ZEB1和miR-200家族成员之间的相互抑制促进EMT和癌细胞的侵袭

摘要

介绍

越来越多的证据表明，胚胎程序“上皮-间充质转化”（EMT）的异常激活促进了肿瘤细胞的侵袭和转移(Berx公司等, 2007). EMT可以使细胞相互分离，并增加细胞流动性，这两者都是肿瘤细胞传播所必需的。转移瘤通常重述原发肿瘤的分化表型；因此，EMT似乎在侵袭性肿瘤边缘被诱导性肿瘤环境短暂激活，但在生长性转移中被逆转(布拉布莱茨等, 2001,2005). EMT的激活物，如转化生长因子（TGF）β、肿瘤坏死因子α（TNFα）和肝细胞生长因子，由浸润细胞或肿瘤细胞自身产生，并触发EMT诱导转录抑制因子的表达(Thiery&Sleeman，2006年). 这些包括蜗牛家族成员、基本螺旋-环-螺旋家族成员、Goosecoid和ZFH家族成员（锌指电子盒绑定同源盒（ZEB）1和ZEB2；Barrallo-Gimeno&Nieto，2005年；雨果等, 2007；佩纳多等, 2007). 最近，我们描述了ZEB1在人类结直肠癌和乳腺癌中是一种重要的EMT激活剂，并抑制基底膜成分的表达(斯帕德纳等, 2006)和电池极性因素(艾格纳等, 2007；斯帕德纳等, 2008). 在小鼠异种移植模型中，ZEB1的表达促进肿瘤细胞的转移，表明ZEB1在人类肿瘤侵袭和转移中的作用(斯帕德纳等, 2008).

MicroRNAs（miRNAs）是一种小的非编码RNA，可以通过特异性结合和切割信使RNA或抑制其翻译来沉默同源靶基因(巴特尔，2004年). miRNAs调节不同的细胞过程，一些miRNAs被证明具有肿瘤抑制或致癌基因的功能(Esquela-Kerscher&Slack，2006年). 最近的重要例子是致癌miR-10b，它促进转移(妈妈等, 2007)和miR-335/miR-126，抑制乳腺癌转移(塔瓦佐伊等, 2008).

由于miRNAs的这些重要调节功能，了解其表达如何受到上游因子的调节是非常重要的。在这里，我们讨论这一点，并重点关注癌细胞中EMT的激活和稳定。我们研究了关键EMT激活物ZEB1的异常表达与潜在EMT调节miRNAs的控制是否相关，是否可以协同促进恶性肿瘤的进展。

结果

ZEB1直接抑制miRNAs的转录

TGFβ和TNFα已被证明在分化的结直肠癌细胞中诱导EMT(贝茨等, 2005). 我们观察到TGFβ/TNFα对分化胰腺癌（HPAF2）、结直肠癌（DLD1）和乳腺癌（MCF7）细胞系中EMT的激活。因此，ZEB1是这种EMT的关键细胞内递质，因为它的表达受到两种细胞因子的上调，并且它的敲除部分阻止了EMT(补充图1A、B在线）。ZEB1抑制的直接上皮靶基因，如E-cadherin、细胞极性因子和基底膜成分，已在前面描述过(Grooteclaes&Frisch，2000年；艾格纳等, 2007；斯帕德纳等, 2008). 在这里，我们研究了ZEB1是否也影响miRNAs的表达，以及是否检测到的miRNA本身是EMT的候选调节因子。

