肿瘤转移中的上皮-间充质转化

摘要

1 介绍

转移级联是一个复杂、低效但致命的过程，目前正在进行深入研究，以期消除远处传播并降低癌症相关死亡率。在肿瘤转移过程中，静止的上皮源性肿瘤细胞必须首先迁移和侵袭，以便从原发肿瘤扩散并进入循环。在运输过程中存活下来后，一些循环肿瘤细胞（CTC）设法从血管系统中渗出并开始远处转移定植。在远处，播散的肿瘤细胞需要适应新的微环境，创造一个支持转移的生态位，并从迁移模式转换到增殖模式，以产生大转移。

促进静止肿瘤细胞迁移和侵袭的一个关键事件是上皮-间充质转化（EMT）计划。过去15年来的大量工作将EMT带到了转移研究的前沿。本综述旨在总结和强调EMT在转移级联中的作用的关键证据，这些证据来自于使用人类癌症细胞系、癌症小鼠模型和临床人类癌症组织的研究。将介绍每种方法的相关挑战和注意事项，以解决目前关于EMT在转移中的争议。

2 EMT概述

EMT程序最初被描述为胚胎发育中形态发生的一个组成部分，后来在几个发病事件中观察到，包括伤口愈合、纤维化和癌症转移。EMT项目的特征是粘附连接和根尖-基底极性的丧失，间充质表型的获得，运动性和侵袭性的增强（Nieto，2013). 上皮细胞的特征是通过粘附分子（如E-cadherin和细胞角蛋白）在紧密连接、粘附连接、桥粒和缝隙连接中进行完整的细胞-细胞相互作用。顶-底极性也是上皮的一个关键特征。为了响应各种细胞外和组织特异性EMT诱导信号，上皮细胞上调一组EMT诱导转录因子，以协调EMT期间的所有形态、细胞和分子变化。由于这篇综述的重点是EMT在肿瘤转移中的作用，我们简要总结了EMT在癌症中的关键分子调控因子。

在某些生理条件下，各种发育信号通路，如TGF-β、WNT、NOTCH和生长因子受体酪氨酸激酶，都参与了EMT的诱导。肿瘤生长因子β（TGF-β）是一种由肿瘤细胞和基质成纤维细胞在肿瘤微环境中分泌的细胞因子，被认为是EMT（Katsuno等.,2013). 与EMT诱导相关的其他信号转导途径是炎症细胞因子，如通过NF‐κB的TNF‐α（Wu等.,2009)和IL-6/STAT途径（Lo等.,2007); 缺氧通过HIF‐1α（阳等.,2008); 和细胞外基质（ECM）刚度（Wei等.,2015).

为了响应各种EMT诱导线索及其下游信号通路，EMT转录因子（EMT-TF）被激活以协调EMT程序。主要EMT‐TF包括SNAIL家族锌指转录因子（SNAIL1和SNAIL2）、TWIST家族基本螺旋-环-螺旋转录因子（TWIST1和TWIST2）以及锌指E‐box结合同源盒蛋白（ZEB1和ZEB2）。SNAIL和ZEB转录因子超家族能够与E-cadherin启动子中的E-box序列结合以抑制转录（Batlle等.,2000; Comijn公司等.,2001). SNAIL和ZEB家族成员也被证明下调紧密连接蛋白，包括闭塞素、克劳丁、ZO‐1和连接蛋白JAM1/A（Bax等.,2011; 池内等.,2003; 马丁内斯·埃斯特拉达等.,2006; Ohkubo和Ozawa，2004; 范德维尔等.,2005). 另一方面，TWIST家族成员通过在果蝇和人类中诱导SNAIL转录因子来抑制E-cadherin的表达（Fang等.,2011; 佩雷斯-莫雷诺等.,2001; 杨等.,2004). 此外，已发现TWIST1可诱导入侵二磷酸介导的基质降解，从而促进EMT期间基底膜的降解（Wei等.,2015).

