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EMBO分子医学。2014年10月；6(10): 1279–1293.
2014年9月11日在线发布。 数字对象标识：10.15252/emm.201404208年
预防性维修识别码：项目经理4287932
PMID：25214461

上皮-间充质转换光谱定量及其在解读癌症患者生存和药物反应中的作用

团泽坦,1 青浩淼,2 美木义雄,三 野田忠雄,三 森喜朗,三 鲁比·云居·黄,1,4,†和让·保罗·蒂里1,2,5,*†
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

上皮-间充质转化（EMT）是一个可逆的动态过程，被认为与肿瘤在侵袭和转移过程中共同作用。然而，目前还没有定量的方法来评估EMT与癌症进展之间的相互作用。在这里，我们从卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、肺癌、结直肠癌和胃癌的肿瘤特异性转录组EMT特征中导出了一种通用EMT评分方法。我们发现EMT评分与先前发表的癌症特异性EMT特征表现出良好的相关性。这种通用的定量EMT评分用于建立各种癌症的EMT谱，细胞系和肿瘤之间具有良好的相关性。尽管有先前的观点，但我们发现EMT与卵巢癌和结直肠癌（而非乳腺癌）较低的无病生存率相关。重要的是，我们发现上皮性和间质样卵巢癌对紫杉醇治疗方案的反应不同体内并证明间质样肿瘤并不总是对化疗产生耐药性。因此，EMT评分是一种很有前途的通用工具，可用于客观和系统地研究EMT在癌症进展、治疗反应和生存期中的作用和动力学。

关键词：药物反应、上皮间质转化、基因表达特征、微阵列、预后

介绍

越来越多的证据表明，上皮-间充质转化（EMT）在许多癌症相关事件中至关重要，包括癌症侵袭、转移、细胞死亡抵抗、化疗和免疫治疗的难治性反应、免疫抑制和获得干细胞样特性（Lee等,2006; 昂德等,2008; 蒂里等,2009; 乔丹等,2011; 黄等,2012; Lee&Nelson，2012; 弗里希等,2013; Tam&Weinberg，2013). 在EMT中，极化上皮（Epi）细胞逐渐改变其连接和极性复合体，以获得间充质（Mes）细胞（Thiery）典型的形态和生化特征等,2009). EMT最初被描述为在大多数后生动物（约旦）发育中驱动关键形态发生步骤（例如原肠胚形成）的机制等,2011; Lim&Thiery，2012)最近，在伤口愈合和癌症进展方面（Thiery等,2009). 然而，尽管EMT可能参与侵袭和转移，但EMT在人类肿瘤中的作用尚不充分（Wang等,2004; Chaffer&Weinberg，2011; 香港等,2011). 即使在确定了部分或完全进入循环肿瘤细胞（CTCs）的过渡型或“EMTed”表型（约旦等,2011; Valastyan&Weinberg，2011; 于等,2013). 最初认为EMT是一个二元过程，现在有充分的证据证明EMT是动态过程，存在中间状态（约旦等,2011; 香港等,2011; 黄等,2013; Tam和Weinberg，2013). 细胞在EMT的这些中间或“亚稳态”状态中停滞或过渡（约旦等,2011)-通常称为“融合细胞”（Kong等,2011)-具有Epi和Mes表型的属性，并表现出干细胞样特性。它们还显示Epi和Mes状态之间的高度可塑性，这对转移至关重要，因此，越来越清楚的是，在设计新的治疗策略时，这些中间表型也必须进行定量评估和考虑（Chaffer和Weinberg，2011; Valastyan&Weinberg，2011).

许多信号通路以上下文相关的方式启动和执行导致EMT的生化程序，包括与表面酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸激酶、WNT信号、细胞因子受体和下游转录调控因子相关的生化程序蜗牛,ZEB公司和扭转（蒂里等,2009; 乔丹等,2011; Lee&Nelson，2012; 弗里希等,2013; Tam&Weinberg，2013). 尽管如此，这些不同的机制收敛并产生类似的EMTed表型终点（Thiery等,2009; Tam&Weinberg，2013)，这种融合可能反映了所有接受EMT治疗的癌症共同的一系列分子特征（约旦等,2011). 因此，我们试图建立一种通用的EMT特征，以捕获EMT期间广泛癌症所显示的一组通用分子特征。在这里，我们开发了一种使用转录组学定量评估临床样本和细胞系中EMT状态的方法。我们首先建立了膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌和卵巢癌的特异性EMT特征，并从中导出了一个通用的EMT特征。我们认为，这种通用的EMT特征例证了EMT在不同来源的肿瘤和细胞系中的共同分子特征，并相信这种特征将在未来对EMT及其在癌症进展、治疗反应和生存中的动态性质的作用进行客观和系统的研究中发挥重要作用。

结果

特定于癌症的EMT签名

我们首先根据图​图1A1A（见材料和方法）。首先，我们策划了公开的EMT签名（Subramanian等,2005; 李等,2006; 卡雷特罗等,2010)并应用单样本基因集富集分析（ssGSEA）（Verhaak等,2013)以提供对每个细胞系或肿瘤的EMT表型的总体评估。接下来建立了与已知EMT转录物相关性最好的EMT特征，并选择了大多数Epi和大多数Mes细胞系或肿瘤，使用BinReg（Gatza）构建EMT特征等,2010). 然后使用BinReg EMT特征预测细胞系和肿瘤中的EMT表型。再次选择大多数Epi和大多数Mes细胞系或肿瘤来生成最终EMT特征。最后，我们使用两样本Kolmogorov–Smirnov检验（2KS）计算了给定样本的EMT得分。EMT得分为阳性（高）的样本更多是Mes，而得分为阴性（低）的样本则更多是Epi。我们分别为肿瘤和细胞系开发了肿瘤特异性EMT特征，认识到细胞系仅模拟癌症生物学的某些方面，不在基质微环境中繁殖，并且经常积累额外的突变以在人工培养系统中存活（Borrell，2010; 吉列等,2013).

