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比较研究
.2006年10月25日；26(43):11162-73.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3260-06.2006。

小鼠亚历山大病相关胶质纤维酸性蛋白突变诱导罗森塔尔纤维形成和白质应激反应

特蕾西·哈格曼 1, 乔琳·X·康纳, 阿尔比·梅辛
附属公司
比较研究

小鼠亚历山大病相关胶质纤维酸性蛋白突变诱导罗森塔尔纤维形成和白质应激反应

特蕾西·哈格曼等。 神经科学. .

摘要

星形胶质细胞特异性中间丝，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的基因突变，导致罕见的白质营养不良亚历山大病（AxD）。为了研究这种原发性星形胶质细胞缺陷的病理学，我们制作了与人类中发现的错义突变同源的敲入小鼠。在本报告中，我们发现GFAP-R76H和-R236H突变的小鼠发育出Rosenthal纤维，这是AxD、海马、胼胝体、嗅球、顶下和心室周围区域的星形胶质细胞中观察到的标志性蛋白聚集体。这些区域的星形胶质细胞表现出反应性，GFAP总表达升高。虽然一般的白质结构和髓鞘形成似乎正常，但当与抗氧化反应元件报告基因系杂交时，突变小鼠表现出一种独特的报告基因诱导模式，在胼胝体中尤为突出，组织化学染色显示铁在同一区域积聚。突变小鼠的寿命正常，没有明显的行为缺陷，但更容易受到红藻氨酸诱导的癫痫发作的影响。尽管这些小鼠自身表现出GFAP表达增加，但通过与GFAP转基因动物杂交进一步提高GFAP，导致GFAP溶解度发生变化，应激反应增加，最终导致死亡。这些小鼠并没有显示出人类婴儿AxD中观察到的全谱病理学特征，但可能更接近成人型的疾病。这些研究提供了将GFAP突变与Rosenthal纤维和氧化应激联系起来的正式证据，并将胶质增生症和GFAP蛋白水平与疾病的严重程度联系起来。