使用miRNA表达微阵列筛选分析SW480和HCT116结直肠癌和MDA-MB231乳腺癌细胞克隆，与对照敲除克隆（shCtl）相比，这些克隆具有稳定的短发夹RNA介导的ZEB1敲除（shZEB克隆）。我们之前已经表明，在这些克隆中，ZEB1的稳定敲低导致成纤维细胞表型逆转，向上皮分化，即间充质-上皮转化(斯帕德纳等, 2008). 在微阵列屏幕上包含的743个人类、大鼠和小鼠miRNA中，我们检测到ZEB1敲除至少一个细胞系中79个miRNAs（10.59%）、两个细胞系的17个miRNAs（2.27%）和所有三个细胞系只有4个miRNA（0.53%）后，平均上调（>1.75倍）(图1；补充表1在线）。未分化乳腺癌细胞系MDA-MB231的作用最强。值得注意的是，所有细胞系中四种上调的miRNAs中有三种（miR-141、miR-200b和miR-200c）属于高度保守的miRNA-200家族，最近与上皮分化的诱导有关(赫托等, 2007；格雷戈里等, 2008；公园等, 2008). 进一步的分析集中在miR-141和miR-200c上，它们在所有三种癌细胞株中的ZEB1被敲除后表现出最强的上调作用。

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图1

敲除ZEB1可增强microRNA的表达。用于microRNA（miRNA）表达阵列筛选的乳腺癌（MDA-MB231）和结直肠癌（SW480和HCT116）细胞系的特征短发夹控制（shCtl）和shZEB1敲除克隆的E-cadherin和β-catenin的生长模式和染色。显示了每两个克隆的平均相对ZEB1表达水平。显示了平均miRNA表达值（每个细胞系中每两个独立的sh对照或shZEB1克隆的两次杂交）。敲除ZEB1导致所有三种细胞系中指示的miRNAs上调。ZEB1，锌指电子盒绑定同源盒1。

通过实时PCR对miR-141和miR-200c的阵列数据进行验证，结果表明，在未分化胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌细胞系中，ZEB1基因敲除后，阵列数据显著增加(补充图1C在线）。接下来，我们研究了ZEB1是否直接抑制miR-141型和miR-200c型miRNA基因。这两种miRNAs都紧密地定位在人类染色体12p13.31上，并且干环序列仅由338个碱基对的间隔序列分开(图2A). 该间隔子和假定的启动子位于hsa-miR-200c干环上游600 bp处，包含六个假定的ZEB1结合序列，其中两个限制于ZEB因子（Z-box 1和2，CAGGTA）。剩下的四个是完美的电子盒（电子盒1-4，CAGGTG），除了ZEB1外，它还代表了其他EMT激活剂（如蜗牛因子）的假定结合位点。请注意，从斑马鱼到人类的进化过程中，miRNA基因的整体结构和两个Z盒以及E-box 2高度保守(图2A). 所有保守的ZEB1结合序列都位于假定的启动子内，而间隔序列中的两个E盒不保守。将假定的启动子（相对于miR-200c茎环的第一个核苷酸为−683到−67）和间隔子（+66到+338）克隆到荧光素酶报告载体后，评估ZEB1依赖性活性。与shCtl细胞克隆相比，shRNA介导的ZEB1在所有未分化结直肠癌、乳腺癌和胰腺癌细胞系中的敲除导致启动子活性增强(图2B，左）。相反，ZEB1过表达以剂量依赖的方式抑制启动子活性。Snail1过表达后也观察到了类似的作用，尽管程度较低，但仅能与推定启动子内四个潜在ZEB1结合位点中的两个结合(图2B，中间）。ZEB1的表达水平对间隔序列的转录活性没有显著影响。两个高度保守的Z-box的突变表明Z-box2具有ZEB1最强的抑制功能(图2B（右），并且使启动子活性对ZEB1的稳定敲除不敏感(补充图1D在线）。利用ZEB1的重组DNA-结合域和SW480结直肠癌细胞的核提取物，通过电迁移率位移分析显示ZEB1与两个保守的ZEB1位点（Z-box）直接结合(图2C). 通过将染色质免疫沉淀（ChIP）与SW480或HCT116结直肠癌细胞的染色质结合，我们可以表明内源性ZEB1与天然启动子区结合(图2D). 这些数据表明，转录阻遏物ZEB1通过与miR-141和miR-200c的假定共同启动子结合，可以直接抑制miR-141和miR-2001c的表达。