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肿瘤特异性上皮-间充质转化（EMT）信号的衍生及应用
  1. 一个六步方案，说明肿瘤特异性EMT信号的生成。请注意，肿瘤和细胞系有其自身的肿瘤特异性EMT特征。（右上角面板）样本富集分数（ES）条形图上的红色和绿色条分别表示为构建BinReg EMT特征选择的类间充质（Mes）和类上皮（Epi）样本。（右中面板）微阵列（SAM）/接收器操作特征（ROC）分析的EMT特征热图。彩色条显示了细胞系或肿瘤样本的EMT表型概率，从大多数Epi到大多数Mes排序。红色和绿色条表示为SAM/ROC分析选择的Mes和Epi样本。（右下面板）Mes（红色）和Epi（绿色）基因集的经验累积分布函数图。
  2. 乳腺癌细胞系EMT评分点图（平均值±SEM）(n个=34）具有纺锤状和非纺锤状形态。曼·惠特尼U型-测试P（P）-显示值。
  3. 雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和Epi（CDH1、ERBB2、CK19）以及Mes（CK5、VIM、CDH2）标记物的免疫组织化学染色热图（黑色=低，红色=高，白色=无数据）。乳腺癌细胞系(n个=39）根据EMT得分从Epi最多到Mes最多对齐，如条形图所示。点图是-日志10P（P）-双样本Kolmogorov–Smirnov检验的值。任意阈值P（P）<0.001用于定义Epi、中间和Mes细胞系。乳腺癌细胞系微阵列和亚型来自GSE16795标准（霍利斯特尔等,2010). 子类型颜色代码：蓝色，发光；褐红色，玄武岩。

为了首先确保这些癌症特异性EMT特征的有效性，我们在GSE16795标准乳腺癌细胞系数据集（Hollestelle等,2010). 具有纺锤状形态的乳腺癌细胞系的EMT评分显著高于没有纺锤状形态学的细胞系（图​（图11B类；P（P）=1.4E-6）；这与报告的Mes细胞纺锤状形态一致（Lee和Nelson，2012). 此外，EMT评分高的细胞系显示VIM和CDH2的阳性染色显著增高，这是EMTed表型的已知标记物（Thiery等,2009)(P（P）=2.1E-5和P（P）分别=9.1E-6；图​图1C）。1C） ●●●●。相反，已知Epi标记物CDH1和CK19的免疫组织化学在EMT评分较低的Luminal细胞系中显著富集(P（P）=0.035和P（P）分别为0.005）。具有中等EMT评分的细胞系具有混合的基底-基底表型，CK5（一种肌上皮或基底标记物）的表达丰富(P（P）= 0.0002). 基础细胞系的EMT得分为中到高，而鲁米纳细胞系EMT得分较低(P（P）=1.6E-7；图​图1C）。1C） ●●●●。膀胱癌特异性EMT特征已得到验证（补充文本，补充图S1），而卵巢癌特异性的EMT特征已经在先前的研究中进行了评估（Miow等,2014). 这些结果证实了癌症特异性EMT特征评分，该评分构成了通用EMT特征的基础。

通用EMT签名

为了对任何癌症的EMT状态进行定量评分，我们基于微阵列显著性分析（SAM）和每个癌症特异性EMT特征（ROC）结果的加权和，导出了肿瘤和细胞系的通用EMT特征​（图2A；2A；见材料和方法）。存在于所有六个癌症特异性EMT特征中的基因z（z）-转换加权和(P（P）<0.001）包含在通用EMT签名中（图​（图2A）。2A） ●●●●。正如热图中相互连接的链接所示，我们注意到癌症特异性EMT信号中的基因高度重叠。共选择315个基因（Epi:145，Mes:170）和218个基因（Epi:170，Mes:48）分别用于肿瘤和细胞系的一般EMT特征（补充表S1A和B）。其中，88个Epi和30个Mes基因在这两个特征中均上调（补充表S1A和B）。已知EMT成绩单-CDH1型,EPCAM公司,GRHL2型,19韩元,RAB25型,CDH2公司,VIM公司,ZEB1号机组,ZEB2型,SNAI2公司和扭转1（蒂里等,2009; 谢普利等,2012; 黄等,2012; 张等,2013)-在通用EMT签名中一致选择；EMT相关基因的成功鉴定为我们策略的有效性提供了支持。此外，据报道，miRNAs的表达可抑制EMT，例如来自miR-200（miR-200a、miR-200b、miR-2001c、miR-141、miR-429）和miR-34（miR-34a、miR34b、miR-34c）家族（Zhang和Ma，2012; 郝等,2014)，与一般EMT评分显著且一致地反相关（补充文本，补充图S2）。这表明有可能将miRNAs纳入普通EMT特征中。

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通用上皮-间充质细胞转化（EMT）信号的推导及应用
  1. 说明一般EMT特征的Circos图：显示了卵巢癌（蓝色）、乳腺癌（紫色）、肺癌（绿色）、结直肠癌（黄色）、膀胱癌（红色）和胃癌（橙色）特异性EMT特征的重叠。链接表示重叠基因（红色=间充质，绿色=上皮）。内环上的热图显示了根据微阵列（SAM）折叠变化的显著性分析、错误发现率、受体操作特征（ROC）和每个癌症特异性EMT特征中的基因样本数计算的重量（红色=高，蓝色=低重量）。在最外层的环上，基因由蜱虫表示，并从每种癌症类型的最高SAM倍数变化到最低SAM倍数变化排列。选定的基因被标记。
  2. EMT评分（平均值±SEM；年-轴）乳腺癌分子亚型的预测等(2010)非激光捕获微区（非LCM）队列(n个= 3,992; 上面板）和LCM队列(n个= 417; 下部面板）。曼·惠特尼U型-测试P（P）-给出了每个子类型的二进制比较值。颜色代码：栗色、基色；黄色，Claudin-low；淡蓝色，鲁米纳-A；深蓝色，Luminal-B；橙色，ERBB2+；绿色，正常。N.A，不适用。请注意，没有P（P）-该值可用于下部面板中的Claudin-low和Normal-like子类型，因为n个 < 3.

基因本体和KEGG通路的功能注释分析（黄达等,2009)在所有315个基因中，EMT标记显示了EMT相关生物过程的显著富集，例如细胞粘附（FDR =1.2E-9）和细胞迁移（FDR =6.0E-4；补充表S2）。然后将普通EMT特征与已发表的肿瘤特异性EMT特征进行比较（补充表S1C）。通过比较ssGSEA的富集分数，发现通用EMT特征与用于其衍生的六种癌症特异性EMT特征密切相关(罗∈[+0.73，+0.97]，大多数已发表的肿瘤特异性EMT特征(罗∈ [+0.32, +0.84]; 补充表S1C）适用于每种癌症类型，尽管特征基因中存在微小重叠。令人惊讶的是，根据肿瘤和细胞株的一般EMT特征计算出的EMT得分是高度相关的(罗>+0.89），即使细胞系通用EMT特征不包括基质成分。这表明基质相关基因对肿瘤的一般EMT评分的影响有限。然而，我们注意到，通用EMT特征与四个已发表的EMT特征之间存在微小或无相关性，可能是因为这些特征中的基因数量较少，或者是因为特征来自非恶性细胞。总的来说，这些结果证明了普通EMT特征与先前报道的EMT相关基因和癌症特异性EMT特征的一致性。此外，通用EMT特征既可用于所有癌症类型的EMT定量，又对基质的存在不显著敏感，这是该分类系统的两个重要优势。

