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.2008年4月1日；22(7):894-907.
doi:10.1101/gad.1640608。

miR-200家族通过靶向E-cadherin阻遏物ZEB1和ZEB2来确定癌细胞的上皮表型

孙美公园 1, Arti B Gaur公司, 恩斯特·伦吉尔, 马库斯·E·彼得
附属公司

miR-200家族通过靶向E-cadherin阻遏物ZEB1和ZEB2来确定癌细胞的上皮表型

孙美公园等。 基因开发. .

勘误表in

  • 基因开发2009年6月1日；23(11):1378

摘要

癌症进展与胚胎发育过程中发现的上皮-间充质转化（EMT）过程相似，在EMT过程中，细胞下调E-cadherin的表达，上调Vimentin的表达。通过评估国家癌症研究所维护的药物筛选小组的60个细胞系中207个微小RNA（miRNA）的表达，我们确定miR-200 miRNA家族是表达E-钙粘蛋白但缺乏波形蛋白表达的细胞的一个特殊标记。这些发现扩展到了原发性卵巢癌标本。miR-200被发现直接靶向E-cadherin转录阻遏物ZEB1（TCF8/deltaEF1）和ZEB2（SMAD-interacting protein 1[SIP1]/ZFXH1B）的mRNA。miR-200的异位表达导致癌细胞株中E-cadherin的上调并降低其运动能力。相反，抑制miR-200可降低E-cadherin的表达，增加Vimentin的表达并诱导EMT。我们的数据确定miR-200是癌细胞上皮表型的有力标记物和决定因素。