上皮-间充质转换转录因子激活导致编码上皮连接蛋白的基因下调，从而破坏粘附连接、桥粒和紧密连接，并失去顶端-基底极性（秦等.,2005). 由于这些连接不仅提供上皮结构支持，还通过其相关蛋白调节许多信号通路，因此上皮连接的变化影响许多下游通路，可能进一步促进EMT和侵袭。例如，粘附连接处释放的β-catenin可能会进入细胞核，从而驱动WNT靶基因表达增强EMT（Howard等.,2011).

同时，间充质基因如N‐钙粘蛋白、纤维连接蛋白、波形蛋白的表达上调（Porta‐de‐la‐Riva等.,2011). 特别是，许多对细胞迁移至关重要的非上皮钙粘蛋白和细胞表面蛋白的表达增加。随着固定在上皮细胞桥粒上的细胞角蛋白网络被解构，波形蛋白的上调导致皮质肌动蛋白细胞骨架重组为中间丝的细胞质和基底网络（Beaty和Condeelis，2014). 这种向间充质状态的转变有助于细胞运动和形成新的膜突起，例如用于基质降解的入侵足。肌动蛋白应激纤维也形成并增加细胞收缩力。最后，细胞突起增加和金属蛋白酶（MMPs）的表达导致ECM降解、细胞迁移和侵袭行为（Eckert等.,2011; 梁朝伟（Leong）等.,2014).

EMT程序也受多种调控途径控制，如miRNA（miR-200和miR-34）、长非编码RNA和翻译后修饰（Xu等.,2016). EMT‐TF表达的负调控因子，如OVOL、GRHL2和ELF5，分别直接抑制ZEB1和SNAIL2的转录（Chakrabarti等.,2012; 谢普利等.,2012). miR‐200家族成员已被证明与ZEB1和ZEB2形成负调节环，并能够调节上皮和间充质状态之间的可塑性（Burk等.,2008; 格雷戈里等.,2008; 科尔帕尔等.,2008; 公园等.,2008). GSK3β或MAP激酶磷酸化后泛素介导的蛋白酶体降解SNAIL1和TWIST1是EMT-TF调节的另一种机制（Hong等.,2011; 周等.,2004).

总之，EMT是一个高度复杂和动态的过程，有许多重叠的路径，可以同时发挥其调节臂来协调下游事件（图1). 因此，EMT程序不仅仅是一个二进制过程，而是一个处于过渡状态的可逆细胞状态谱。通常，上皮细胞会经历部分EMT，并呈现部分上皮或间充质状态。EMT在癌症中的这一特性对其在肿瘤转移中的作用具有重要意义，这将在下面的章节中详细讨论。

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图1

原发性上皮性肿瘤细胞经历上皮-间充质转化(电子病历)获得从原始位置传播并迁移到周围基质的能力，并将其注射到循环中。少量循环中的肿瘤细胞和细胞簇在血管系统中存活，并最终渗出到远处的器官，如肺。播散的肿瘤细胞在经历间充质-上皮转化之前可能会保持休眠状态一段时间(遇见)增殖并形成大转移。

3 肿瘤细胞系的EMT研究

EMT与肿瘤发生之间的联系首次在晚期上皮癌细胞系中发现。反义RNA或E钙粘蛋白抗体下调E钙粘素的表达或功能，导致乳腺、肺、膀胱、胰腺上皮肿瘤细胞系（Frixen等.,1991; 弗莱明克斯等.,1991). 此外，浸润性癌细胞系中E-cadherin的重新表达降低了其侵袭能力在体外（弗里森和纳加明，1993; 波尔等.,1998; 弗莱明克斯等.,1991). 随后，TGF-β被发现可以将具有上皮形态的小鼠乳腺上皮NMuMG细胞转化为侵袭性成纤维细胞表型，成为一种主要的EMT诱导细胞因子。形态学变化还与经典EMT标记的变化相结合，包括E-cadherin表达减少和波形蛋白（Oft）表达增加等.,1996). 进一步研究表明，TGF‐β能够在多种细胞系中诱导EMT，如Ras转化的乳腺上皮细胞（EpRas）和小鼠结肠癌hnPCC细胞（Miettinen等.,1994; Oft公司等.,1998). 重要的是，用显性负II型TGFβR、中和TGFβ抗体或间充质小鼠结肠癌CT26细胞系中的可溶性受体变体抑制TGFβ途径可减少在体外肿瘤异种移植物（Oft）的侵袭性和转移形成等.,1998). 这些研究表明EMT和转移之间存在可信的联系。然而，由于TGF-β的众多生物学功能，在这些研究中很难确定TGF-α在转移中的关键作用是由于EMT。