为了评估这种通用EMT特征的效用，我们计算了激光捕获微影检测（LCM）和非LCM乳腺癌的EMT评分（图​（图2B）。2B） ●●●●。与以前的报告一致（Blick等,2008; 陶布等,2010)，我们观察到，Luminal-A、Luminal-B和ERBB2+乳腺癌更易发生Epi(P（P）= 0.0496,P（P）=3.34E-79和P（P）=2.48E-6），而基底部和Claudin-Low乳腺癌更常见(P（P）=1.98E-40和P（P）分别为2.47E-68）。值得注意的是，LCM和非LCM队列中乳腺癌亚型的EMT特征之间的高度相似性表明，EMT评分能够捕获样本的整体EMT状态，即使存在基质。为了进一步确保通用EMT签名的有效性，我们计算了一组体外各种癌症的功能研究（补充图S3，补充表S3）。在每项功能研究中，无论癌症类型如何，普通EMT评分都准确反映了EMT表型（补充图S3）。例如，具有以下特征的细胞系的EMT得分始终较高CDH1型或槽口3敲除、用TGFβ处理的细胞株和组成性表达EMT诱导物的细胞株，扭转1,蜗牛,GSC公司，与对照细胞系相比（补充图S3；P（P）< 0.05). 相反，过度表达的细胞系GRHL2型-一种转录因子，通常在EMTed细胞中表达不足（Cieply等,2012)-EMT评分较低，表明Epi表型较多。因此，EMT评分可以常规确定不同干预措施下细胞系的Epi或Mes表型，这与以前的EMT研究（Onder等,2008; 海尔纳等,2009; 马利齐亚等,2009; Yanagawa村等,2009; 毛平等,2010; 陶布等,2010; 大桥等,2011; 谢普利等,2012; 达马托等,2012; 蔡等,2013; 德谢尔等,2013)从而再次验证了我们的通用EMT评分方法。

胰腺癌不包括在我们最初推导的EMT特征中。由于EMT与胰腺癌有关，所以这种通用的EMT特征也可以准确估计胰腺癌中的EMT状态，这一点很重要。我们发现，普通EMT评分与各种胰腺癌细胞系中EMT标记物（如ZEB1、VIM和转移能力）的免疫荧光染色呈正相关（补充图S4，补充文本）。因此，数据验证了胰腺癌中的通用EMT特征。

最后，为了开发更小、更具成本效益的EMT签名，我们探索了减少通用EMT签名中基因数量的可能性（补充文本，补充图S5）。我们确定了一个40-50%较小的通用EMT特征，其与完整通用EMT标志的总体相关性为0.85-0.88，并且在估计EMT状态方面具有良好的一致性（75.08-95.8%）（补充文本，补充表S3和S4A）。然而，以下分析继续使用完整的通用EMT签名。

通用EMT签名的应用

在多种癌症中发现EMT谱

接下来，我们对多个临床样本和细胞系进行了普通EMT评分（图​（图3，三，补充图S6，补充表S4A–D）。在膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到广泛的EMT评分。令人惊讶的是，造血和淋巴恶性肿瘤，如淋巴瘤、急性髓性白血病和多发性骨髓瘤，也显示了EMT评分谱，尽管范围较窄。结直肠癌主要是表观癌(P（P）<1E-50），而肾癌表现出强烈的Mes特征(对=2.47E-53），可能反映出肾上皮来源于中胚层Mes细胞的凝结。有趣的是，尽管肝细胞起源于原始的表内胚层，但肝癌的EMT评分范围很广。其他主要为Mes的肿瘤包括生殖细胞肿瘤(P（P）=1.9E-22），恶性黑色素瘤(P（P）=1.38E-42），肉瘤(P（P）=1.7E-34），胶质母细胞瘤和神经母细胞瘤(P（P）<1E-50）。细胞系中EMT评分的平均值和离散度相似（图​（图3），三)广泛分布于膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌和前列腺癌细胞系。结直肠癌细胞系以Epi为主(P（P）=2.61E-17），而肾癌(P（P）=7.92E-5），恶性黑色素瘤(P（P）=8.17E-9），肉瘤(P（P）=1.51E-7）和胶质母细胞瘤(P（P）=5.67E-19）细胞系通常为Mes，与肿瘤中的观察结果相似。与临床样本一致，生殖细胞肿瘤细胞系表现出Mes倾向(P（P）= 0.58); 缺乏意义可能是因为细胞株数量有限。注意图中的肿瘤和细胞系​图3三未配对。因此，肿瘤的组织学组成、分级、分期和细胞系不同，导致EMT评分分布的差异，例如前列腺癌。这些结果表明，每种癌症类型都有其特征的EMT谱。

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不同癌症类型的上皮-间充质转化（EMT）评分

EMT评分的散点图（平均值±SEM；年-轴）临床样本（上面板）和细胞系（下面板）中的各种癌症，按癌症类型和平均EMT评分排序。接近+1.0的EMT评分更像间充质（Mes），而接近−1.0的EMT评分更像上皮（Epi）。癌症细胞系百科全书（CCLE）（Barretina）中重叠细胞系的EMT评分等,2012)和SANGER/COSMIC（加内特等,2012)收集的数据是平均值。

