究(一)β1中的GFAP^−/−和接受电极植入和脑电图记录的对照小鼠(b条).c（c）无组织损伤或轻度和重度组织损伤的动物的量化。β1^−/−根据是否检测到组织损伤，将小鼠分为两组。计算了癫痫发作和发作间期发作频率，并没有显著差异（癫痫发作：有损伤，n个=8；没有损坏，n个= 22; 曼·惠特尼，第页= 0.86; 间歇尖刺：有伤害，n个= 5; 没有损坏，n个= 11; 曼·惠特尼，第页= 0.48; >6个月的动物被排除在分析之外，因为在这个年龄段，发作间期棘波的频率明显更高）。方框和胡须图显示最小值到最大值，平均值显示为+。

然后，我们比较了有和没有额外急性组织损伤的动物的发作频率和发作间期峰值频率。我们从未在对照动物中观察到癫痫发作。更具体地说，10只控制急性损伤的动物(图3c（c）共记录769小时，其中6只小鼠在4-6周后再次记录，共记录331小时。对照小鼠没有癫痫发作表明，至少在电极植入后长达8周的观察期内，这种急性局部局限性损伤诱导的炎症不足以引发癫痫发生。

确保β1的急性损伤和慢性星形胶质细胞增生^−/−小鼠对癫痫发作和发作频率没有协同作用，我们比较了β1^−/−有无电极损坏。这些组之间的发作间期发作频率或发作频率没有显著差异(图3c（c）).

这些数据表明β1的慢性星形胶质细胞增生症^−/−大多数小鼠的脑电图活动异常，表现为发作间期发作和自发发作，而局部急性损伤引起的局灶性胶质增生不会引起癫痫。

β1具有神经超兴奋性特征^−/−老鼠

癫痫发作是由神经元兴奋性的异常变化引起的(Goldberg和Coulter，2013年). 检查β1中是否存在这种情况^−/−我们对4-6周龄和6-8周龄小鼠急性脑切片中的第II/III层皮层锥体神经元进行了全细胞斑贴记录。我们发现神经元RMP在β1中显著地去极化^−/−神经元（4-6周：RMP=−63.28±1.77 mV，n个= 32; 6-8周：RMP=−68.87±1.38 mV，n个=30）比对照组（4-6周：RMP=−71.83±0.8 mV，n个=35，双尾非配对t吨测试，第页< 0.0001; 6-8周：RMP=−73.03±0.77，n个=32，双尾非配对t吨测试，第页= 0.0002;图4一)而4-6周龄β1的输入电阻较高^−/−小鼠（对照R（右）_我=102.6±8.28 MΩ，β1^−/− R（右）_我=137.9.36 MΩ，双尾Mann-Whitney检验，第页= 0.0014;图4b条)但在6-8周龄时，两组之间具有可比性（对照组R（右）_我=78.38±7.97 MΩ，β1^−/− R（右）_我=84.86±5.55 MΩ，双尾Mann-Whitney检验，第页= 0.1016;图4b条).

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图4。

在患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠中，第II/III层锥体神经元过度兴奋。一β1急性切片中第II/III层锥体神经元的RMP显著去极化^−/−小鼠与对照组进行比较。b条，4周龄时输入电阻不同，但β1不变^−/−神经元与对照组比较。盒须图中的晶须显示最小值到最大值。中线绘制在中间位置。c（c），锥体神经元在去除镁之前（ACSF）和之后的全细胞膜片钳记录²⁺（镁²⁺-游离），然后是AP-5，在β1的急性切片中，发作事件的发作速度更快，持续时间更长（持续时间>2s）^−/−小鼠在6-8周龄时与对照组进行比较。天，量化去除镁后发作事件（定义为长度>2 s的事件）发生的潜伏期²⁺β1中^−/−小鼠和室友对照组，以及β1^−/−Nex:：Cre小鼠及其窝友对照。e（电子），量化去除镁后发作间期开始的潜伏期（定义为500 ms至2 s长度的事件）²⁺.（f），应用荷包牡丹碱后发作间期和发作期事件发生的潜伏期的量化。克，β1中全细胞、电流钳制的锥体肿瘤周围神经元对振幅从−100到+240 pA（20 pA步进）增加的电流注入的电压响应示例^−/−和控件。小时，绘制了响应−20至240 pA电流脉冲获得的平均动作电位数，作为外加电流的函数，得出了所示的输入-输出曲线。我，图形显示由皮质浅层II/III锥体细胞的全细胞斑贴灯记录的突触后电位的输入/输出曲线，以及作为b1刺激强度函数的响应面积^−/−并控制皮层切片。j个，AMPA受体GluR2/3亚单位的Western blot。误差条参考SEM。方框和胡须图显示最小值到最大值，平均值显示为+。统计显著性*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