2000年，两个研究小组独立确定SNAIL1为EMT‐TF，直接与E-cadherin启动子结合并控制E-cadherin基因表达。乳腺癌细胞系中SNAIL1的过度表达导致E-cadherin介导的细胞-细胞粘附丧失，从上皮细胞纺锤体形态到间充质纺锤体形态发生显著变化，迁移和侵袭表型（Batlle等.,2000; 卡诺等.,2000). 随后的研究表明，SNAIL1也能在各种上皮癌细胞系和原发性乳腺癌细胞中诱导EMT（穆迪等.,2005). 此外，将SNAIL1移植到裸鼠体内后，在Neu驱动的原发乳腺肿瘤移植物中的过度表达导致肿瘤复发率增加（Moody等.,2005). 在肿瘤转移中发现了另一种EMT-TF，即TWIST1，从而确立了EMT‐TF与肿瘤转移的直接联系。发现TWIST1通过SNAIL2诱导的E-cadherin抑制（Casas）诱导EMT等.,2011)并通过诱导侵入虫（Eckert）促进基质降解等.,2011). 乳腺癌4T1细胞中TWIST1表达的下调抑制了4T1癌细胞从乳腺向肺转移的能力。总之，这些数据将EMT研究带到了转移领域的前沿。

许多后续研究进一步强化了EMT‐TF对细胞系转移是必要的这一概念。在头颈部细胞系中，TWIST1被发现是HIF-1α的重要下游靶点，在尾静脉注射或原位移植HIF‐1α过表达的下咽癌细胞系（Yang等.,2008). 有趣的是，ECM僵硬是一种机械传感信号，它通过TWIST1激活EMT并导致肿瘤侵袭和转移增加（Wei等.,2015). 整合素依赖的机械转导途径的激活是为了响应ECM的硬化，通过从TWIST1的细胞质锚定G3BP2释放TWISTl，从而诱导TWISTI的核转位。此外，TWIST2的核移位促进了乳腺肿瘤异种移植模型的侵袭和肿瘤转移。另一方面，僵硬也导致乳腺癌细胞和癌相关成纤维细胞中通过Rho相关的含有蛋白激酶（ROCK）和ERK2通路（Zhang等.,2016).

总之，对各种肿瘤细胞系的研究确立了EMT与转移之间的第一个直接联系。利用2D和3D培养进行基因操作和表型评估，确定了EMT调节因子在侵袭中的作用，并证实了其在小鼠肿瘤异种移植物转移中的作用。同样重要的是，在肿瘤细胞系中进行的大量机制研究揭示了调节EMT的复杂遗传网络，并确定了潜在的关键治疗靶点。然而，EMT在癌细胞系中的研究也有其不足。在大多数2D培养系统中，由于缺乏顶端-基底极性，无法研究上皮极性的丧失。尽管3D培养系统可以部分再现肿瘤组织结构，但时间依赖性的肿瘤进展不能轻易再现在体外在小鼠体内植入乳腺癌细胞系可有效验证EMT在促进转移方面的功能。然而，大多数使用的肿瘤细胞系固定在上皮或间充质状态，部分原因是在体外培养条件；因此，使用这些细胞很难解决肿瘤转移过程中EMT程序的可塑性（Francia等.,2011; 普拉特等.,2010).