EMT状态不一定与较差的生存率相关

为了研究EMTed状态是否普遍与低生存率相关，我们对Epi和Mes肿瘤进行了队列和癌症类型的Kaplan–Meier分析（图​（图4）。4). 有趣的是，如危险比（HR）图（图​（图4）。4). 为了包含尽可能多的数据，我们采用了DFS的广义定义，其中包括无进展、无（局部）复发和无远处复发/转移生存。一般来说，卵巢上皮癌患者（队列平均HR[μ人力资源] = 0.68,P（P）=0.018），胃癌，（μ人力资源 =0.7013），胰腺癌（μ人力资源 =0.6006）和胶质母细胞瘤（μ人力资源 =0.81）表现出更好的OS。急性髓系白血病、结直肠癌或肺癌患者的EMT状态与OS无相关性。令人惊讶的是，Mes乳腺癌患者（μ人力资源 = 1.48;P（P）=0.006）和恶性黑色素瘤（μ人力资源 =1.48）操作系统更好（图​（图4A），4A） 与之前的报告形成鲜明对比（Thiery等,2009; 赫斯特卡等,2010; 洛博达等,2011; 谢普利等,2012; 黄等,2012; 再见等,2013; 弗里什等,2013). DFS也观察到了同样有趣的结果（图​（图4B），4B） 卵巢癌和结直肠癌患者的DFS较差（μ人力资源 = 0.5165,P（P）< 0.001; 和μ人力资源 = 0.7669,P（P）=0.002），膀胱癌患者的边际相关性（μ人力资源 = 0.8473). 对于肝癌和肾癌，Mes肿瘤患者的DFS优于Epi肿瘤患者（μ人力资源 分别为1.238和3.948）。乳腺癌患者DFS的结果尚不清楚（HR = 0.4432–2.622;P（P）= 0.252). 总的来说，EMT状态不太可能是生存的唯一预后因素，组织型或分子亚型的组成可能起作用；这表明除了破译EMT状态外，还需要对癌症进行分层。乳腺癌分子亚型（Prat&Perou，2011)其中，对于Basal和Claudin-Low亚型的Epi乳腺癌患者，DFS更好，但与其他亚型无关（补充图S7）。然而，在所有乳腺癌队列中，Basal亚型和Claudin-Low亚型的EMT和DFS的相关性可能由于样本量较小而不一致。

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上皮-间质转化（EMT）评分与生存率的相关性

A、 B类 日志绘图2比较不同癌症和队列中Epi和Mes肿瘤的（A）总生存率（OS）和（B）无病生存率（DFS）的危险比（HR；平均±95%置信区间）。DFS包括无进展、无复发和无远处转移生存率（包括无远处转移存活率的队列用*表示）。对应P（P）-log-rank检验的值在每个队列的旁边给出，那些有显著差异的值(P（P）<0.05）标记为红色2HR<0.0表示Epi肿瘤具有生存益处，而log2HR>0.0表示Mes肿瘤具有生存益处。荟萃分析P（P）-使用DerSimonian–Laird二元随机效应（整体）或Peto固定效应方法（单个癌症）计算效应或异质性的值。

EMT状态不一定转化为化疗耐药性

为了研究EMT和化疗耐药之间的关系，我们使用乳腺实体瘤反应评估标准（RECIST）比较了患者的临床结果（Horak等,2013)和卵巢癌（The cancer Genome Atlas Research，2011)队列（图​（图5A）。5A） ●●●●。在这些队列中，乳腺癌患者接受了序贯新辅助治疗（阿霉素和环磷酰胺），而卵巢癌患者则主要接受了基于铂的治疗。在不考虑治疗方案的情况下，RECIST组之间的EMT评分没有显著差异。因此，我们基于2KS将肿瘤分为Epi、中级和Mes(P（P）<0.05），并观察到Mes乳腺癌在进展性疾病（PD）类别中的增加(P（P）= 0.3303). 对另外11个乳腺癌队列的分析(GSE48905型,GSE33658标准,GSE23428标准,GSE22226标准,GSE18864标准,GSE28796标准,GSE16646标准,GSE22513标准,GSE4779型,GSE18728标准和GSE50948标准)（农民等,2009; 鲍尔等,2010; 科尔德等,2010; 银色等,2010; 莱曼等,2011; 马萨韦等,2011; 凯里等,2012; 埃瑟曼等,2012; 埃文斯等,2012; 努森等,2014; 普拉特等,2014)其中，患者接受了不同的新辅助治疗方案，包括富尔维斯特、阿那曲唑、卡铂、阿霉素和其他药物（补充图S8A），在每个临床反应组中，Epi、中级和Mes乳腺癌的分布相似。值得注意的是，最差反应组（PD或残留病）主要由Mes乳腺癌患者组成。因此，在化疗耐药患者中，Mes的比例呈上升趋势，而Epi乳腺癌的比例呈下降趋势。我们还注意到卵巢癌患者中Epi比例下降的趋势，以及从完全缓解（CR）到PD（50-42%）的变化，尽管Mes卵巢癌患者的PD没有显著增加(P（P）= 0.556).

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普通上皮-间充质细胞转化（EMT）与药物敏感性
  1. 乳房条形图(n个= 270; 左面板）和卵巢(n个= 328; 右面板）根据实体肿瘤反应评估标准（RECIST），根据EMT状态和临床反应对癌症进行分层。方案为乳腺癌新辅助治疗阿霉素和环磷酰胺，卵巢癌以铂为基础的辅助/进展/复发化疗。在每个临床反应组中给出了EMT状态的百分比分布。缩写：CR，完全响应；PR，部分响应；SD，稳定疾病；PD，进展性疾病。绿色，上皮样（Epi）；橙色，中间色；红色，间充质样（Mes）。
  2. 无论癌症类型如何，EMT与药物敏感性相关性的火山图。罗∈ [−1.0, +1.0] (x个-轴）和-日志10P（P）-价值(年-轴）通过Spearman相关系数检验计算。的虚线P（P）-绘制值=0.1。红色和绿色表示Mes肿瘤的耐药性较高(罗∈[0，+1.0]）和Epi肿瘤(罗∈[-1.0，0]）。
  3. Kaplan–Meier分析比较了Epi（绿色）和Mes（红色）卵巢癌患者接受紫杉醇（深色）或紫杉醇不（浅色）治疗方案的总体生存率（左侧面板）和无病生存率（右侧面板）。P（P）-报告值通过log-rank检验计算。缩写：HR=危害比。

由于EMT评分的分布不允许我们将某些其他癌症分为Epi组、中间组和Mes组，我们接下来研究了这些癌症中有应答者和无应答者的EMT评分曲线（补充图S8B）。这项研究是利用以Epi结直肠癌为主的队列进行的(GSE19862,GSE35452标准,GSE46862型)（吉米等,2014)，头颈部癌症队列(GSE32877标准)（托姆基维茨等,2012)以及一组以Mes黑色素瘤为主的患者(GSE22968标准)（比斯利等,2011). 在EMT评分方面，应答者和非应答者之间没有显著差异，尽管有轻微的趋势，应答者倾向于在以Epi为主的结直肠癌中有较高的EMT评分，而应答者在以Mes为主的黑色素瘤中有较低的EMT得分（补充图S8B）。这些数据表明，EMT可能与化疗耐药相关；然而，目前的结果仍不确定。缺乏结论性结果可能是因为这些患者中的大多数已经接受了不止一种化疗化合物的治疗，这可能混淆了EMT和化疗耐药性在这些患者中的作用。此外，由于这些数据来自相对较小的队列，需要进一步研究来验证当前的观察结果。