检查β1^−/−锥体神经元是超兴奋的，我们选择了四种不同的方法。首先，我们测定了镁去除后发作（定义为2秒以上的事件）和间歇（定义为持续时间在500毫秒到2秒之间的事件）活动的发展潜伏期²⁺从镀液中除去镁²⁺如前所述阻断NMDA受体(白金汉等人，2011年). 在对照组小鼠中，4-6周时第一次发作间期事件的潜伏期为23.69±3.25分钟(n个=12）和15.49±2.29分钟(n个=14）在6-8周龄时(图4c–e类). 发作性放电开始时间为58.24±8.69 min(n个=9）和37.93±2.53分钟(n个=9）在6-8周龄时(图4c–e类). 一些神经元在60-90分钟的记录期内没有发作放电反应。由于我们无法确定发作时间，因此将无反应神经元排除在分析之外。对照脑片中的无反应神经元比β1脑片中多^−/−这表明对照组动物发病的平均值可能被低估了。β1中的金字塔神经元^−/−脑切片显示发作间期开始的潜伏期显著缩短（4-6周：12.04±2.82min，n个=12，双尾非配对Mann-Whitney检验，第页= 0.0015; 6-8周：8.64±0.91分钟，n个=10，双尾非配对t吨测试，第页=0.0243）和发作期（4-6周：21.43±4.94分钟，n个=10，双尾非配对Mann-Whitney检验，第页= 0.0095; 6-8周：15.27±1.78分钟，n个=10，双尾非配对t吨测试，第页≤0.0001）两个年龄组的活动(图4c–e类).

同样，我们测定了应用荷包牡丹碱（一种GABA）后发作和发作间期活动发展的潜伏期_A类促进兴奋性同步化的受体拮抗剂(Gutnick等人，1982年). 而对照组和β1组发作间期事件的发生没有变化^−/−4-6周龄时(图4（f），控制；8.33±1.54分钟，n个= 10; β1^−/−; 6.1±0.59分钟，n个=14，双尾非配对Mann-Whitney检验，第页=0.54），β1的发作事件明显更快^−/−锥体细胞（对照组：17.21±3.25 min，n个=8；β1^−/−：10.27±1.58分钟，n个=15，双尾非配对t吨测试，第页= 0.041).

此外，我们量化了电流注入引起的动作电位数量。我们发现β1中的这一数字明显更高^−/−与对照神经元相比，锥体细胞对180、200、220和240 pA电流的反应(图4克,小时)，表明β1的兴奋性阈值降低^−/−两个年龄组的神经元。

最后，我们记录了对照组和β1的输入/输出曲线^−/−皮质切片。使用刺激电极向皮层深层IV层递送递增的刺激，并在皮层浅层（II/III）记录突触后电流。输入/输出曲线由响应面积和振幅构成，作为刺激强度的函数(图4我). 来自β1的记录^−/−锥体细胞明显大于对照组。增加刺激导致β1的兴奋反应区增大^−/−切片与控件比较(图4我; 双向方差分析，然后进行Sidak的多重比较测试，n个=每个基因型5个）。

与癫痫相关的快速突触兴奋主要由AMPA受体介导，AMPA受体拮抗剂可以降低动物模型和人类癫痫的癫痫样活动(罗加夫斯基，2013). 探讨β1中AMPA受体表达是否发生变化^−/−我们对GluR2/3亚单位进行了Western blot分析。在4周龄和6周龄时，对照组和β1组之间的蛋白质水平没有显著变化^−/−老鼠。在老年动物中，Glu2/3水平略有降低(图4j个). 这排除了GluR2/3蛋白表达水平的增加对β1癫痫发作的影响^−/−老鼠。

