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.2011年6月1日；71(11):3980-90.
doi:10.1158/0008-5472.CAN-10-2914。 Epub 2011年4月18日。

MAPKs对Twist1丝氨酸68的磷酸化稳定Twistl蛋白并促进乳腺癌细胞侵袭

Jun Hong先生 1, Jian Zhou公司, 傅俊江, 陶和, 秦军, 李旺, 兰辽, 徐建明
附属公司

MAPKs对Twist1丝氨酸68的磷酸化稳定Twistl蛋白并促进乳腺癌细胞侵袭

Jun Hong先生等。 癌症研究. .

摘要

Twist1是一种基本的螺旋-环-螺旋转录因子，可促进乳腺肿瘤细胞上皮-间充质转化（EMT）、侵袭性和转移。然而，在这些细胞中负责调节Twist1稳定性的机制尚不清楚。我们通过质谱和特定抗体鉴定丝氨酸68（Ser68）为Twist1的主要磷酸化位点。该Ser 68在体外被p38、c-Jun N末端激酶（JNK）和细胞外信号调节激酶1/2磷酸化，其磷酸化水平与人类胚胎肾293和乳腺癌细胞中的Twist1蛋白水平正相关。通过丙氨酸（A）突变（Ser 68A）防止Ser 68磷酸化显著加速Twist1泛素化和降解。此外，通过活性Ras蛋白或TGF-β处理激活有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）显著增加Ser 68磷酸化和Twist1蛋白水平，而不改变Twist1mRNA的表达，而通过特定抑制剂或显性阴性抑制突变体阻断MAPK活性可有效降低诱导和未诱导的Ser 68磷酸化和Twist蛋白水平。因此，与表达Ser 68A-Twist1突变的相同细胞相比，表达Twistl 1的乳腺上皮细胞在TGF-β或活性Ras和紫杉醇抵抗的刺激下表现出更高程度的EMT和侵袭性。重要的是，侵袭性人类乳腺导管癌中Ser 68磷酸化水平与Twist1蛋白和JNK活性水平呈正相关，并且在孕酮受体阴性和HER2阳性乳腺癌中显著更高。这些发现表明，酪氨酸激酶受体和Ras信号通路激活MAPK可能通过Twist1的磷酸化和稳定，显著促进乳腺癌细胞EMT和转移。

