不同疾病阶段肝细胞癌患者循环肿瘤细胞中表达的上皮-间充质转换标记物

CTC可作为评价HCC进展和预后的有效指标

从HCC患者样本中获得的CTC的特征包括具有完整细胞核和高核质比的较大细胞尺寸。HCC患者的CTC HSA和DAPI染色阳性，CD45染色阴性(图2a). 从60例HCC患者中46例（76.7%）的血样中分离出CTC。门静脉癌栓患者CTCs阳性率（96.9%）明显高于无门静脉癌血栓患者（53.6%）P（P）<0.001）(表1). Edmondson–Steiner III级或IV级患者的CTC阳性率（87.5%）显著高于I级或II级患者（33.3%）P（P）=0.005) (表1). 在米兰标准以外的患者中，CTC的阳性率（90.5%）也显著高于米兰标准以内的患者（44.4%）P（P）<0.001) (表1). Spearman的秩相关分析表明，CTC的阳性率与肿瘤大小高度相关(第页=0.371,P（P）=0.003) (表1). 此外，CTC的阳性率与TNM分期密切相关，从I期的47.4%到IV期的100%(第页=0.471,P（P）<0.001) (表1). 然而，CTC的阳性与其他临床病理因素（如年龄、性别、病因、Child-Pugh分级、肝硬化、血清AFP水平或肿瘤数量）之间没有显著相关性(表1). 健康志愿者或诊断为良性肝病或非肝癌的患者的血液样本中均未检测到CTC。

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图2

免疫荧光染色鉴定了不同疾病阶段HCC患者CTC中EMT相关基因的表达。(一)CTC和血液细胞用HSA抗小鼠抗体/Alexa Fluor 647兔抗小鼠IgG（红色）和CD45抗大鼠抗体/Alexa Fluoro 488兔抗大鼠Ig G（绿色）染色。细胞核用DAPI（蓝色）染色。(b条–克)三重免疫荧光显示CTC分别表达波形蛋白、twist、ZEB1、ZEB2、snail和E-cadherin。用兔抗vimentin、twist、ZEB1、ZEB2、snail和E-cadherin的一级抗体对这些CTC进行染色，相应的二级抗体为Alexa Fluor 555驴抗兔IgG（黄色）。其余染色程序与双免疫荧光法相同。条形=10 μm.同一患者的CTC中扭曲和波形蛋白共表达。从同一患者不同视野获得的CTC的代表性显微照片。(小时)CTC表达HSA和twist，但不表达CD45。(我)一种CTC，表达HSA和波形蛋白，但不表达CD45。原始放大倍数×800

同时，到目前为止，我们对31例接受肝癌切除或肝动脉化疗栓塞的肝癌患者进行了至少1年的随访。结果表明，CTC+患者组的复发或转移率（88.0%）显著高于CTC-患者组（16.7%）P（P）=0.002）(表2). 同时，CTC+患者组的死亡率（64.0%）也显著高于CTC+病人组（0.0%）P（P）=0.007) (表2).

CTC中EMT标记物表达的临床病理意义

人宫颈腺癌细胞系HeLa细胞被用作阳性对照物，以检测扭曲和波形蛋白¹¹(补充图2a). 同样，对高EMT HCC细胞系SK-Hep1细胞进行HSA/twist/CD45和HSA/vimentin/CD45的三重免疫荧光²⁸(补充图2b)作为阳性对照，用于随后鉴定具有twist和vimentin表达的CTC(补充图2c). 同时，在外周血单个核细胞（PBMC）中也观察到twist和vimentin的表达(补充图2d)作为阳性对照，用于特异性地在造血细胞以外的CTC中表达twist和vimentin。