β1-整合素的神经元缺失不会诱导神经元过度兴奋

为了排除β1整合素缺失选择性影响神经元而非星形胶质细胞的可能性，我们在β1整合素缺失具有神经元特异性的小鼠中进行了相同的实验。调节漂浮的β1整合素基因β1的重组^{飞行/飞行}将小鼠培育成Nex:：Cre^+/−在转录因子Nex的调节序列控制下表达Cre的小鼠(Goebbels等人，2006年). 这导致了～E11.5端脑背侧中间祖细胞和神经元的基因缺失(Goebbels等人，2006年). 我们之前报道，尽管β1整合素蛋白早期下调，但这些小鼠中没有星形胶质细胞增生症(Robel等人，2009年). 然而，在急性脑切片中从β1-整合素进行的第II/III层锥体神经元全细胞斑贴记录^{飞行/飞行}，Nex:：Cre^+/−小鼠及其对照窝鼠（β1-整合素^{液体/重量}，Nex:：Cre^+/−; β1整合素^{飞行/飞行}，Nex:：Cre^−/−; β1整合素^{液体/重量}，Nex:：Cre^−/−)结果表明，在所有基因型中，去除镁后，癫痫样事件发生的潜伏期相似（超过2秒）²⁺(图4天; 对照组，34.21±10.51分钟，n个= 6; β1整合素^{飞行/飞行}，Nex:：Cre^+/−40.0±4.52分钟，n个=7，双尾非配对t吨测试，第页= 0.6035).

由于神经元特异性β1整合素缺失不会诱导超兴奋性，因此我们得出结论：星形胶质细胞增生导致β1^−/−锥体细胞变得去极化和超兴奋。

β1中的反应性星形胶质细胞^−/−小鼠K受损⁺平衡？

阐明β1神经元超兴奋性和癫痫发作的可能机制^−/−小鼠，我们首先关注的是建立良好的星形细胞稳态功能。研究表明，星形胶质细胞钾和谷氨酸稳态的损害可能导致神经元超兴奋性和癫痫发作(Seifert等人，2010年). 因此，我们结合Western blot、免疫组织化学和电生理记录来评估β1对钾和谷氨酸的摄取是否完整^−/−星形胶质细胞。

在从β1获得的急性脑切片上进行全细胞星形胶质细胞膜片钳记录^−/−或在6-8周龄时对小鼠进行对照。为了鉴定星形胶质细胞，这些动物在星形胶质细胞特异性Aldh1l1启动子的控制下表达eGFP(Cahoy等人，2008年；图5一). 平均输入电阻（控制R（右）_我=18.45±1.44兆欧，n个= 57; β1^−/− R（右）_我=22.01±2.84兆欧，n个= 39; 双尾Mann-Whitney检验，第页= 0.9985;图5b条)和平均RMP（控制RMP=−78.08±0.47 mV，n个= 32; β1^−/−RMP=−78.19±0.50毫伏，n个= 30; 双尾t吨测试，第页= 0.8713;图5c（c）)，在β1之间具有可比性^−/−并控制星形胶质细胞。然而，与细胞大小相关的细胞电容在β1中显著增加^−/−星形胶质细胞（对照C=10.54±0.91 pF，n个= 45; β1^−/−C=12.98±0.87 pF，n个= 42; 双尾Mann-Whitney检验，第页= 0.0158;图5天)与他们的肥大表型一致。

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图5。

患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠体内钾稳态中度受损。一，在全细胞斑贴灯记录中，通过β1急性切片中的eGFP鉴定星形胶质细胞^−/−和对照组小鼠（6-8周龄）在星形胶质细胞特异性Aldh1l1启动子下携带表达eGFP的等位基因。指示记录吸管和吹吸管的位置。b条、输入电阻(R（右）_我)和休息RMP(c（c）)皮质灰质中的实质性星形胶质细胞在β1之间没有变化^−/−和对照小鼠。天，β1中电池电容增加^−/−星形胶质细胞。e（电子）为了激活星形胶质细胞中Kir4.1介导的钾电流，在ACSF中使用了电压步方案，并在浴后应用Kir4.1抑制剂BaCl₂。记录道表示隔离Ba的相应电流记录道的逐点减法²⁺-全细胞电流的敏感成分。Kir电流的量化(我_基尔以pA/pF为单位）作为Ba²⁺-归一化为全细胞电容的−140 mV灵敏电导显示β1中Kir4.1电流显著降低^−/−星形胶质细胞。（f），β1的钾吸收相似^−/−并在施加125m压力后控制星形胶质细胞米KCl持续50 ms。盒状晶须图中的晶须显示最小值至最大值。方框中间的线绘制在中间位置，+表示平均值。克，大多数星形胶质细胞仅在精细过程中以较低水平表达Kir4.1。很少有星形胶质细胞在细胞体和过程中表达较高的Kir4.1水平。小时Western blot分析检测Kir4.1蛋白显示，β1皮质灰质中的蛋白表达和分布水平相似^−/−并在6周龄时对小鼠进行对照，但在年龄较大的小鼠中含量增加。条形图中的误差条参考SEM*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

