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.2017年5月15日8:15321。
doi:10.1038/ncomms15321。

YAP通过控制黏着灶组装调节细胞力学

乔治娅·纳尔多 1, 豪尔赫·奥利弗·德拉克鲁斯 1, 简·弗斯基 1, 塞西莉亚·马提尼 1, 简·普里比尔 2, 彼得·斯科拉达尔 2, 马丁·佩舍尔 1 三, 吉多·卡鲁里 1, 斯蒂芬妮娅·帕利亚里 1, 法比亚娜·马蒂诺 1 三, 祖扎娜·马切科娃 4, 玛丽安·哈杜奇 4, 安德烈斯·桑兹·加西亚 5 6, 尼古拉·玛丽亚·普格诺 7 8 9, 戈拉兹·伯纳德·斯托金 1, 吉安卡洛·福特 1 10
附属公司

YAP通过控制黏着灶组装调节细胞力学

乔治娅·纳尔多等。 国家公社. .

摘要

河马效应器YAP/TAZ通过感知细胞外基质（ECM）组成和力学的变化，充当开关机械传感开关。Hippo通路的元件受局灶性粘连（FA）控制的分级模型描述了它们的活性调节。在这里，我们揭示了细胞扩散和RhoA GTPase活性通过YAP控制FA形成的分子机制，以稳定肌动蛋白细胞骨架对细胞膜的锚定。这种机制需要YAP共转录功能，涉及整合素和FA对接蛋白编码基因的激活。调节YAP转录活性可改变细胞力学、力发育和粘附强度，并决定细胞形状、迁移和分化。这些结果为YAP机械感觉活性的机制提供了新的见解，并将该河马效应器确定为细胞力学响应ECM提示的关键决定因素。