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数字

图1
图1。Twist1表达、纯化、磷酸化和稳定性分析
答：。免疫沉淀F-Twist1（F-T）通过免疫印迹（IB）和针对Flag、对丝氨酸（pSer）和对酪氨酸（pTyr）的抗体进行分析。F细胞免疫沉淀作为阴性对照。IgG-HC和IgG-LC，IgG重链和轻链。B1。用所示质粒转染293个细胞。细胞裂解物由IB用指示的抗体进行分析。HA-T、HA-tagged Twist1；p-S68，pS68-Twist1。B2、。从所示细胞系制备细胞裂解物，并用抗Twist1、pS68-Twist和β-actin抗体通过IB分析。C。用HA-Twist1或HA-S68A-Twist1质粒转染293细胞。12小时后，用环己酰亚胺处理细胞，处理时间如图所示。用HA和微管蛋白抗体进行IB。测定并给出了密度值。显示了HA-Twist1和HA-S68A-Twist1的半衰期（50%）。D。如图所示，用模拟质粒或HA-ubiquitin表达质粒转染F（-）、F-Twist1（W）、F-S68A-Twist1A（A）和F-S68E-Twist1-E（E）诱导的293细胞。转染12小时后，用Dox处理细胞6小时，然后用载体或MG132再处理细胞6小时。用Flag抗体进行免疫沉淀，然后用HA和Flag血清进行IB免疫沉淀。ns，非特异性带。
图2
图2。MAPKs磷酸化Sre68处的Twist1在体外和Ras激活使HEK293细胞中的Twist1稳定
答：。GST控制和GST-Twist1-N蛋白质与MAPK孵育，如下所示在体外磷酸化分析。用pS68-Twist1抗体进行免疫印迹（IB）。GST和GST-Twist1-N蛋白质的考马斯蓝染色作为负载对照。p38 MAPK抑制剂SB203580；SP60125，一种JNK抑制剂。B。将HA-Twist1质粒与H-RasV12（+）质粒或其模拟载体（-）联合转染293细胞。用RT-PCR检测H-Ras、Twist1和GAPDH mRNA。用IB测定H-Ras、pS68-Twist1和微管蛋白。C。将H-RasV12质粒与HA-Twist1或HA-S68A-Twist1质粒联合转染293细胞。12小时后，如图所示，用环己酰亚胺处理细胞。用抗HA（针对Twist1）、H-Ras和微管蛋白的抗体进行IB。测定并绘制密度值。
图3
图3。抑制MAPK降低pS68-Twist1和Twistl蛋白
答：。如图所示，用Twist1质粒和H-RasV12或模拟质粒转染293细胞。12小时后，用载体SB203580、SP60125或PD98059处理细胞。用所示抗体进行免疫印迹。B。用Twist1、模拟载体（-）、H-RasV12表达质粒（+）和显性阴性（DN）形式的Flag-DN-JNK（JN）、Flag-DN-p38 MAPK（p）或DN-MEK（ME）转染293个细胞。用所示抗体进行免疫印迹。注意，p38抗体识别内源性和DN-p38。抗Flag抗体识别Flag-DN-JNK和Flag-DN-p38。C。4T1细胞用载体或不同的MAPK抑制剂处理8小时。用所示抗体进行免疫印迹，以检测所示内源性蛋白。
图4
图4。Ras-刺激和Twist1-促进乳腺癌细胞侵袭需要Ser 68磷酸化
答：。通过免疫印迹（IB）检测具有模拟对照、Twist1表达或Twist1-S68A表达的稳定MCF-10A细胞系，并显示抗体。通过RT-PCR测量Twist1、S68A-Twist1和GAPDH mRNA。B。上述细胞通过E-cadherin抗体进行免疫染色（所有面板均为绿色）。细胞核用DAPI染色（右面板）。C。如图所示，表达H-RasV12和Twist1、S68A-Twistl或模拟对照的MCF-10A细胞系的形态（上面板）。实时细胞侵袭分析（下面板）使用上面板中的3个细胞系和A面板中的三个细胞系进行。
图5
图5。TGF-β诱导pS68-Twist1和Twistl蛋白与细胞侵袭
答：。如图所示，用TGF-β处理MDA-MB-231细胞。通过实时RT-PCR测量Twist1 mRNA水平，并将其归一化为18S RNA水平（上面板）。从TGF-β处理的MDA-MB-231细胞制备裂解物，并用抗Twist1、pS68-Twist1和β-肌动蛋白的抗体进行免疫印迹（下图）。B。用TGF-β和/或不同的MAPK抑制剂处理MDA-MB-231细胞。用所示抗体通过免疫印迹法分析细胞裂解物。C。如图所示，用载体（-）或转化生长因子-β处理具有模拟载体（-]）、Twist1（WT）表达或S68A-Twistl（S68A）表达的MCF-10A细胞。使用针对Twist1、pS68-Twistl和β-actin（上面板）的抗体进行免疫印迹。如图所示，在缺乏或存在TGF-β的情况下进行细胞侵袭试验。D。工作模型概要图。如果S68 Twist没有被MAPKs磷酸化，它将受到泛素化和降解。如果磷酸化，pS68-Twist1抵抗泛素化和降解，并变得稳定，因此其促进EMT、细胞侵袭和细胞生存的功能将增强。
图6
图6。人原发性乳腺肿瘤中pS68-Twist1、Twistl和MAPK水平分析
答：。使用抗pS68-Twist1、Twistl、p-JNK、p-p44/42 ERKs、p-p38 MAPK和β-actin抗体对乳腺肿瘤进行免疫印迹分析。列出了用密度计测量的带强度值。肿瘤类型包括浸润性导管癌（idc）、浸润性小叶癌和无癌细胞癌（ila）和富脂上皮癌（lrc）。根据ERα、PR和HER2的免疫染色结果，将肿瘤分为3组。列出了Ki67阳性细胞数的百分比。ERα和PR的染色强度分为0（阴性）、1（弱染色）、2（中等染色）和3（强染色），阳性细胞比例分为1（0-25%）、2个（26-50%）、3个（51-75%）和4个（76-100%）。此处显示的最终得分是根据染色强度和阳性细胞比率等级的总和确定的：0，≤2个总和分；1、3-4个加分；2、5-6个加分；和3.7个总和点。HER2的0分为阴性染色或<10%的弱膜染色肿瘤细胞；评分1为弱染色和部分膜染色的肿瘤细胞>10%；评分2为>10%的肿瘤细胞弱至中等膜染色；3分为>10%的肿瘤细胞，膜染色强。B。在A组中检测乳腺肿瘤中Twist1和pS68-Twistl水平之间的相关性。通过Spearman秩相关分析统计相关性。C。图A中测定了乳腺肿瘤中p-JNK与pS68-Twist1或Twist1水平之间的相关性。D。ERα+中pS68-Twist1、Twistl和p-JNK的相对水平；公关+；HER2+、ERα+；公关-；HER2+和ERa-；公关-；在面板A中对HER2+乳腺肿瘤进行分析。数据以方框图表示，其中矩形的上限为第三个四分位数，下限为第一个四分位。*，p<0.01；**，t检验p<0.001。
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