在46例不同分期的患者中，37例（80.4%）和39例（84.8%）的CTC中观察到波形蛋白和twist的阳性表达(图2b和c). 门静脉癌栓患者CTC中波形蛋白和twist的阳性表达率（分别为93.5%和100%）显著高于无门静脉癌血栓患者（分别为53.3%和53.3%）；P（P）=0.003，P（P）<0.001) (表3). CTC中vimentin和twist表达的阳性率与TNM分期高度相关，Ⅰ期阳性率为55.6%和66.7%，Ⅳ期阳性率分别为100.0%和100.0%(第页=0.424,第页=0.305；P（P）=0.003,P（P）=0.04），分别(表3). CTC中波形蛋白表达的阳性率在Milan标准以外的患者中也显著高于Milan标准以内的患者（86.8%）（50.0.0%）P（P）=0.036) (表3). 此外，CTC中波形蛋白表达的阳性率与肿瘤大小有高度相关性(第页=0.561,P（P）<0.001). 然而，CTC中twist和vimentin表达的阳性率在其他临床参数（包括年龄、性别、肝硬化、肿瘤数量、病因学、Child-Pugh分级、血清AFP水平或Edmondson-Steiner分级）方面没有显著差异(表3).

三重免疫荧光实验显示，在同一患者获得的46个CTC中，32个（70.9%）同时表达twist和vimentin(图2h和i). 门静脉癌栓患者（93.5%）和超出Milan标准的患者（76.3%）CTC中twist和vimentin共表达的阳性率显著高于无门静脉癌血栓患者（20.0%，P（P）<0.001）或符合米兰标准（37.5%P（P）=0.044) (表3). 此外，CTC中twist和vimentin共表达的阳性率与肿瘤大小有显著相关性(第页=0.414,P（P）=0.004) (表3). CTC中扭曲和波形蛋白共表达的阳性率也与TNM分期相关，I期阳性率为33.3%，IV期阳性率为100.0%(第页=0.476,P（P）=0.001) (表3). 然而，与其他临床变量相比，CTC中twist和vimentin共表达的阳性率没有显著差异(表3). 同时，我们还在CTC中检测到其他与EMT相关的转录因子。我们发现ZEB1、ZEB2和snail的表达也可以在CTC中部分检测到(图2d–f)所有CTC患者均无E-cadherin表达(图2g). 然而，这些转录因子在CTC中的阳性率与任何临床参数无关(补充表1). 在所有样本中均未检测到CTC中slug的表达。

EMT标记物在原发性肝癌中的差异表达

采用免疫组织化学方法检测28例肝癌手术标本中EMT相关基因的表达。结果表明，E-钙粘蛋白在HCC肿瘤中的表达明显低于邻近的非肿瘤肝组织。波形蛋白、twist和ZEB1在肝癌组织中的表达显著高于邻近非肿瘤肝组织。与邻近的非肿瘤肝组织相比，肝癌组织中ZEB2的表达容易下调。肝癌组织与邻近非肿瘤肝组织的蜗牛表达水平无明显差异。在HCC肿瘤或邻近的非肿瘤肝组织中几乎未检测到Slug(图3A). 此外，为了进一步确定原发性肝癌标本中是否发生EMT，进行了定量荧光western blot。分析显示，肝癌肿瘤中E-cadherin的相对表达水平（0.096±0.011）显著低于配对的相邻非肿瘤肝脏（0.196±0.031，P（P）=0.003) (图3B和D). 波形蛋白、twist和ZEB1在HCC肿瘤中的相对表达水平（0.495±0.055，0.217±0.035，0.145±0.017）显著高于配对的相邻非肿瘤肝脏（0.336±0.039，0.095±0.015，0.102±0.010；P（P）=0.002,P（P）<0.001，P（P）分别=0.016）(图3B和D). ZEB2在HCC肿瘤中的表达（0.096±0.013）显著低于配对的相邻非肿瘤肝脏（0.138±0.018；P（P）=0.030) (图3B和D). HCC肿瘤和配对的相邻非肿瘤肝脏之间蜗牛或蛞蝓的表达没有统计学上的显著差异，并且蛞蝓在肝组织中的表达极低(图3B和D). 此外，在一系列肝癌细胞系和HeLa细胞中也检测到E-cadherin、twist和vimentin(图3C).