因此，为了寻找EMT和化疗之间的联系，并探索Epi和Mes癌症的潜在治疗方案，我们分析了SANGER/COSMIC（Garnett等,2012)数据库（2013年4月16日）。我们将EMT评分与半数最大抑制浓度（IC50)138种化合物（图​（图5B，5B、 补充图S9，补充表S5）使用斯皮尔曼相关系数检验，因为它测量了总体趋势，不需要定义敏感或抗性类别。我们采用了一个不太严格的阈值(P（P）<0.1），因为某些药物的样本有限。令人惊讶的是，EMT状态并没有系统地转化为细胞化疗抵抗（图​（图5B，5B、 补充图S9），与之前细胞表型和获得耐药性之间的关联相矛盾（Witta等,2006; 阿鲁姆甘等,2009; 赫斯特卡等,2010; 塞提等,2010; 马奇尼等,2013). 无论癌症类型如何，Mes和Epi细胞系优先对某些化合物敏感。Mes细胞系对Afatinib和Gefinitib的耐药性更强（对表皮生长因子受体)但对PDK1激酶抑制剂BX-795和HSP-90抑制剂Elesclomol更敏感（图​（图5B）。5B） ●●●●。有趣的是，Epi细胞系对64种化合物具有耐药性，而Mes细胞系仅对7种化合物具有抗性，尽管相关性较弱(罗∈ [−0.35, +0.37]). 当按癌症类型分层时，我们观察到对某些化合物具有类似的优先敏感性模式。值得注意的是，Mes胰腺癌、恶性黑色素瘤、肾癌和肝癌细胞系对靶向微管动力学的化合物更敏感，如长春花碱和多西紫杉醇。相比之下，Mes乳腺癌、肺癌和子宫癌细胞系对Afatinib和Gefinitib的耐药性更强（补充图S9）。先前的观察报告表明，EMT与表皮生长因子受体非小细胞肺癌（NSCLC）的抑制剂耐药性等,2013). 使用我们的通用EMT评分，我们观察到不限于NSCLC的Epi细胞系对表皮生长因子受体或两者兼而有之表皮生长因子受体和ERBB2号机组（厄洛替尼、拉帕替尼、BIBW2992和吉非替尼）在SANGER/COSMIC（加内特等,2012)和癌症细胞系百科全书（CCLE）（Barretina等,2012)数据库（补充表S5）。具有致敏作用的细胞系表皮生长因子受体激活突变（L861Q、G719S、外显子19框内缺失）（Carr等,2004)与野生型细胞系相比，EMT评分显著降低(P（P）= 0.0056). 另一方面，承载辅助网关守卫的手机线路表皮生长因子受体-T790M突变，对表皮生长因子受体抑制剂（Gazdar，2009)，Mes更多（EMT得分=0.23）。因此，过敏性疾病的发病率较高表皮生长因子受体突变可能是Epi癌对表皮生长因子受体抑制剂。虽然目前还无法断定Epi或Mes是否对某些化合物具有耐药性（由于适度的相关性和P（P）-值），这些结果表明Epi和Mes细胞系对某些化合物有不同的反应。此外，我们发现Epi和Mes细胞系对某些化合物也有优先反应，EMT并不是所有化疗或靶向治疗中驱动耐药性的唯一机制。

在EMT评分和IC的相关分析中，Epi和Mes癌症的这些有趣的优先药物敏感性50138种化合物（EMT评分-IC50; 补充表S5）促使我们调查这些发现的相关性，因为细胞系并没有完全例证原发性肿瘤的行为。我们选择卵巢癌作为本试验性研究的模型，因为卵巢癌的一线治疗主要是顺铂/卡铂和紫杉醇，这可以提供一种较不复杂的EMT与药物相互作用的机制。积极主动，在EMT得分中——IC50相关性分析，我们发现Mes卵巢癌对顺铂有优先敏感性(罗=−0.37）和紫杉醇(罗 = −1.0; 补充表S5）。然后进行Kaplan–Meier分析，将治疗方案分为Epi和Mes卵巢癌患者（图​（图5C）；5C） ；这是使用图中描述的2KS标准进行的​图5A。5A.因为很少有患者没有接受顺铂/卡铂治疗(n个<10），我们重点分析了紫杉醇的作用。令人惊讶的是，接受紫杉醇方案治疗的Epi和Mes卵巢癌患者与接受不含紫杉醇的方案治疗的患者相比，OS和DFS结果显著不同（图​（图5C）。5C） ●●●●。接受含紫杉醇方案治疗的Epi患者的DFS较差(P（P）=0.0039），而紫杉醇治疗的梅斯患者显示出更好的DFS(P（P）=0.039）和OS(P（P）= 0.0006); Mes患者的这些结果反映了从EMT评分-IC中获得的结果50分析表明，Mes对紫杉醇更敏感。对于表现出中间EMTed表型的卵巢癌患者，我们发现DFS或OS结果没有显著差异。在胶质瘤中也观察到Epi和Mes肿瘤的这种不同治疗反应（Desmedt等,2009)和多发性骨髓瘤（Erdem-Eraslan等,2013)（补充图S10，补充信息）。尽管接受放疗和化疗的胶质瘤患者通常有更好的OS，但Mes胶质瘤患者的获益更大(P（P）= 0.0117). 相反，当使用硼替佐米代替地塞米松时，Epi多发性骨髓瘤患者的DFS率更好(P（P）= 0.0349). 然而，我们观察到ER+乳腺癌患者（Mulligan等,2007)在EMT分层方面使用来曲唑或他莫昔芬的患者。总的来说，这些结果提供了体内EMT评分结果的证据–IC50相关性分析显示Epi和Mes肿瘤患者的优先药物敏感性以及他们对特定化疗方案的不同反应。

讨论

越来越多的证据表明EMT在癌症进展、转移和耐药性中的作用。然而，对肿瘤中的EMT进行充分评估的困难导致了关于癌症中是否存在EMT的争议（约旦等,2011). 为了解决这个问题，我们开发了一种通用的EMT特征来定量评估肿瘤和细胞系中EMT的程度。据我们所知，这是首次寻求通用EMT特征，以捕捉肿瘤或细胞中EMT的普遍特征。以前的报告表明，EMT的中间状态显示出最高的塑性（约旦等,2011; 黄等,2013)从而代表了诱发或逆转EMT的适当阶段。EMT评分的变化捕捉并反映了细胞或组织中的这种表型转变；这种方法在先前的应用中得到了明智的说明，其中Epi-MCF7乳腺癌细胞在用SNAI1公司（阿卡莱等,2013). 具有监测这种转变的能力将有助于评估EMT逆转治疗的有效性，并有助于确定能够改善化疗反应的EMT中间状态。重要的是要注意EMT的完全逆转可能是不希望的，因为Mes微转移必须重新获得Epi表型才能在转移部位增殖（Thiery，2002)；最近的证据表明，逆转EMT可能促进转移定植（蔡等,2012). 因此，主要的挑战是，我们不知道确切的中间状态，也不知道在什么条件或背景下，原发肿瘤或远处转移部位的癌细胞可以退出休眠状态，恢复生长或变得耐化学药物。在这里，我们验证了我们的通用EMT评分系统的有效性，以反映多种癌症类型的一组功能研究中的EMT转变。在各种肿瘤中确定的EMT谱表明，EMT状态在这些癌症的不同特征及其对治疗的反应中起着因果作用。值得注意的是，特定癌症类型的细胞系和肿瘤之间的EMT谱高度相似，这验证了EMT评分捕捉EMT表型的能力，而不是基质的影响。