4 工程小鼠模型的EMT研究

为了直接探讨EMT在肿瘤进展和转移中的作用，基因工程小鼠模型已被用于确定原代肿瘤细胞中是否存在EMT，并测试EMT在转移中的需求体内.直接体内EMT在转移中的证据最初在转基因小鼠模型中得到证实，在胰腺癌转基因小鼠模型（Perl等.,1998). 在主要由PyMT（多瘤病毒中间T抗原）或MMTV‐Neu（Erbb2）致癌基因驱动的转移性乳腺癌模型中，原发肿瘤的基因表达谱大多为“管腔样”或上皮性基因表达特征，只有罕见的间充质表型细胞（Herschkowitz等.,2007). 与携带FSP1表达零等位基因的PyMT转基因小鼠的乳腺癌细胞相比，表达间充质标记物FSP1（成纤维细胞特异性蛋白1）的移植MMTV‐PyMT肿瘤细胞产生更多的肺转移（Xue等.,2003). 这些发现表明，接受EMT治疗的肿瘤细胞具有更高的转移倾向。

一系列标记表达EMT-TF的肿瘤细胞的研究支持了EMT-TFs在肿瘤细胞传播中的作用。瑞姆等观察到在KPC胰腺癌小鼠模型（Rhim）的侵袭性肿瘤细胞和CTC中发现了表达ZEB1的肿瘤细胞等.,2012). 此外，使用黄色荧光蛋白（YFP）标记的内源性SNAIL1（SNAIL-YFP等显示SNAIL1表达与EMT和转移潜能直接相关。随着肿瘤的进展，SNAIL‐YFP阳性细胞逐渐获得基础CK14表达，失去管腔CK8表达，EMT‐TF和间充质标记物表达水平升高，并且在类器官实验中变得更具攻击性。当通过尾静脉注射或皮下植入（Ye等.,2015)，它们也形成了明显更多的转移。

为了直接测试EMT‐TFs在驱动转移中的重要作用，Tran等在MMTV‐PyMT小鼠的乳腺中特异性地删除了SNAIL1基因，发现SNIAL1的缺失抑制了EMT并显著降低了肺转移（Tran等.,2011). 进一步支持TWIST1促进EMT和肿瘤侵袭的观点是，发现TWIST1基因的一个等位基因的缺失完全阻断了联合和12-O-十四烷酰基激素-13-乙酸酯（DMBA/TPA）皮肤肿瘤模型中良性乳头状瘤向侵袭性鳞状细胞癌的转化（Beck等.,2015). 相反，郑最近的一项研究等使用胰腺上皮细胞特异性PDX1启动子删除KPC（Kras）中的SNAIL1或TWIST1^{LSL。G12D系列/+}; 第53页^172H兰特/+; Pdx1‐Cre）基因工程小鼠胰腺导管腺癌模型，发现SNAIL1或TWIST1的缺失不会导致转移潜能和CTC数量的任何显著差异，而是增加了对吉西他滨治疗的敏感性（郑等.,2015). SNAIL1或TWIST1缺失对转移缺乏影响的一个可能解释是，在KPC肿瘤模型中，多个EMT‐TF在诱导EMT方面具有冗余功能。具体而言，ZEB1在该肿瘤模型（Rhim等.，引文），除SNAIL1和TWIST1外，还可作为一种替代EMT诱导转录因子促进转移。

关于EMT在肿瘤转移中的作用的一个主要争议是，病理学观察表明，癌转移灶主要表现为上皮表型和形态，似乎没有经历间充质转化。然而，这一发现与EMT转移假说并不矛盾，因为Brabletz长期以来一直假设EMT是转移过程中的可逆程序等. (2005)和Thiery(2002). 他们提出，癌细胞启动EMT程序侵袭并扩散到远处，但它们将通过间充质-上皮转化（MET）恢复到上皮状态，从而在远处器官中产生二次生长。利用诱导系统，一些研究已经解决了部分或暂时性EMT对转移的影响。

这是首次在诱导型TWIST1小鼠模型（Tsai等.,2012). 由于在侵袭性人类乳腺肿瘤样本中发现内源性核TWIST1，但在远处转移病灶中未发现，因此验证了TWISTl可能在原发肿瘤与远处转移中动态调节的假设。使用DMBA‐TPA致癌物诱导的皮肤肿瘤小鼠模型，Tsai等证明在原发肿瘤部位诱导TWIST1能有效促进良性乳头状瘤向侵袭性鳞状细胞癌的转化。作为对TWIST1诱导的反应，肿瘤细胞经历EMT，通过基底膜侵入，大量循环肿瘤细胞（CTC）扩散到血液循环中。重要的是，在到达远处器官的肿瘤细胞中持续诱导TWIST1不会导致大转移增加。相反，关闭TWIST1表达，导致远端EMT逆转，产生大量转移性结节。