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图3

与邻近的非肿瘤组织相比，原发性肝癌组织中EMT相关标记物的表达存在显著差异。(A类)E-cadherin在邻近的非肿瘤肝组织（a，b）中高表达，而在肿瘤组织（c，d）中几乎没有E-cadherin的表达。波形蛋白、twist和ZEB1在邻近非肿瘤肝组织（e，f；i，j；m，n）中的表达显著低于原发性肝癌组织（g，h；k，l；o，p）。与相邻的非肿瘤肝组织（q，r）相比，ZEB2在HCC肿瘤（s，t）中的表达更容易下调。蜗牛在邻近非肿瘤肝组织（u，v）和HCC肿瘤（w，x）中的表达没有明显差异。在邻近的非肿瘤肝组织（y，z）或HCC肿瘤中几乎检测不到Slug的表达(α,β). 原始放大倍数×100（a、c、e、g、i、k、m、o、q、s、u、w、y，α)，巴=100 μm.以及放大倍数较高的相应区域×200（b、d、f、h、j、l、n、p、r、t、v、x、z，β)，巴=50 μ米(B类)相邻非肿瘤肝组织（TN）和HCC肿瘤（T）中E-钙粘蛋白、波形蛋白、扭曲蛋白、ZEB1、ZEB2、蜗牛和蛞蝓蛋白水平的代表性免疫印迹。β-肌动蛋白被用作蛋白质负荷的内部标准。(C)几个肝癌细胞系和HeLa细胞中E-cadherin、vimentin和twist表达的代表性免疫印迹。(D类)相对定量分析显示，与邻近的非肿瘤肝组织相比，肝癌组织中E-cadherin的表达显著下调(n个=28, **P（P）=0.003). 与邻近的非肿瘤肝组织相比，HCC肿瘤中的波形蛋白、twist和ZEB1表达水平显著上调(n个=28, **P（P）=0.002, ***P（P）<0.001*P（P）=0.016). 与邻近的非肿瘤肝组织相比，肝癌中ZEB2的表达显著降低(n个=28, *P（P）=0.030). 肝癌肿瘤或成对的相邻非肿瘤肝组织中蜗牛和蛞蝓的表达无统计学差异

细胞培养

人类肝癌细胞系HepG2和MHC97H是陈永彪博士（重庆西南医院肝胆外科）送的礼物。人肝癌细胞系SMMC-7721、PLC和SK-Hep1购自中国科学院细胞库上海研究所并经鉴定。胃癌细胞株MGC-803和HeLa腺癌细胞由重庆新桥医院肿瘤科张安梅博士提供。将人肝癌细胞系HepG2、MHC97H、SMMC-7721、PLC和HeLa腺癌细胞在补充有10%FBS（Hyclone，Logan，UT，USA）和1%（v/v）青霉素/链霉素溶液（Beyotime，Shanghai，China）的Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）中培养。肝癌细胞系SK-Hep1在添加15%FBS和1%青霉素/链霉素的最低必需培养基（Hyclone）中培养。胃癌细胞株MGC-803在添加10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640（Invitrogen）中培养。所有细胞维持在37 °C，在含5%CO的潮湿环境中₂使用前用胰蛋白酶收获。

亚氯芬酸生物素化

根据制造商的协议，使用磺化NHS-LC-生物素（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默科学公司）对亚氯芬丁（美国密苏里州圣路易斯Sigma-Aldrich）进行生物素化。简而言之，1 mg阿司匹林溶于1 ml磷酸盐缓冲盐水。将大约20倍摩尔的磺化-NHS-LC-生物素溶液添加到蛋白质溶液中，并在室温下培养60 然后，使用脱盐柱去除多余的生物素试剂。最后，使用HABA试验测量生物素掺入水平，该试验检测添加含生物素样品前后HABA–亲和素溶液的吸光度。当掺入量达到每个蛋白质分子4-6个生物素基团时，样品被认为适合随后的应用。