星形细胞钾（K⁺)电导和摄取被认为是由钡敏感钾通道Kir4.1介导的(Olsen和Sontheimer，2008年). 为了激活这些细胞中Kir4.1介导的电流，我们使用了前面描述的特定电压步进协议(Olsen等人，2007年)，并使用100μ隔离这些电流米巴²⁺在这个浓度下，它能特异性抑制Kir通道(《赎罪与索尼默》，1995年). 对相应的全细胞电流进行逐点减法，以分离Ba²⁺-敏感分量（Kir电流；图5e（电子）). 我们量化了Kir电流，我_基尔（以pA/pF表示），作为Ba²⁺-−140 mV的灵敏电导，根据这些记录归一化为全细胞电容(图5e（电子）).我_基尔β1显著降低^−/−星形胶质细胞(我_基尔=−195.4±26.09 pA/pF，n个=26）与对照组（对照组我_基尔=−257.4±20.7 pA/pF，n个= 31; 双尾Mann-Whitney检验，第页= 0.0019;图5e（电子）).

评估Kir电流的减少是否会损害K⁺摄取，我们挑战β1中的星形胶质细胞^−/−并用加压钾控制急性脑切片⁺（125米米KCl），在电压灯条件下感应内向电流。穿过膜的离子数量可以通过电荷转移来确定，即Ba的面积²⁺-烟团感应的灵敏电流。令人惊讶的是，β1之间没有差异^−/−并控制星形胶质细胞的K数量⁺穿过膜的离子（控制：1.08±0.24 fmol K⁺,n个= 13; β1^−/−: 1.29 ± 0.23,n个=11，双尾非配对t吨测试，第页= 0.5438;图5（f）).

我们用免疫组织化学和Western blot分析来补充这些研究，以确定Kir电流减少是否是Kir4.1蛋白水平降低的结果。然而，Kir4.1蛋白表达（相对表达水平归一化为GAPDH）或β1^−/−并在4周和6周时控制动物(图5克,小时). 然而，对照组小鼠脑实质灰质星形胶质细胞中Kir4.1的表达水平存在差异。大多数星形胶质细胞在精细突起内表现出较低的Kir4.1水平；然而，一些星形胶质细胞在细胞体和过程中表达较高的Kir4.1水平。在β1的脑切片中可以看到类似的模式^−/−老鼠(图5克). Kir电流降低似乎发生在功能水平，与Kir4.1蛋白水平降低无关。有趣的是，β1中Kir4.1蛋白水平增加^−/−大于6个月大的动物(图5小时)可能反映β1的代偿性变化^−/−晚期星形胶质细胞。

总之，β1中的反应性星形胶质细胞^−/−尽管Kir4.1蛋白水平正常，但小鼠的Kir电流降低。然而，这并没有显著改变静息膜电位或K⁺吸收。后者可能是由于K较大且局部性较差⁺挑战。然而，精细过程中Kir通道密度的降低可能会显示局部K受损⁺体内平衡。

β1中的反应性星形胶质细胞^−/−小鼠表现出谷氨酸稳态受损？

检查β1中谷氨酸摄取受损的可能性^−/−我们首先通过免疫组织化学和Western blot分析了两种星形细胞谷氨酸转运体Glt-1（slc1a2）和GLAST（slc133）的表达。在4周龄和6周龄时，这两种蛋白质的水平相似(图6a–c). β1中^−/−6个月以上的动物，Glt-1水平略有下降(图6b条)而GLAST蛋白水平在对照组和β1之间保持可比性^−/−这个年龄的老鼠(图6b条). 6周龄对照组和β1组之间的Glt-1分布没有明显差异^−/−老鼠(图6一；Lehre等人，1995年)Glt-1和GLAST的差异表达）。

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图6。

慢性星形胶质细胞增生症小鼠的谷氨酸摄取受损。一谷氨酸转运体Glt-1的免疫组化和Glt-1蛋白的Western blot检测(b条)β1皮质灰质中的GLAST^−/−(c（c）)并对不同年龄（4周、6周和>6个月）的小鼠进行对照。天，在抽吸施用200μ米在应用谷氨酸转运体抑制剂TBOA和DHK前后，谷氨酸维持500ms。ACSF含有抑制剂（inh）TTX、AP-5、荷包牡丹碱和CdCl₂β1中TBOA/DHK敏感的谷氨酸摄取减少^−/−与室友对照组相比，星形胶质细胞。盒须图中的晶须显示最小值到最大值。方框中间的线绘制在中间位置，+表示平均值。e（电子）β1皮质灰质中星形细胞谷氨酰胺合成酶的蛋白表达水平没有变化^−/−4周龄和6周龄的对照小鼠，但6个月龄以上的小鼠的两种基因型均减少。条形图中的误差条参考SEM*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