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数字

图1。
图1。
GFAP敲除小鼠的产生。基因靶向载体设计为与人类中发现的两种突变R79H和R239H同源的突变。A类小鼠GFAP基因的基因组组织如上所示，外显子显示为实数框。靶向载体由6.5kb的巴姆包含启动子和外显子1至6的HI片段。人类突变的等效位置分别显示为外显子1和4中的R76和R236。相关限制场所包括巴姆HI片段和英国标准时间还显示了用于插入loxP侧翼新盒式磁带（深灰色盒子）的BI位置。疱疹病毒TK基因与基因组相邻巴姆HI碎片（浅灰色方框）。与靶向载体的同源重组将在指定密码子内引入单碱基突变。这个巴姆HI（高）/生态用于筛选重组靶向ES细胞的RI探针如下所示，内含子6与相应的生态基因组（6.5 kb）与靶向（4 kb）等位基因的RI片段。通过将GFAP突变小鼠与表达Cre重组酶的转基因小鼠杂交，移除新盒。最后的基因结构保留了引入的突变和内含子3中剩余的loxP位点（箭头）。B类，对不同构建体的靶向ES细胞的Southern印迹分析显示预期生态同源重组后的RI片段：野生型等位基因给出6.5 kb的带（1、3道），而R76H系显示4 kb的等位基因（2道），R236H系显示2 kb的等位基因（4道，neo盒以相反方向克隆到该载体中）。C类杂合子GFAP突变体和与GFAP敲除小鼠杂交的突变小鼠的Western blot分析显示突变等位基因的表达。A+表示野生型等位基因；−表示空等位基因。D类R236H/+小鼠在3个月龄时，与野生型同窝雄性和雌性小鼠相比，体重显著下降。与野生型相比，在R76H/+雄性小鼠中也观察到减少。n个每组≥10。误差条指示SD。
图2。
图2。
H&E染色显示GFAP突变小鼠的Rosenthal纤维。罗森塔尔纤维在海马体、胼胝体、吻侧移行流、嗅球、脑室周围、血管周围和软脑膜下区域尤为常见。A类,B类，心室周围白质，如R76H/+所示(A类)和R236H/+(B类)3个月大的小鼠表现出显著的罗森塔尔纤维蓄积（箭头所示为A类).B类插图，电子显微镜显示，罗森塔尔纤维是一种致密的嗜锇聚集物，具有相邻的中间丝状漩涡。C类在野生型小鼠中从未发现罗森塔尔纤维。D类，如R236H/+小鼠（3个月）所示，海马体中的星形胶质细胞（如图所示为齿状回）也充满了罗森塔尔纤维。
图3。
图3。
GFAP突变小鼠中GFAP和反应性星形胶质细胞与泛素化Rosenthal纤维的表达增加。A–F脑室周围白质中GFAP免疫组化(A–C)和海马(D–F型)R76H/+的(B类,E类)和R236H/+(C类,F类)与野生型小鼠相比，小鼠（3个月）的反应性星形胶质细胞中GFAP表达增加(A类,D类). Rosenthal纤维明显为以GFAP免疫反应为界的嗜酸性聚集物，尤其在脑室周围白质中(C类).G–L，内皮素B受体的免疫荧光标记显示R236H/+的星形胶质细胞表达增加(J–L型)与野生型小鼠相比(G–I型)，表示反应状态。GFAP免疫染色为红色(G公司,J型)，内皮素B受体标记为绿色(H（H）,K（K）)，并将图像合并以显示同位化(我,L（左）)（40×目标）。插图中显示了一个反应性星形胶质细胞(J–L型)放大倍数增加（60倍物镜）。M–O型R236H/+小鼠的免疫组织化学染色（深蓝色颗粒）显示，靠近海马的侧脑室附近的Rosenthal纤维大量泛素化(N个,O（运行）)与野生型相比(M（M）)3个月大时。N个和O（运行）是放大倍率增加的同一节的图像。(M（M）,N个，40×物镜；O（运行），100×目标）。
图4。
图4。
GFAP在突变小鼠中的表达。A类脑转录物的定量实时PCR分析显示，R76H/+和R236H/+杂合小鼠的GFAP表达水平增加。B类,C类，为了进行蛋白质定量，将脑裂解物分离成可溶性(B类)和不溶物(C类)ELISA的组分。D类，用所示基因型小鼠定量的GFAP表示为每毫克蛋白质的平均GFAP纳克，+/−SD（倍数变化，突变表达与野生型的比率）。R76H/+小鼠两种组分的GFAP均增加1.5倍(D类)而R236H/+突变体显示，与可溶性GFAP增加两倍相比，不溶性GFAP增加了3.7倍(D类). 所有实验在8周时与雌性小鼠进行三次。与野生对照动物相比：*第页< 0.05; **第页< 0.01; ***第页< 0.001. 错误条指示SD。
图5。
图5。