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图2

ZEB1直接抑制miR-141和miR-200c的转录。(A类)染色体12p13.31上hsa-miR-141和hsa-miR-200c的基因组组织示意图，以及高度保守的Z盒和E盒的对齐。指出了ZEB1结合位点、克隆的启动子和间隔区序列以及ChIP的扩增区域。所有数字都是相对于hsa-miR-200c干-环序列的开始。(B类)左图：在指示的未分化大肠（SW480）、乳腺（MDA-MB231）和胰腺（Panc-1）细胞克隆中稳定的ZEB1敲除增强了假定启动子的活性，但没有或仅微弱地增强了间隔序列的活性。相应的短发夹控制（shCtl）克隆的平均值设置为1。中间面板：HCT116细胞中ZEB1和Snai1的过度表达以剂量依赖的方式抑制启动子的活性，但不抑制间隔序列。启动子的绝对转录活性是间隔序列活性的55倍。右面板：Z盒突变（mut）使启动子对ZEB1的抑制不太敏感。(C)利用ZEB1重组DNA-结合域或SW480结直肠癌细胞核提取物（右图）和所示标记探针进行电迁移分析。两个保守Z盒（Z1，Z2）的突变强烈降低了特异性结合复合物（星号）。三种不同的抗ZEB1抗血清（非对照血清）超移（箭头）一种特殊的复合物（星号），该复合物在突变探针中缺失，表明它含有ZEB1。白细胞介素-2启动子（NRE）已知的ZEB1结合位点被用作阳性对照。(D类)ChIP与两种不同的ZEB1抗血清显示体内ZEB1与所示结直肠癌细胞系中假定启动子的结合。ChIP，染色质免疫沉淀；甘油醛-3-磷酸脱氢酶；野生型；ZEB1，锌指电子盒绑定同源盒1。

ZEB1靶向的miRNAs是EMT抑制剂

接下来，我们研究了ZEB1抑制的两个miRNAs是否代表直接EMT调节因子。我们发现miR-200c和miR-141是上皮表型的强诱导剂，最近在我们的研究过程中其他小组也报道了这一点(赫托等, 2007；格雷戈里等, 2008；公园等, 2008). miR-141和miR-200c的瞬时过表达导致未分化癌细胞的上皮分化诱导(图3A；补充图2A、B在线）。特别是，miR-200c的总体效果与ZEB1敲除的强大效果相当。值得注意的是，miR-200c和在较小程度上miR-141也导致E-cadherin表达增加和细胞-细胞粘附，以及正常人成纤维细胞的扩散减少(补充图2C在线）。miR-200c的过度表达强烈减少了癌细胞向Matrigel的迁移和侵袭，表明其在恶性肿瘤进展中具有潜在的抑制作用(图3B；补充图2D在线）。相反，用miR-200c抑制剂和较小程度的miR-141抑制剂治疗分化的癌细胞系HPAF2和DLD1，可导致间充质转化，如细胞散射、波形蛋白上调和E-cadherin表达降低所示(图3C). 我们知道乳腺癌细胞系MDA-MB231几乎完全失去了两种miRNAs，是从一种基本类型的乳腺癌中衍生出来的，因此我们分析了各种类型的人类乳腺癌。正如使用癌细胞系预测的那样，我们证实，与常见的导管浸润型乳腺癌相比，以未分化表型和不良临床预后为特征的基础型乳腺癌的两种miRNAs表达均降低(补充图2E在线）。