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数字

图1。
图1。
NCI60细胞系中E-cadherin阳性和阴性细胞的鉴定。(A类)对59个NCI60细胞系的E-cadherin和Vimentin表达进行Western blot分析，将其分为超簇。(B类)NCI60细胞根据E-cadherin/Vimentin表达的最高与最低比率进行排名。上皮细胞仅表达E-钙粘蛋白，间充质细胞仅表达波形蛋白。未定义的细胞系要么同时表达两种标记，要么两者都不表达。E-钙粘蛋白/波形蛋白比值是使用密度测定法测定的数据，如A类表达标准化为肌动蛋白带在不同凝胶上运行两次（未显示）。箭头表示抑制miR-200后HCT116细胞中E-cadherin/Vimentin比率的变化，如图5A所示。
图2。
图2。
miR-200家族的miRNA仅在E-钙粘蛋白阳性和波形蛋白阴性细胞中选择性表达。(A类)根据上皮细胞系或间充质细胞系中的表达情况，NCI60细胞中77个miRNAs的表达最高（Shell等人，2007年）。P（P）-值是两个样本的结果t吨-测试分析。高表达用红色表示，低表达用蓝色表示。显示折叠变化（log2）。(B类)miR-200家族由两个密切相关的亚家族组成。所有五名家庭成员的相同职位以粗体显示。种子序列已装箱。(C类)五个miR-200家族成员位于两个不同的遗传位点上。这两个功能亚科的相关性用不同的颜色表示。(D–G)波形蛋白蛋白表达的比较(D类)，波形蛋白mRNA表达(E类)，E-钙粘蛋白表达(如果)和E-cadherin mRNA表达(G公司)NCI60细胞中的miR-200c。皮尔逊相关系数（R）和P（P）-报告值（p）。
图3。
图3。
内源性miR-200靶向ZEB1和ZEB2的mRNA。(A类)ZEB1和ZEB2 3′UTR示意图，以及预测的miR-200a/141（蓝色）和miR-200b/c/429（绿色）靶点的位置。图中显示了具有人类ZEB 3′UTR的荧光素酶结构。(B类)将萤火虫荧光素酶基因转染到具有不同内源性miR-200水平（IGROV-1，低；HCT116和KM12，高）的细胞系后72 h，与小鼠ZEB2的3′UTR相关联的萤火虫荧光酶基因的活性。(C类)用ZEB Renilla荧光素酶构建物转染293T细胞，如A类或相应的突变体，其中所有五个miR-200b/c/429位点都发生了突变，要么未经处理（ctr），要么与打乱的前miR（S）或miR-200c（200）共转染。(D类)HCT116细胞转染10 nM打乱的LNA寡核苷酸（S）或LNA-200（L），或不处理，并与含有人ZEB1、人ZEB2或小鼠ZEB2 3′UTR的荧光素酶构建物共转染。(E类)实时PCR定量转染空荧光素酶载体（pGL3）或小鼠ZEB2荧光素素酶构建物的HCT116细胞中荧光素酶mRNA。细胞未经处理或与50 nM打乱的LNA寡核苷酸（S）或LNA-miR-200（L）共同转染。(如果)NCI60细胞中ZEB1 mRNA表达与miR-200c表达的比较。(G公司)NCI60细胞中ZEB2 mRNA表达与miR-200c表达的比较。皮尔逊相关系数（R）和P（P）-报告值（p）。(小时)NCI60细胞中ZEB1 mRNA表达与ZEB2 mRNA表达的比较。来自九种不同癌症来源的细胞被标记成不同的颜色。
图4。
图4。
通过引入外源miR-200诱导已建立的癌细胞系中E-钙粘蛋白的表达和MET。(A类)用打乱的前miRNA（S）或前miR-200a和前miR-200 c的混合物（200a/c）转染细胞。首次转染后第3天（D3）或第6天（D6）通过实时PCR检测E-cadherin、ZEB1和ZEB2的表达。(B类)转染打乱寡核苷酸（S）或miR-200a/c后3d，通过Western blot分析检测MDA-MB-231细胞中的E-cadherin(C类)治疗后细胞的形态学变化B类6天后(D类)接受六个转染周期的MDA-MB-231细胞首先用打乱的前miR寡核苷酸或miR-200a/c转染以进一步诱导E-cadherin表达，24小时后用对照载体或ZEB2表达质粒转染。三天后，通过实时PCR定量E-cadherin的表达。数字被标准化为23%的转染效率。(E类)用50 nM打乱寡核苷酸（S）或miR-200a/c转染三次（D9）的MDA-MB-231细胞进行为期两个小时的体外运动试验(如果)用打乱寡核苷酸（S）、miR-200a（200a）或miR-200c（200c）单独或联合（200a/c）转染MDA-MB-231细胞，24小时后通过实时PCR定量E-cadherin、ZEB1和ZEB2的表达。
图5。
图5。
降低内源性miR-200表达可诱导HCT116细胞EMT。(A类)每隔3天用打乱的LNA（S）、LNA-200或LNA-let-7寡核苷酸重复转染细胞。首次转染后18天通过实时PCR定量mRNA的表达。(B类)重复转染22天的细胞中E-cadherin表达（粉红色）的免疫荧光分析。用DAPI对细胞进行复染。(C类)处理15天的细胞的Western blot分析(D类)相位对比图显示处理15天的细胞(E类)首先用50nM LNA加扰或LNA-200转染细胞，24小时后，一旦E-钙粘蛋白上调，再次用加扰siRNA池、ZEB1特异性siRNA池、ZEB2特异性siRNA池或两者转染细胞。72小时后，通过实时PCR定量ZEB1、ZEB2和E-cadherin的表达。(如果)用空载体（vec）或HA-ZEB2转染细胞，在E-cadherin、miR-200a和miR-200c表达3d后通过实时PCR定量。数字被标准化为48%的转染效率。通过Western blot分析确认HA-ZEB2的表达（未显示）。
图6。
图6。
卵巢癌患者肿瘤组织样本中miR-200c和E-cadherin的表达相关。(A类)IGROV-1和KM12细胞以及两个患者基质样品中miR-200c的实时PCR分析。(B类，C类)两组患者样本中miR-200c和E-cadherin mRNA表达的相关性。使用方法1富集肿瘤(B类)或方法2(C类)如材料和方法所述。线性回归如所示B类，以及P（P）-E-cadherin高/波形蛋白低（红色符号）和E-cadherin-低/波形素高（蓝色符号）标本中miR-200c表达差异的显著性值。(D类)两组NCI60细胞中TGFβ1 mRNA的表达具有所示的表达模式。这个P（P）-显示了两组之间表达差异的值。(E类)解释miR-200在维持癌细胞上皮表型中的功能的模型。详见正文。
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