癌症的类型通常被认为是EMT状态的良好指标（图​（图3）。三). 例如，结直肠癌主要是Epi，而胶质母细胞瘤、成神经细胞瘤、骨肉瘤、恶性黑色素瘤和生殖细胞瘤主要是Mes。然而，尚不清楚这些表型特征是固有的还是后天获得的。固有的EMT特征可能反映了肿瘤的起源细胞或谱系。事实上，黑色素瘤和神经母细胞瘤分别来自转化的黑素细胞和交感神经祖细胞（Nakaya和Sheng，2013)它起源于神经嵴，在定植不同的胚胎部位之前通过EMT分层，在那里它们分化为外周神经系统的黑素细胞、胶质细胞和神经元。因此，这些神经嵴细胞衍生物保持固有的Mes表型。另一个例子是乳腺癌。大多数EMTed乳腺癌属于Claudin-Low亚型，可能来源于乳腺基底层的高度可塑性细胞；相比之下，可塑性较小的管腔细胞被认为是产生Basal亚型（Taddei等,2008; 林等,2009; Molyneux公司等,2010)（图​（图2B）。2B） ●●●●。在获得性EMT的情况下，该过程可能由肿瘤微环境的变化触发（Valastyan&Weinberg，2011; Lee&Nelson，2012; Tam&Weinberg，2013; 范登·伊恩登等,2013)或药物治疗或细胞毒性应激的影响（Frisch等,2013; 马奇尼等,2013)以及其他因素。这在胰腺癌中得到了例证，胰腺癌来源于与结肠相同的内胚层原代，但与结肠癌相比表现出相对Mes的表型。尽管胰腺癌包含大量基质细胞（Beatty等,2011)，胰腺癌细胞系表现出与结肠细胞相同的EMT谱（图​（图3），三)，支持EMT评分仍然来自胰腺癌细胞而不仅仅是基质细胞的贡献的观点。与此类似，肝癌表现出广泛的EMT评分。由于肝脏也来源于原始内胚层，预计肝癌将表现出Epi表型。在这种情况下，除了基质的作用外，考虑到起源细胞可能经历了E-到N-cadherin的转换也是很有趣的。

尽管许多报告将EMT状态与生存率联系在一起（Witta等,2006; 阿鲁姆甘等,2009; 赫斯特卡等,2010; 塞提等,2010; 洛博达等,2011; 谢普利等,2012; 再见等,2013; 马奇尼等,2013)，我们的EMT评分并不完全支持这些发现。我们发现，卵巢癌、胃癌和胶质母细胞瘤中的EMT状态与OS有关，但在其他类型的癌中没有。就DFS而言，卵巢上皮癌和结直肠癌患者的预后较好。EMT状态与生存率之间的报告相关性存在差异，这一差异令人感兴趣，因为EMT被认为与癌症进展、转移和耐药性有关，所有这些都与较低的生存率密切相关。值得注意的是，大多数小叶组织型乳腺癌以不表达E-cadherin而闻名，其侵袭性并不比E-cadherin-阳性浸润性导管癌（Ferlicot等,2004). 在这里，我们还显示，Mes乳腺癌患者的OS和DFS似乎比Epi乳腺癌的患者更好，似乎与先前报道的情况相反（Hrstka等,2010; 陶布等,2010; 蔡等,2013). 仔细观察，这种差异可能来自于队列中管腔型和三阴性乳腺癌患者的分布。如图所示​图4B，4B、 乳腺癌队列(GSE25066标准)如果Luminal-B和ERBB2+乳腺癌的百分比较低，则Epi乳腺癌的DFS会更好。尽管Luminal-B和ERBB2+乳腺癌亚型属于Epi型（Blick等,2008)（图​（图2B），2B） ，他们的OS和DFS较差，类似于Mes型三阴性乳腺癌（Prat&Perou，2011; 伊希托比等,2013). 因此，更普遍的Epi Luminal-B和ERBB2+乳腺癌导致Epi乳腺癌队列中的生存曲线较差，这表明癌症类型的异质性可能掩盖并困惑EMT的作用。因此，可能需要按分子亚型分层来研究EMT的作用。事实上，当按乳腺癌分子亚型（Prat&Perou，2011)，如果Epi乳腺癌患者的癌症是Basal和Claudin-Low亚型，而不是其他亚型，则他们的DFS表现更好（补充图S7）。

基质细胞和癌细胞之间的串扰在转移中起主要作用（Park等,2011)因此可能会影响EMT评分的结果。在乳腺癌中，乳腺上皮细胞可以采用基质基因表达模式，这与接受EMT时的反应性基质没有区别（Farmer等,2009). 由于反应性基质和EMT诱导的基质表达之间没有区别，这可能会在某些Epi肿瘤中产生较高的EMT评分。LCM和非LCM乳腺癌队列的EMT评分（图​（图2B）2B） Epi、Luminal-a亚型的EMT分数稍低，表明基质的贡献可能在一定程度上掩盖了EMT分数的精确评估。然而，考虑到RNA的不稳定性和从癌细胞中分离基质的劳动密集型过程，评估基质的贡献是非常重要的（Park等,2011). 因此，很难量化基质对EMT评分的影响。然而，除了LCM和非LCM乳腺癌队列中的微小EMT评分差异外，我们还显示了使用肿瘤和细胞系特异性特征计算的一般EMT评分之间的强相关性（补充表S1C）。这一结果表明，尽管基质可能掩盖了转录组对EMT的精确评估，但其影响并不显著。因此，我们认为EMT评分相对独立于基质影响，但可能不受克隆异质性的影响。其他研究表明，尽管基底样肿瘤中EMT癌细胞的比例较高，但在管腔性乳腺肿瘤中也能见到此类细胞（Sarrio等,2008). 因此，除了EMT评分外，分析这些EMTed细胞和CTC的表型和克隆原性也很有用（Thiery&Lim，2013). 我们实验室正在进行的关于CTC的研究正在探索EMT评分是否反映了癌症扩散和治疗难治的倾向。CTC表现出广泛的EMT表型，与原发肿瘤无关（Valastyan和Weinberg，2011; Thiery&Lim，2013; 于等,2013). 因此，原发肿瘤的转移能力可能存在于一小部分细胞中，其表型未知，无法通过EMT评分方法进行评估。