GFAP突变小鼠的正常白质结构和MBP表达。A类,B类，R236H/+小鼠髓磷脂的组织化学染色(B类)与野生型小鼠相比，显示出正常的解剖结构(A类)3个月大时。C类，野生型（WT）和R236H/+小鼠的前连合（a.c.）面积测量结果没有差异(n个=15只野生型和11只R236H/+小鼠）。D类进行半定量Western blotting，比较P21早期点R236H突变体和野生型同窝伙伴的MBP水平。前四个通道显示野生型和R236H/+蛋白的示例（50μg/通道）；最后四条泳道代表了用于生成肌动蛋白与MBP标准曲线的样本，泳道上方显示了蛋白质数量。18.8或21.5 kDa亚型没有发现显著差异(t吨测试，n个=8只21天大的雌性）。误差条指示SD。
图6。
图6。
R236H/+小鼠的应激反应和白质铁蓄积。A类,B类，GFAP突变小鼠与ARE-hPAP转基因报告系杂交。组织化学染色检测到通过ARE诱导hPAP表达（见材料和方法），表明细胞应激反应。A类，野生型GFAP；ARE-hPAP转基因小鼠（wt）表现出很少或没有碱性磷酸酶活性，如缺乏蓝色染色所示。B类ARE-hPAP转基因阳性的R236H/+小鼠在胼胝体、海马、嗅球、嘴侧移行流和顶下区域有报告表达（显示3个月大）。C类GFAP免疫组织化学染色（棕色）显示海马裂附近的星形胶质细胞与hPAP活性（紫色）共定位（R236H/+；100×objective）。D类、R76H/+和R236H/+小鼠的应激反应随年龄增加而增加。来自R76H/+的脑匀浆；ARE-hPAP和R236H/+；用化学发光法分析1周龄至6个月龄ARE-hPAP小鼠的碱性磷酸酶活性。与野生型小鼠相比，从2周开始，R76H/+和R236H/+品系的报告活性显著增加(第页<0.005），随着年龄的增长，这一数字继续增加。到6周时，R236H/+小鼠的报告活性比R76H/+增加(第页<0.01）以及野生型小鼠。误差条代表SD。E类,F类GFAP突变小鼠白质星形胶质细胞中的铁蓄积也很明显。E类，在野生型小鼠中，铁染色主要突出少突胶质细胞，而在R236H/+小鼠中(F类)，胼胝体和其他与Rosenthal纤维形成和应激反应相一致的区域（6周龄；矢状切面；CA3，海马；fi，伞；cc，胼胝质）可观察到异常铁蓄积。
图7。
图7。
R236H/+小鼠对红藻氨酸诱导癫痫发作的敏感性增加。A类，每隔5分钟对注射20 mg/kg红藻氨酸的动物的癫痫严重程度进行评分。与野生型小鼠相比，R236H/+小鼠在注射后3小时内癫痫发作的严重程度显著增加(第页<0.0001，双向方差分析*第页<0.05，Bonferroni后测；误差条表示SEM）。B类，记录R236H/+小鼠和对照组在观察期间的最大发作得分。较高比例的突变小鼠获得5分或更高的癫痫发作分数(*第页=0.0138，Fisher精确测试）。C–H型标准H&E染色海马组织化学分析(C–E类)或FluoroJade B染色(F–H（飞行高度）)显示严重癫痫评分≥5的动物CA1和CA3（CA1显示）中的细胞死亡(E类,H（H）)（显示R236H/+），与最大癫痫评分<5的动物相比，无论基因型如何，均无细胞死亡(C类,F类，野生型；D类,G公司，R236H/+）。n个=每个基因型20个（10个雄性，10个雌性，3个月大）。
图8。
图8。
GFAP转基因（野生型蛋白水平升高）与GFAP点突变相结合会导致死亡。当GFAP突变小鼠与GFAP转基因株Tg73.7（GFAP）杂交时TG公司)其过度表达野生型人类GFAP，所有携带转基因和R76H/+或R236H/+突变的后代在～30天龄时死亡。单转基因和单突变窝友存活率为100%（至少90天）。括号中的数字表示针对每个基因型评估的小鼠数量。
图9。
图9。
R236H/+中不溶性GFAP水平升高和应激反应增加；GFAP公司TG公司老鼠。A类,B类、野生型大脑、R236H/+、GFAPTG公司和R236H/+；GFAP公司TG公司通过ELISA在P24处对动物进行分析，以定量可溶性GFAP蛋白水平(A类)和不溶物(B类)池。D类、GFAPTG公司与突变小鼠相比，小鼠的可溶性和不溶性GFAP以及R236H/+均增加；GFAP公司TG公司与GFAP相比，不溶性GFAP额外增加TG公司动物。C类，R236H/+；GFAP公司TG公司小鼠具有增加的CNS应激反应。脑匀浆取自与GFAP杂交的R236H/+小鼠的后代TG公司用ARE-hPAP报告基因转基因小鼠量化P25的应激反应。R236H/+中的报告者活动；GFAP公司TG公司小鼠比R236H/+小鼠的反应增加(*第页= 0.02). R236H/+和GFAP之间报告者活动的差异TG公司小鼠和GFAPTG公司小鼠和R236H/+；GFAP公司TG公司小鼠不显著。n个=每组4人*第页< 0.05; ***第页< 0.001. 误差条指示SD。
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