流式细胞术分析

为了测定ASGPR与生物素化无唾液酸胎球蛋白的结合效率，本试验使用了几种肿瘤细胞系和ASGPR敲除细胞系。按照制造商的说明，使用ASGPR1基因特异性siRNA寡核苷酸（意义：5′-GAGGCAAUGGGGGAGAAATT-3′和反义：5′-UUUCUUCCCACAUGCCUCTT-3′）（从Invitrogen购买）沉默ASGPR基因表达。简单地说，HepG2和PLC细胞根据制造商的方案进行转染。然后，将细胞培养48 在使用western blot和流式细胞术分析检测ASGPR表达前h。流式细胞仪分析的主要步骤如下：5×10⁵抑制ASGPR表达的HepG2、MHC97H、PLC、SMMC-7721、SK-Hep1、HeLa、MGC-803和HepG2PLC与100 μl生物素化无唾液酸胎球蛋白，37 45°C 分钟。然后通过添加1-2清洗细胞 ml缓冲液，然后用抗生素-异硫氰酸荧光素（FITC；Miltenyi Biotec Gmbh，Bergisch Gladbach，德国）培养5 黑暗中4分钟 摄氏度。最后，细胞颗粒在200年被重新悬浮 μ用于FACSCalibur流式细胞仪分析的缓冲液（Becton Dickinson）。使用CellQuest软件（Becton Dickinson）对数据进行分析。

单核细胞富集

由于单核细胞和肿瘤细胞位于同一层，使用1.077的密度梯度离心法从外周血样本中分离单核细胞与肿瘤细胞 g/ml Ficoll-Paque PLUS产品（美国加利福尼亚州匹兹堡GE Healthcare）。简单地说，新鲜抗凝处理血液和Ficoll-Paque培养基在18-20时制备 摄氏度。将10毫升外周血与等量的平衡盐溶液（氯化钠溶液，0.14）混合 摩尔/升）。然后将混合物小心地分层到Ficoll-Paque培养基溶液上，并在400×克用于35 20分钟 50毫升离心管中的温度为°C（美国亚利桑那州格伦代尔市科宁公司）。然后，将单核细胞层转移到无菌离心管中，并加入至少3体积的平衡盐溶液。洗涤两次后，将细胞颗粒重新悬浮在适当的培养基中进行分离实验。

磁性分离和胞浆制备

细胞与生物素化无唾液酸胎球蛋白孵育45 37时最小值 °C培养箱，用缓冲液（含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS和2 mM EDTA，pH=7.2）。为了进行磁性标记，细胞与抗生素微球（Miltenyi Biotec GmbH）培养15 4时最小值 摄氏度。然后，将细胞清洗一次，并在500分钟内重新悬浮 μl缓冲器。根据用户手册，使用MiniMACS分离器（Miltenyi Biotec GmbH）和MS柱分离磁性标记细胞。简单地说，MS柱被放置在磁性分拣架上的MiniMACS分离器中。用500英镑冲洗柱子 μl缓冲液和细胞悬液添加到柱中。在柱储存器清空后，用500洗涤柱三次 μl缓冲器。将色谱柱从分离器中取出，放在收集管上。用移液管将一毫升缓冲液移到柱上。通过将柱塞用力推入色谱柱，磁性标记的细胞立即被冲洗出来。计数并稀释分离细胞后，等分5×10⁵阳性细胞在800℃进行细胞离心 5的r.p.m 在多聚赖氨酸涂层载玻片上放置min，并在室温下将胞浆干燥30–60 min。将载玻片固定在PBS（pH 7.4）中4%的多聚甲醛中15 室温下的最小值。立即进行实验或将样品储存在−20 °C，直到后续处理。