我们的发现与以往EMT状态和耐药性之间的联系明显不同（Witta等,2006; 阿鲁姆甘等,2009; 赫斯特卡等,2010; 塞提等,2010; 马奇尼等,2013). 虽然我们承认细胞系和IC的局限性50作为药物检测（Haibe-Kains等,2013)，我们相信我们的结果提供了EMT和耐药性的鸟瞰图。通过EMT状态和治疗方案评估卵巢癌患者的OS和DFS结果，我们发现上皮性卵巢癌对紫杉醇更具耐药性，而Mes卵巢癌对紫杉醇具有优先敏感性。这表明不同程度EMT的癌症对特定化合物有明显的反应，这与我们之前在卵巢癌方面的研究一致（Miow等,2014)-并支持EMT评分-IC的实用性50细胞系相关性分析。更重要的是，这些结果表明，Mes而非Epi卵巢癌患者将受益于含有紫杉醇的治疗方案。与此相一致，日本妇科肿瘤研究小组证明，在复发性卵巢癌患者中，每周服用紫杉醇与每3周服用一次紫杉醇联合卡铂相比，具有生存优势（Baird等,2010)复发性卵巢癌的Mes（Tan等,2013). 与我们的研究结果类似，胃癌患者对Mes富集的化疗反应与未富集Mes的亚型患者不同，并且对顺铂（Tan）更敏感等,2011). 总的来说，我们的数据表明，并非所有Mes癌都对化疗耐药，而且EMT状态不一定转化为耐药倾向。事实上，睾丸癌是一种高度Mes生殖细胞肿瘤，对顺铂极为敏感（Masters&Koberle，2003; 埃克斯坦，2011). 此外，尽管EMT通常与获得干细胞样特征有关，优先级x1将EMT和干细胞分离，导致耐药、转移定植（Ocana等,2012). 因此，我们假设不仅是EMT的获得，而是EMT干细胞样表型导致耐药（Brabletz，2012). 弗里希等(2013)提出了一个类似的概念，表明EMT是通过触发EMT诱导物来抑制细胞极性获得的，干细胞样特征是通过参与WNT和Hippo通路等其他程序获得的。目前的通用EMT特征可能估计EMT的程度，但不能估计癌干细胞样表型的程度或行为。这种区别在控制和HMGA2型-敲除-一种与干细胞有关的基因（科普利等,2013)-MDA-MB-231乳腺癌细胞（补充图S3），可以解释一般EMT评分和治疗耐药性之间的有限相关性，因为癌症干细胞可能对乳腺肿瘤的进展产生影响（Sarrio等,2008)和结肠（Brabletz，2012)表观肿瘤。在我们的初步分析中，尽管茎干和普通EMT评分之间存在一些中度相关性，但不同癌症类型之间的相关性并不一致，这可能表明不同的癌症采用不同的程序来获得茎干（补充文本，补充图S11）。此外，在考虑干性和EMT的相关性时，必须考虑乳腺癌中不同类型干细胞的存在（Liu等,2014). 最后，Mes细胞系对各种化合物的敏感性较低(表皮生长因子受体抑制剂）可能是由于这些细胞系中靶向突变的发生率较低。然而，尚不清楚表皮生长因子受体突变是这些癌症的主要驱动因素，无论这些突变是获得的还是内在的，都在启动或调节EMT中起作用。

总的来说，我们证明了应用通用EMT评分检查不同癌症的EMT谱的可行性，以及其与生存率和化疗耐药性的相关性。我们认为，拟议的通用EMT评分是一个有前途的通用工具，可用于评估EMT表型，无论癌症类型如何，系统地研究EMT，并更客观地评估EMT效应器或药物对表型变化的影响。它还提供了更客观的EMT评分体外而不是通过目视检查或标记评估进行估计。

材料和方法

Affymetrix微阵列表达数据的数据预处理

按照说明进行预处理和质量检查（Tan等,2013)（补充材料和方法）。Affymetrix U133A或U133Plus2膀胱平台上的数据集(n个=132），胸围(n个=3992），结直肠(n个=1820），胃(n个=231）和卵巢(n个=1538）癌症，以及非小细胞肺癌和肺腺癌(n个=481）从基因表达总览（GEO）、阵列表达、肿瘤表达项目（ExpO）和癌症基因组图谱（TCGA）下载（补充表S6）。LCM乳腺癌队列研究(n个=417）由日本癌症研究基金会提供(http://www.jfcr.or.jp/英语; 补充材料和方法；5002克). 使用R版本3.01、生物导体Affy包1.38.1、稳健多芯片平均值（Gautier等,2004)和ComBat（约翰逊等,2007)分别对已编译、规范化的数据集进行批量调整。从批量调整的数据中去除正常组织。细胞系收集（补充表S7），包括SANGER/COSMIC（加内特等,2012)、CCLE（巴雷蒂纳等,2012)数据集和验证数据集（补充表S8）均采用相同的归一化程序。

BinReg的预测建模和验证

使用BinReg v2.0（Profiler，http://dig.genome.duke.edu/software.html)如前所述（Gatza等,2010; 棕褐色等,2013). 详细信息见补充材料和方法。

肿瘤特异性EMT信号的生成

除了卵巢癌和乳腺癌特异性EMT特征外，我们之前从CDH2和CDH1免疫荧光染色（Akalay等,2013; Miow公司等,2014)，我们设计了一种策略，为其他类型的癌症（膀胱、结肠、胃和肺）生成特定于癌症的EMT特征，如图​图11答：