为了评估谷氨酸转运是否发生了变化，eGFP的全细胞补丁灯记录⁺在β1急性脑切片中检测星形胶质细胞^−/−或控制小鼠。高谷氨酸浓度（200μ米)用吸管吸出，吸收电流记录在β1中^−/−阻断K时的星形胶质细胞和对照⁺BaCl吸收₂和TTX的神经元活性，天-AP5、荷包牡丹碱和氯化镉₂在用抑制剂TBOA和DHK阻断谷氨酸转运体后重复记录(图6天，记录道）。谷氨酸摄入量计算为TBOA/DHK敏感电荷转移（曲线下面积），在β1中显著减少^−/−星形胶质细胞(图6天; 控制0.0857±0.0123 fmol谷氨酸，n个= 6; β1^−/−0.0204±0.0120，n个=5，双尾非配对t吨测试，第页= 0.0045).

尽管以前有报道称反应性星形胶质细胞中的星形胶质细胞酶谷氨酰胺合成酶下调(Ortinski等人，2010年)，我们在β1的皮层灰质中发现了该蛋白的类似水平^−/−并控制大脑。我们发现两种基因型的老年小鼠的谷氨酰胺合成酶（GS）蛋白水平都显著降低(图6e（电子）).

这些数据表明，受损的星形胶质细胞摄取谷氨酸可能导致细胞外谷氨酸浓度增加，这可能有助于增强神经元的兴奋性。

慢性胶质增生症与神经元氯化物转运体的不成熟表达谱有关

最近的研究表明，抑制作用减弱，可能是由于GABA合成减少所致(Ortinski等人，2010年)或者GABA作为一种兴奋性神经递质而不是抑制性神经递素，会导致神经元的超兴奋性(Lee等人，2011年；Ben-Ari等人，2012年；Rangroo Thrane等人，2013年). GABA对神经元的作用取决于神经元细胞内氯化物的浓度。成熟神经元细胞内氯离子含量通常较低⁻]_我导致GABA超极化反应的浓度(Kahle等人，2008年). 神经元[Cl⁻]_我阳离子-氯共转运蛋白（CCC）NKCC1和KCC2的平衡表达维持了浓度。未成熟神经元表现出NKCC1的高表达，而KCC2的低表达维持了高[Cl⁻]_我啮齿动物在出生后第二周出现发育表达水平转换。KCC2水平增加，NKCC1水平降低，导致低[Cl⁻]_我和GABA与GABAA受体结合后的超极化反应(Kahle等人，2008年).

为了确定CCC在慢性星形胶质细胞增生症小鼠中的表达是否发生变化，我们采用Western blot检测KCC2和NKCC1(图7一)β1中^−/−控制皮层灰质(n个=每个基因型和年龄组4个）。我们发现KCC2和NKCC1蛋白的水平以及KCC2和NKCC1之间的比率在4周时没有变化(图7a–d). 6周时，KCC2水平保持不变，而NKCC1表达显著增加。在6个月及以上的小鼠中，KCC2蛋白显著降低。在患有慢性反应性星形胶质细胞增生症的小鼠中，6周后KCC2与NKCC1的比值降低(图7a–d).

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图7。

布美他奈治疗挽救了一组患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠的癫痫表型。一氯化钾共转运体（KCC2）和氯化钠共转运者（NKCC1）的Western blot分析。b条，KCC2量化。c（c），NKCC1表达水平在正常化到负载控制GAPDH后。天, β1^−/−在6周龄和6个月龄以上的小鼠中，氯离子转运蛋白KCC2和NKCC1的比例失调。NKCC的免疫组织化学(e（电子）)和KCC2(（f）)β1中^−/−3个月龄时控制皮层灰质。白色箭头指向NKCC1或KCC2表达模式改变的神经元。蓝色箭头指向神经元细胞体周围KCC2的正常环状表达。误差条参考SEM。统计显著性*第页< 0.05, **第页<0.01，以及***第页< 0.001.