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数字

图1
图1。YAP核穿梭由细胞面积决定。
(一)培养在28，1.5的弹性支撑表面（ESS）上的AD-MSC的共焦图像 kPa或纤维连接蛋白和聚-L（左）-赖氨酸涂层玻片。用指示的抗体对细胞进行染色：抗病毒素（绿色）、抗YAP（红色）。F-actin用Alexa Fluoro 647磷灰石（白色）修饰，细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。图表：在ESS、纤连蛋白或poly培养的AD MSC中，每个细胞的FA数量（FA数量）、细胞面积和YAP核质/细胞质比率的量化-L（左）-赖氨酸(n个=10，3个技术复制，Mann-Whitney检验****P（P）<0.0001和**P（P）<0,001). (b条)300、1024、2025和10000个微晶玻璃载玻片上培养的单个AD-MSC的共聚焦分析 微米2并涂有纤维连接蛋白。细胞用抗YAP（红色）和抗黄芩素（绿色）染色。图：生长在纤维连接蛋白涂层表面上的单个AD-MSC中FA数量、总FA面积和YAP核质比的量化，粘附面积增加。右下：病毒素定量RT-PCR分析(VCL公司)、酵素(ZYX公司)，塔利班1(TLN1型)，塔利班2(TLN2型)，RHOA公司AD-MSC中的基因培养到10000与1024 微米2结果表示为两个独立实验中获得的平均折叠规则，条形图显示了s.d(c（c）)共聚焦图像和分析转染了小静脉或RFP-zyxin的AD-MSC，并对其进行YAP染色。F-actin用Alexa Fluor 647 Phalloidin（白色）装饰。图：转染细胞中YAP细胞核/细胞质比率和细胞面积的量化。(d日)左：微模式属性注释（细胞面积、粘附面积），纤维连接蛋白涂层微模式玻璃载玻片上单个细胞的侧视图示意图，微模式中纤维连连接蛋白分布的顶视图示意图。纤维结合蛋白覆盖区域用蓝色表示。中心：生长在抗病毒素（绿色）染色的微图案上的单个AD-MSC的共焦图像。右图：生长在用抗YAP染色的微图案上的单个AD-MSC的共焦图像（绿色）。在两个面板中，用抗纤连蛋白（白色）、Alexa Fluor 546 Phalloidin和DAPI对细胞进行染色。(e（电子）)图：在纤维连接蛋白涂层表面培养的单个细胞中FA数量、总FA面积和YAP核质比的量化。所有误差条均为标准差(n个=10，3个技术副本****P（P）<0.0001, ***P（P）<0.001和**P（P）<0.01，通过Kruskal–Wallis检验和事后Dunn检验进行多重比较计算）。
图2
图2。YAP根据AD-MSC中的细胞面积调节FA的形成和细胞刚度。
(一)左图：生长到300、1024、2025、10000的单个细胞的共焦分析 微米2涂有纤维连接蛋白或N-钙粘蛋白的微图案。右图：生长在10000个细胞上的单个细胞的三维重建 微米2细胞用：抗病毒素（绿色）Alexa Fluor 546 Phallolidin和4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。用编码控制短发夹RNA（CTR）、靶向YAP或TAZ的短发夹RNA（shYAP、shTAZ）的病毒颗粒感染细胞。(b条)图：单个AD-MSC、shYAP和shTAZ在涂有FN或PLL的微图案上的杨氏模量分析。数值显示为中位数±min/max(n个=24，3个技术重复，Kruskal–Wallis试验，然后是Dunn试验****P（P）<0.0001). (c（c）)文氏图显示通过定量PCR阵列获得的shYAP和shTAZ细胞中显著调节的基因之间的重叠（参见补充图3a）。(d日)用于转染的YAP（S127A，△PDZ）和TAZ（S89A，△304）突变体的示意结构。(e（电子）)转染了所示YAP和TAZ突变体的AD-MSC（左）和CAL51（中）中抗小病毒素（红色）和DAPI染色的局部粘附分布的共焦图像。右：AD-MSC和转染或未转染S127A YAP突变体的CAL51中vinculin表达的代表性图像分析。转染的AD-MSC用抗病毒抗体（红色）染色。用抗病毒素（红色）、Alexa Fluor 647 Phalloidin（白色）和DAPI对转染的CAL51细胞进行染色。转染细胞通过GFP表达进行鉴定，并用虚线突出显示。
图3
图3。YAP直接靶向CAL51细胞中的FA基因。
(一)热图表示CAL51细胞的三种独立制剂（A1、A2、A3）中YAP结合位点的一致富集。(b条)图：通过ChIP-Seek网络工具获得的YAP DNA结合位点的位置注释。表：YAP DNA结合位点的位置注释报告为绝对值。(c（c）)已知与YAP靶序列结合的最显著的转录因子的词云表示。字体大小与−log10呈负相关(P（P）值）。(d日)表：免疫沉淀染色质上7278个YAP靶点的基因功能注释及其各自P（P）-值。
图4
图4。YAP调节RhoA下游的黏附/细胞骨架完整性。
(一)通过归一化Δ表示RNA表达水平的热图C类t吨与CAL51 WT相比，YAP突变克隆C3的两个qRT-PCR非依赖复制获得的值(b条)图表：条形图，表示与CAL51 WT相比，YAP突变克隆C3中上调和下调基因的平均值±s.d.，其倍数变化高于2.0(c（c）)所示黏附灶（FA）蛋白的Western blot分析；n个=3. (d日)WT CAL51和YAP突变克隆C2a和C3的代表性共聚焦图像，显示长春花蛋白染色（绿色）。(e（电子）)WT CAL51和YAP突变克隆中指示细胞骨架和FA相关蛋白的蛋白质分析；n个=3. (（f）)图：WT CAL51和YAP缺陷克隆C3中细胞接触面积和杨氏模量的量化。数值显示为中位数±min/max(n个=24，3个技术复制品，韦尔奇t吨-测试***P（P）<0.001和****P（P）<0.0001,). (克)方框：WT CAL51和C3克隆通过ECM包被的transwell膜迁移的代表性明场图像（8 μm），24小时后用结晶紫染色 h、 量化如上图所示。数据表示平均值±标准差（12个随机字段，2个技术副本**P（P）<0.01和***P（P）<0.001，Kruskal–Wallis检验事后（post-hoc）邓恩测试）。底部：与对照组相比，对YAP突变细胞（C3）ECM重塑相关基因进行qRT-PCR阵列分析。阈值设置为2.0。右：CAL51 WT和YAP突变细胞C3在三维（3D）Matrigel中生长120的典型亮场图像 小时(小时)典型的共焦图像显示了F-actin在WT Cal51和突变克隆C2a和C3中的排列，用Alexa Fluor 546 Phalloidin染色。(我)WT CAL51和YAP突变克隆中G-actin/F-actin比率的代表性western blot定量。(j个)指示蛋白的代表性蛋白质印迹分析；n个=3. (k个)转染EGFP-RhoA-Q63L并用抗YAP抗体（红色）、Alexa Fluor 647 Phalloidin（白色）染色的WT CAL51细胞的典型共焦图像。图像分析显示未转染和转染细胞中YAP蛋白的核质分布。(我)转染EGFP-RhoA-Q63L的WT CAL51和突变克隆C3的共焦图像，并用抗小病毒抗体（红色）、Alexa Fluor 647 Phalloidin（白色）染色。
图5
图5。YAP通过αVβ3整合素控制细胞生物物理特性以及与ECM的相互作用。
(一)图：YAP突变细胞接触面积。转染YAP缺失细胞以表达指示蛋白，并评估转染细胞的接触面积，并与GFP转染细胞进行比较。(n个=26，3个技术副本****P（P）<0.0001，根据Kruskal–Wallis检验和事后Dunn检验计算）。条形图表示平均值±sd。(b条)转染αVβ1或αVβ3整合素的YAP缺失细胞的共焦代表性图像。细胞F-actin用Alexa Fluoro 647 Phalloidin（白色）染色，细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）复染。(c（c）)用αV（绿色）、β3（红色）或αVβ3整合素联合转染的CAL51突变细胞的共焦图像（红色和绿色联合染色）。双转染细胞用虚线突出显示。细胞用蜂窝状蛋白（白色）修饰，细胞核用DAPI（蓝色）复染。(d日)图：比较WT CAL51（灰色）和YAP突变克隆C3（浅灰色）的指示生物物理特性，转染或不过度表达所报告的蛋白质。单元格区域：n个=10，3个技术副本****P（P）<0.0001，通过Kruskal-Wallis检验和事后Dunn检验计算得出。条形图表示平均值±sd。表面能以对数表示。杨氏模量，表面能：n个=10，3个技术重复*P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001，通过Welch方差分析测试和事后Games-Howell测试计算得出。数值显示为中位数±min/max(e（电子）)提出YAP控制焦点粘附（FA）组件的模型。左图：细胞区控制RhoA活性以磷酸化cofilin（CFL1）并维持肌动蛋白纤维细胞骨架的完整性，从而触发YAP核穿梭。在细胞核中，YAP促进编码参与FA组装的蛋白质的基因转录。右图：当YAP丢失时，整合素亚单位发生重塑，从FAs和F-actin之间的间期移除对接蛋白，如vinculin、zyxin、ERM和VASP，细胞骨架对膜的锚定被破坏。所有误差条均为标准差。
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