免疫荧光染色

为了鉴定载玻片上的CTC，使用抗肝细胞特异性抗原的鼠抗人单克隆抗体（美国马萨诸塞州坎布里奇Abcam）检测正常和肿瘤性肝细胞，并使用大鼠抗人CD45单抗（美国加利福尼亚州圣克鲁斯Santa Cruz Biotechnology Inc.）检测血液细胞。根据制造商的方案进行双重免疫荧光染色。简单地说，用洗涤缓冲液（含0.5%吐温-20的PBS）冲洗载玻片，用0.25%Triton渗透细胞10次 用1%牛血清白蛋白在PBST（含0.5%吐温-20的PBS）中阻断非特异性结合位点30分钟 随后，用HSA抗体和相应的二级Alexa Fluor 647兔抗鼠IgG抗体（Invitrogen）对载玻片进行过夜染色。然后将载玻片与大鼠抗人CD45单克隆抗体孵育90 然后与相应的Alexa Fluor 488兔抗鼠IgG抗体（Invitrogen）孵育60分钟 min.细胞核染色4^′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），并使用防褪色试剂安装载玻片。此外，使用HSA抗体、CD45抗体和以下主要抗体的三重免疫荧光法，研究CTC中的波形蛋白、twist、ZEB1、ZEB2、snail、slug和E-cadherin表达水平：兔抗人多克隆twist/ZEB1/ZEB2抗体（Abcam）、，兔抗人多克隆波形蛋白/蜗牛/E-钙粘蛋白抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.）和兔抗人单克隆蛞蝓抗体（Cell Signaling）。使用Alexa Fluor 555驴抗兔IgG（Invitrogen）作为相应的二级抗体。整个免疫荧光方案在加湿室中进行。最后，使用共焦激光扫描显微镜（Leica TCS SP5 MP，Wetzlar，德国）对载玻片进行分析。

蛋白质印迹

使用SDS-PAGE分析从原发性肝癌组织、邻近非肿瘤肝组织和一系列肝癌细胞系中提取的蛋白质样品。将样品转移到硝化纤维素膜后，将膜堵塞60 室温下min，与各种一级抗体孵育4 °C过夜。以下主要抗体用于western blot分析：小鼠抗人E-cadherin抗体（Abcam）、兔抗人扭转抗体（Gene Tex，Irvine，CA，USA）、兔抗人ZEB1和ZEB2抗体（Abcam）、兔对抗人波形蛋白、蜗牛抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc.）、，兔抗人蛞蝓抗体（细胞信号传导）和小鼠抗人β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich）。特殊的奥德赛二级抗体为IRDye680驴抗兔IgG抗体和IRDye800驴抗鼠IgG（LI-COR，Lincoln，NE，USA）。使用奥德赛红外成像系统检测并量化荧光信号⁴⁵（LI-COR）。

免疫组织化学

用5μm的石蜡包埋的肿瘤样品和邻近的非肿瘤肝组织切片进行免疫组织化学染色。切片在68℃孵育 20°C 在二甲苯中脱蜡前，在分级乙醇中重新水化，并用PBS淬火三次。为了进行热诱导抗原回收，将载玻片在微波炉中煮沸15 最小值（0.01 mmol/l柠檬酸缓冲液），并允许在室温下冷却20 将载玻片在3.0%过氧化氢溶液中浸泡20分钟后 为了抑制内源性过氧化物酶活性，用10%的正常山羊血清孵育30分钟可阻断非特异性结合位点 室温下的最小值。将载玻片与初级鼠抗人E-cadherin抗体（Abcam）、兔抗人扭转抗体、ZEB1和ZEB2抗体（Abcam）、兔抗人波形蛋白、蜗牛抗体（圣克鲁斯生物科技公司）和兔抗人鼻涕虫抗体（细胞信号）在4 °C过夜。用PBS清洗后，用二级抗体与过氧化物酶偶联聚合物（Beyotime）孵育切片20 min。根据制造商的说明，使用DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒（Beyotime）检测目标抗原。最后，用苏木精对切片进行复染，在分级乙醇中脱水并装裱。使用光学显微镜对载玻片进行分析（德国莱卡Wetzlar）。

我们感谢在第三军医大学新桥医院接受治疗的患者，感谢他们愿意参与本研究，感谢我们部门的几位护士在采集外周血样时给予的热情协助。本研究得到了国家自然科学基金项目（No.81001105）和重庆市自然科学基金（No.cstc2011jjA0670和No.cstc2010BB5183）的资助。