NKCC1也在星形胶质细胞和内皮细胞中表达(Pedersen等人，2006年；Macaulay和Zeuthen，2012年). 因此，我们使用免疫组织化学方法检测3个月大的动物中的NKCC1。在对照组中，NKCC1在皮层灰质中均匀表达，仅保留神经元核。我们尝试使用Glt-1将NKCC1与精细的星形细胞过程共定位(图6一)作为共焦图像中的标记。然而，通过光学显微镜获得的分辨率不足以明确证明NKCC1和Glt-1之间存在重叠。然而，在β1中^−/−在小鼠中，我们发现在NeuN标记神经元的细胞体中增加了环状NKCC1标记(图7e（电子）). 我们没有观察到GFAP标记后星形胶质细胞胞体或主要突起中NKCC1水平增加(图7e（电子）).

神经元特异性KCC2的免疫组织化学显示，如前所述，该转运体在体周和突起内表达(Campbell等人，2015年). β1中^−/−动物KCC2的表达模式发生了变化，不仅在外围而且在神经元胞体内显示出更为弥散的标记(图7（f）).

总之，这些数据表明神经元NKCC1和KCC2蛋白在β1中的分布和水平发生了变化^−/−小鼠及其神经元具有不成熟表型。

在没有血脑屏障缺陷的情况下发生癫痫

据报道，癫痫动物模型和癫痫患者的血脑屏障破裂(Heinemann等人，2012年；2012年1月). 血脑屏障破裂后，血清因子沉积在脑实质中，仅此一点就可能引发炎症和星形胶质细胞增生，并引发癫痫发作(Seiffert等人，2004年；Adams等人，2007年；Schachtrup等人，2010年；Heinemann等人，2012年；2012年1月). 白蛋白沉积的一个作用是星形胶质细胞TGFRII激活，然后通过TGF-β介导的机制导致Kir4.1和Glt-1的下调(Frigerio等人，2012年). 很难解释这些血清因子是否直接或间接影响神经元兴奋性。

在我们的模型中，星形胶质细胞增生症发生在没有血脑屏障损伤的情况下(Robel等人，2009年)Kir4.1和Glt-1蛋白的稳定水平以及癫痫发作期间轻微的小胶质细胞激活反映了这一点。这表明星形胶质细胞增生本身足以诱发癫痫。

反应性星形胶质细胞的直接变化有助于癫痫的发生

星形胶质细胞对正常的脑内稳态至关重要。它们在细胞外空间内维持低浓度的钾和谷氨酸，并为神经元提供谷氨酰胺，谷氨酰胺是谷氨酸和GABA合成的必要前体。然而，在人类癫痫海马中，谷氨酸水平被发现是正常海马的五倍(库尔特和开斋节，2012年).

β1中^−/−患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠，我们发现Kir4.1钾通道和谷氨酸转运体的功能受损，但在癫痫发作期间其蛋白水平没有变化。谷氨酸转运蛋白的运输是谷氨酸正常摄取所必需的，关键依赖于细胞骨架(Sullivan等人，2007年；Sheean等人，2013年). 在反应性星形胶质细胞中，细胞骨架显著改变(Robel等人，2011年). 因此，尽管总蛋白水平正常，但由于转运蛋白定位不当，谷氨酸摄取可能会受到干扰。

在发育过程中，未成熟、增殖的星形胶质细胞尚未表达Kir4.1，因此其去极化RMP约为−50 mV(《赎罪与索尼默》，1995年；Bordey and Sontheimer，1997年). 随着大脑的成熟和星形细胞Kir4.1表达水平的增加(Nwaobi等人，2014年)星形胶质细胞的RMP约为−85 mV，非常阴性(Olsen和Sontheimer，2008年). 同时，原生质皮层灰质星形胶质细胞下调以去分化、未成熟状态表达的典型蛋白质，如GFAP（小鼠）、nestin、vimentin或tenascin-C和473HD，并退出细胞周期。然而，成年脑损伤后，反应性星形胶质细胞重新采用未成熟表型，并可重新进入细胞周期，与Kir4.1的缺失和细胞膜去极化同时发生(麦克法兰和Sontheimer，2000年；东岛和Sontheimer，2007年). 患有慢性星形胶质细胞增生症的小鼠表现出这些标记物的上调，但不会重新进入细胞周期(Robel等人，2009年). 因此，我们没有观察到Kir4.1蛋白丢失或膜去极化。尽管如此，慢性星形胶质细胞增生症小鼠对钡敏感的Kir4.1介导的钾电流降低。由于Kir4.1条件性敲除小鼠表现出应激诱导癫痫发作，这一点可能有助于癫痫的发生(Djukic等人，2007年).