与可逆EMT在TWIST1驱动转移中的重要性一致，内源性SNAIL1表达在原发性肿瘤侵袭前沿的细胞和CTC中受到限制，但在多基因小鼠乳腺癌模型（Tran等.,2014). 通过将内源性SNAIL1报告子与诱导性SNAIL1转基因，Tran等结果表明，SNAIL1的瞬时表达对大转移的形成至关重要，而SNIAL1的持续表达导致肺转移的数量显著减少。总之，使用可诱导TWIST1和SNAIL1小鼠的独立研究支持体内EMT‐TFs时空调控的发生及其对转移级联的重要影响。

上述条件小鼠模型使我们了解了EMT可塑性在转移级联中的重要性。播散的癌细胞似乎对EMT‐TF以及上皮和间充质基因的表达有严格的调节。然而，诱导小鼠模型依赖于EMT‐TF的过度表达，因此，这种超生理水平的EMT‐的TF可能会产生意想不到的额外效应。研究转移中动态EMT的另一种方法是进行谱系追踪实验，试图揭示EMT是否确实发生在最终导致远处转移的肿瘤细胞中。为了实现这一目标，驱动Cre表达的EMT启动子需要在大多数（如果不是所有）原发性乳腺肿瘤中短暂经历EMT激活的肿瘤细胞中表达体内更重要的是，这种EMT启动子必须足够强大，才能激活大多数（如果不是所有）短暂经历EMT的肿瘤细胞中的报告基因激活。鉴于EMT程序的瞬时性和可塑性，这种强大而特异的EMT报告基因很难建立，但已经尝试过了。

Trimboli的第一个血统标记研究之一等选择FSP1启动子是因为FSP1在某些条件下在EMT期间被诱导。他们开发了一种FSP1‐Cre转基因小鼠，其中Cre重组酶的表达由FSP1启动子（FSP1‐Cre-BGH）的3.1kb片段驱动，并将该小鼠模型与三种不同的致癌基因驱动的乳腺肿瘤模型（WAP‐Myc、MMTV‐PyMT和MMTV‐Neu）杂交在远处肺转移瘤（Trimboli）中寻找EMT激活等.,2008). 令人惊讶的是，在WAP‐Myc小鼠模型中，仅在少量绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞中观察到FSP1启动子激活的X‐gal信号，而在MMTV‐PyMT或MMTV­Neu小鼠中未观察到X‐ga信号。作者得出结论，Myc驱动的乳腺肿瘤具有高EMT特征。

最近，使用不同的FSP1‐Cre转基因小鼠系Fischer等在MMTV-PyMT和MMTV-Neu小鼠中进行了类似的血统追踪实验。有趣的是，他们能够观察到通过上述FSP1-Cre转基因开启GFP的原代肿瘤细胞。此外，他们还报告了GFP阳性CTC的显著富集（可能是经历EMT的细胞）。然而，在由此产生的远处转移病灶中未观察到GFP阳性肿瘤细胞的富集（Fischer等.,2015). 因此，他们得出结论，EMT对于转移是不必要的。这两项研究使用相似的FSP1启动子在相同的PyMT和Neu小鼠模型中对进行EMT的谱系追踪细胞进行了研究，得出的不同结果表明，用于这些研究的Cre驱动程序可能负责对预期细胞进行差异标记。

利用E-cadherin的表达和定位作为报告者开发了一种额外的EMT传感器，以通过活体显微镜（Beerling）观察MMTV‐PyMT小鼠模型乳腺肿瘤中的EMT等.,2016). 使用该模型，作者发现，失去膜E‐钙粘蛋白并呈现间充质表型的肿瘤细胞，可能经历了EMT，能够迁移体内而其上皮对应物并非如此。在循环中，发现E-cadherin缺失的肿瘤细胞比例稍高。有趣的是，尽管一到两个播散性肿瘤细胞的微转移显示出部分EMT表型，但三个或更多细胞的播散性细胞簇仅显示E‐钙粘蛋白，这表明在远处发生表型转换或MET，以形成大转移。