  1. 从分子特征数据库v4.0（Subramanian）中发布的EMT基因集等,2005)和以前的文献（Lee等,2006; 卡雷特罗等,2010)（补充表S9）进行了整理。
  2. ssGSEA得分（Verhaak等,2013)计算癌细胞系EMT基因集，并与已知Mes和Epi标记的基因表达相关(扭转1,SNAI1公司,SNAI2公司,振动,CDH2公司,ZEB1号机组和CDH1型,地址1,ERBB2号机组,ERBB3号机组,KRT19型)（蒂里等,2009).
  3. 选择与富集分数最相关的基因集对细胞系进行排序。选择10-20个Mes和Epi最多的细胞系进行BinReg建模。两个数据集，GSE9691型（昂德尔等,2008)和GSE24202标准（陶布等,2010)用于BinReg参数设置，并确保派生EMT签名的有效性。（注意：步骤1–3可以递归，以识别在预测EMT状态时具有足够准确度的初始BinReg EMT签名。）
  4. 然后使用BinReg EMT特征来预测特定癌症类型的细胞株和肿瘤样本的EMT状态。
  5. 选择最极端的25%Mes和Epi细胞系或极端的100 Mes和Epi肿瘤，分别生成细胞系和肿瘤的EMT特征；这就避免了签名对训练数据的过度拟合。使用SAM/ROC生成EMT签名（Tusher等,2001; 维哈克等,2013)，应用的阈值为：SAMq个%=0，且ROC>0.8–0.85或<0.15–0.2。
  6. 使用SAM/ROC衍生的EMT特征，然后我们使用双样本Kolmogorov–Smirnov检验（2KS）计算样本的EMT得分。

最终的癌症特异性EMT特征（由SAM/ROC生成）是初始EMT特征的细化（由BinReg生成）。虽然有一个初始的后跟一个改进的最终EMT签名似乎是多余的，但这种方法的好处是三重的。首先，由于收集到的一些已发表的EMT特征来自不同的细胞类型和相对较少的细胞系，因此这些已发表EMT特征可能并不普遍适用，因为它们可能是细胞系特异性或癌症特异性的。在这项研究中，我们使用了一大组细胞系来推导每种癌症类型特有的EMT特征，因此，导出的特征不太可能包含单个细胞系特有的特征。其次，为了确保最终EMT签名的准确性，我们在两个独立的功能EMT研究中验证了初始EMT签名。第三，SAM/ROC从大多数Epi或大多数Mes肿瘤中再生EMT特征，确保了细胞系中有时获得的额外变化不会被包括在内，并且通常会扭曲肿瘤的EMT特征。

通用EMT签名的推导

我们从膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、肺癌和卵巢癌类型的特定EMT信号之间的重叠中得出了通用EMT信号。我们使用以下公式对在六种癌症特异性EMT特征中选择的基因进行加权：for gene克，基因的权重由以下公式给出：

方程式图像

哪里D类是疾病总数(D类在这种情况下＝6），fc（财务总监）gd公司和q个gd公司折叠式换页和q个-基因的值%，克疾病，d日，由SAM计算。世界车王争霸赛gd公司是基因的ROC值，克疾病，d日、和n个d日是疾病样本数，d日该公式将为具有较大折叠变化、较小折叠变化的基因赋予更高的权重q个-值%、较大的ROC值和大量样本。我们用z（z）-转换重量>3.09或P（P）<0.001（补充表S1A和B）。

EMT分数的计算

为了计算样本的EMT得分，我们采用了与ssGSEA（Verhaak）类似的方法等,2013). 估计Epi和Mes基因集的经验累积分布函数（ECDF）。使用2KS测试计算Mes ECDF（ECDF）之间的差异网格)和Epi ECDF（ECDFEpi公司). 然后将2KS得分作为EMT得分。EMT分数阳性的样本表现出更多的Mes表型，而EMT分数阴性的样本则反映出更多的Epi表型。请注意，2KS测试允许将样本分离为Epi（2KS分数ECDFEpi公司>ECDF公司网格;P（P）<0.05），中等Epi（2KS分数ECDFEpi公司>ECDF公司网格;P（P）≥0.05），中等Mes（2KS分数ECDFEpi公司<欧洲资本发展基金网格,P（P）≥0.05）和Mes（2KS评分ECDFEpi公司<欧洲资本发展基金网格,对< 0.05). EMT签名在补充表S1A和B中给出。用于计算EMT分数和计算EMT分数的Matlab®R2012a脚本可以通过http://www.csi.nus.edu.sg/bioinfo/index.php.

论文解释道

问题

在上皮-间充质转化（EMT）过程中，上皮细胞失去极性并获得类似于间充质细胞的迁移特性。EMT是一个具有中间状态的动态过程，而不是二元过程，因此在文化或体内因此，其在癌症中的作用仍有争议。

结果

我们使用基因表达建立EMT评分方法，并定量评估大量细胞系和肿瘤中EMT的程度（-1.0至+1.0），以反映上皮和间充质状态以及过渡期间出现的潜在中间状态。

影响

我们应用EMT评分来确定其在将EMT状态与患者生存率和治疗反应相关联方面的疗效。这种通用的EMT评分可以在癌症进展、生存和整个临床治疗反应的许多参数中对EMT进行客观和系统的研究。

统计分析

DerSimonian–使用默认设置的OpenMeta[Analyst]软件进行Laird二进制随机或Peto固定效应荟萃分析。Kaplan–Meier分析中的对数秩检验由GraphPad Prism®5.0版（加利福尼亚州拉霍亚市GraphPad-Software）计算得出。Mann–Whitney、Fisher精确和Spearman相关系数测试由Matlab®R2012a统计工具箱8.0版（MathWorks，Natick，MA）计算得出。

致谢

我们感谢R.Jackson博士对英语的精心编辑。我们感谢新加坡癌症科学研究所、新加坡国家研究基金会总理办公室、新加坡国家医学研究委员会/新加坡国立大学癌症研究所中心赠款/EMT主题CG12Aug12、新加坡国立大学生物化学系的财政支持，新加坡A*STAR分子与细胞生物学研究所。

作者贡献

JPT和RYH构思了这个想法；JPT和RYH设计了该项目并获得了资金；TZT、QHM、JPT和RYH撰写了论文；TZT进行生物信息学分析；YM、MM、TN和SM提供了激光捕获微切片乳腺癌样本。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

有关更多信息

基因表达综合（GEO）：网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds

ArrayExpress：http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/

癌症基因组图谱（TCGA）：https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga网站/

分子特征数据库（MSigDB）：http://www.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp

癌症细胞系百科全书（CCLE）：http://www.broadinstitute.org/ccle/home

SANGER COSMIC细胞系：http://cancer.sanger.ac.uk/cancergene/projects/cell_lines/

计算通用EMT分数：http://www.csi.nus.edu.sg/bioinfo/index.php

BinReg/Profiler软件：http://dig.genome.duke.edu/software.html

DAVID功能注释工具：http://david.abcc.ncfcrf.gov/summary.jsp

支持信息

补充信息本文在线阅读：http://embomolmed.embopress.org

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