谱系追踪实验的主要挑战是驱动Cre的谱系追踪启动子的可靠性。鉴于上皮和间充质标记表达的光谱和可塑性，这一点尤其困难，而基于单个基因表达的细胞追踪所采用的固有二元谱系标记策略很难捕捉到这一点。特别是，可逆EMT假说表明，部分EMT状态而非完全EMT状态更有可能与更高的侵袭性、可塑性和肿瘤引发特性（Jolly等.,2015). 鉴于部分和可塑性EMT在转移中的关键作用，使用更敏感的EMT报告子进行进一步研究对于解决EMT在转移中的作用至关重要。

5 人体肿瘤样本中EMT的证据

人类肿瘤中EMT的公开证据是最难获得和解释的；因此它是关于EMT在转移级联中的临床相关作用的有争议的争论的最大来源（Ledford，2011; 塔林等.,2005). 一个主要挑战是，传统的组织病理学分析无法通过形态学或免疫组织化学分析区分经历EMT的上皮癌细胞和丰富的基质成纤维细胞。更为复杂的是，转移过程中的短暂可逆EMT过程使得在人类肿瘤样本中捕获处于过渡期的细胞变得困难。

除小叶性乳腺癌和弥漫性胃癌外，单个原发癌中只有少数肿瘤细胞表现出E-cadherin表达异常或缺失（Becker等.,1994; Berx公司等.,1995). 然而，许多临床研究支持这样的观点，即EMT基因特征基于间充质标记物（如vimentin、N‐cadherin、fibronectin）的表达与免疫组织化学或组织芯片（Aleskandarany等.,2014; 线路接口单元等.,2013; 尼塔等.,2014; 萨里奥等.,2008; 臧等.,2013). 预后不良的某些癌症亚型（即基底样、克劳丁低亚型乳腺癌）具有强烈的EMT特征（Liu等.,2013; 萨里奥等.,2008; 陶布等.,2010). 最近的荟萃分析显示，在3218例晚期乳腺癌患者中，EMT‐TFs（SNAIL1、SNAIL2和TWIST1）的表达与3年总生存率呈正相关（HR 1.72，95%CI=1.53–1.93）（Imani等.,2016). 除乳腺癌外，TWIST1和SNAIL的表达水平也与肺部、胃肠道、肝胆道、头颈部的不良预后有关，38项研究中4938名患者的荟萃分析显示，TWIST1或SNAIL1高表达患者的总生存率较差（HR=2.07，95%CI 1.63-2.63；HR=1.63，95%CI 1.33-1.99）（Zhang等.,2014). EMT‐TFs，如TWIST1，也被发现在原发肿瘤侵袭前沿具有最高侵袭和转移潜能的肿瘤细胞亚群中高度表达，进一步支持了EMT在转移级联中的重要性（Celesti等.,2013). 最后，EMT‐TFs的表达与治疗的病理反应呈负相关，表明其在化疗耐药中起作用（Creighton等.,2009; 农民等.,2009).

EMT在转移中作用的最直接证据来自对癌症患者CTC的分析。通过对CTC的分析，可以研究具有迁移和侵袭特性的人类肿瘤细胞。乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌和肺癌患者中CTC的存在是一个不良预后因素，支持肿瘤细胞侵袭和扩散在转移形成和不良临床结果中的作用和要求（Cristofanili等.,2004; 戈德科恩等.,2014; 汉族等.,2014; 黄等.,2013; 詹尼等.,2016; 卢奇等.,2012; 拉巴里等.,2010). 如上所述，转移中的EMT可塑性确实反映在小鼠肿瘤模型和人类患者（Celiá‐Terrassa）的CTC中等.,2012; 济等.,2012). 上皮和间充质基因在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、胃癌、肝癌和肺癌患者的CTC中共同表达，而相应的原发肿瘤很少同时表达这两种标记物（Armstrong等.,2011; 吴等.,2015; 于等.,2013). 此外，与早期癌症患者相比，晚期癌症患者中表达TWIST1、SNAIL1或vimentin的CTC比例更高，这表明这些细胞可能在疾病进展过程中占优势，并有助于转移性生长（Aktas等.,2009; 巴里埃等.,2012; 佐丹奴等.,2012; 卡勒基等.,2011; 帕帕达基等.,2014; 吴等.,2015). 事实上，通过qRT‐PCR检测TWIST1或SNAIL1的过度表达来检测接受EMT的CTC的存在，可以预测早期疾病复发（Mego等.,2012). 在肝细胞癌患者中，CTC中EMT表型的获得，如TWIST1和波形蛋白的表达，与疾病进展和转移形成增加有关（Li等.,2013). 此外，间充质CTC的存在与乳腺癌、肺癌和结直肠癌（Kallergi等.,2011; 萨泰利等.,2014; 多哥等.,2014; 于等.,2013). 使用多重肿瘤和EMT双比色RNA就地杂交分析，于等很好地证明，CTC在治疗后更丰富，间充质表型改变，并且与较差的临床结果相关（Yu等.,2013). 总之，CTC代表肿瘤细胞在循环中适应的动态EMT状态，与转移潜能和不良预后密切相关。使用大规模患者队列中的全局基因表达谱对CTC进行进一步的分子表征，可以更全面地评估CTC‐EMT特征在预后潜力和治疗预测方面的作用。

6 靶向EMT：在转移癌治疗中的治疗意义

如上所述，过去十年的研究支持了EMT在促进肿瘤转移中的重要作用，针对残留EMT驱动的癌细胞的新疗法结合传统疗法可能会减少转移形成和耐药性。为此，临床前研究测试了一些小分子抑制剂，这些小分子抑制剂靶向与EMT相关的刺激或信号通路，最近的一篇综述（Marcucci等.,2016). 根据我们目前对EMT计划的分子和细胞可塑性的理解，应仔细考虑和测试使用抗EMT治疗的治疗策略。虽然预防EMT可能有助于治疗容易获得间充质特性的上皮癌细胞，但EMT的逆转也可能会产生意想不到的结果，即促进已经扩散的肿瘤细胞的再生。从概念上讲，消除间充质肿瘤细胞或抑制其生长，结合针对上皮人群的传统疗法，可能最适合解决动态部分EMT状态和肿瘤异质性。其他生物标志物，如转录组EMT特征（Tan等.,2014)来自原发肿瘤或循环肿瘤细胞。，还将有助于确定合适的患者和治疗窗口，在这些窗口中，抗EMT治疗可以产生更好的治疗反应并提高生存率。

7 结论

EMT在转移中的复杂性质需要仔细分析，以解剖动态细胞可塑性。在过去二十年中，对EMT的深入研究已经汇聚成一个共同的主题，即EMT确实会发生体内在肿瘤进展过程中，CTC高度富集，具有EMT基因特征。对肿瘤细胞系、小鼠肿瘤模型和人类肿瘤样本的各种研究强烈支持EMT是有效转移传播的关键机制这一观点。同样清楚的是，部分和可逆的EMT对于使播散的肿瘤细胞恢复到上皮表型以促进远处转移性生长非常重要，如图所示1最近的一些研究未能使用某些EMT报告物检测到EMT在传播肿瘤细胞中的作用，因此，这就增加了某些癌细胞在不进行EMT的情况下传播并形成远处转移的可能性。鉴于难以敏感地检测瞬态和部分EMT程序的激活体内，需要进一步研究开发更高效的EMT报告人，以进一步评估EMT在转移中的作用，从而明确解决这一长达十年的争论。CTC中EMT基因特征预测生存率和治疗反应的潜力需要进一步评估，以用于临床应用。EMT调节剂的开发可能被证明是一种有用的研究工具，可以进一步剖析EMT和转移的调控途径，并在临床环境中预防或减缓转移性生长。

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