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图3

miR-141和miR-200c诱导间充质-上皮转化。(A类)未分化癌细胞系中两种microRNAs（miRNAs）的过度表达可诱导间充质-上皮转化，表现为E-cadherin（绿色）的上调、E-cadherin的部分膜性移位和基底-顶端极性的恢复（见z模式）。miR-200c的作用更强，与ZEB1基因敲除的作用相当。(B类)上图：miR-200c抑制MDA-MB231细胞的迁移。下面板：Matrigel侵入分析的图片和量化。miR-200c转染强烈抑制了MDA-MB231对Matrigel的侵袭，与短干扰（si）RNA介导的ZEB1敲除类似。(C)转染miR-141和miR-200c的miRNA抑制剂的分化癌细胞株显示细胞散射增加、波形蛋白（HPAF2）上调或E-cadherin（DLD1）表达降低。相反，稳定敲除ZEB1（SW480-shZEB1）诱导的上皮表型不能被miRNA抑制剂逆转。sh，短发夹；ZEB1，锌指电子盒绑定同源盒1。

为了进一步解释这两种miRNAs诱导上皮分化的机制，我们使用TargetScan搜索程序，根据保守干环序列的预测mRNA识别序列，搜索假定的靶基因(刘易斯等, 2003). 值得注意的是，miR-200c得分最高的靶基因包括ZEB1号机组和ZEB2型这证实了我们在工作过程中发表的最新研究结果(赫托等, 2007；格雷戈里等, 2008；公园等, 2008). 此外，miR-141的一个假定靶点是TGFβ2，这表明两种miRNAs通过影响同一EMT诱导途径的不同成员而在功能上相连。我们进一步选择了假定的靶因子瘦素受体和cofilin 2，因为它们是已知的恶性肿瘤进展的促进剂(阿图布等, 2000；王等, 2007). 预测的3′非翻译区（UTR）miRNA结合位点在进化过程中高度保守(图4A；补充图3A在线）。我们可以证明，miRNAs的过度表达导致未分化癌细胞中ZEB1、TGFβ2和其他候选基因的表达降低(图4B、C；补充图3B在线）。正如预测的那样，miR-141对TGFβ2和miR-200c对ZEB1表达的抑制作用最强，如RNA和蛋白质水平所示。相反，用miR-200c或miR-141抑制剂治疗分化的癌细胞系HPAF2和MCF7，导致特征基因表达的改变，包括ZEB1和TGFβ2表达的增加(补充图3C在线）。在荧光素酶报告载体中克隆高度保守的mRNA 3′UTR靶序列后，发现miR-200c和miR-141对ZEB1和TGFβ2的表达有负调控。在转染具有减少的ZEB1和增强的两种miRNA表达的SW480 shZEB1克隆后，与shCtl克隆相比，两种报告基因在两个独立的shZEB1克隆中显示出降低的萤光素酶活性(图4D). SW480细胞中miR-141和miR-200c的过度表达分别导致TGFβ2-3′UTR和ZEB1-3′UTR结构活性降低(图4E). 相反，特异性抗miRNAs对SW480 shZEB1细胞中miR-141和miR-200c的选择性抑制分别导致TGFβ2-3′UTR和ZEB1-3′UTR结构活性的选择性增加(补充图3D在线）。

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图4

miR-141和miR-200c减少促进上皮-间质转化和侵袭的因子的表达。(A类)预测TGFβ2 3′UTR与miR-141干环的双重形成，以及两个ZEB1 3′UTR区与miR-200c干环的双相形成。推测的识别位点在不同物种中高度保守。(B类)实时反转录–在未分化癌细胞中转染指示的miRNA或短干扰（si）RNA后，对各种可能的靶因子进行PCR。注意，miR-141转染后TGFβ2的表达和miR-200c转染后ZEB1的表达最强。(C)通过免疫印迹法确认蛋白质水平的结果。(D类)荧光素酶报告子分析显示，与shCtl克隆相比，所示SW480短发夹ZEB1（shZEB1）克隆中的3′UTR-荧光素酶报告子结构活性降低，miR-141和miR-200c水平增加。(E类)SW480细胞中miR-141和miR-200c的过度表达分别导致TGFβ2 3′UTR-荧光素酶和ZEB1 3′UTR荧光素酶结构体的活性降低。(F类)连接ZEB1和反作用miRNA，特别是miR-200c的前馈回路的模型。当ZEB1和两个miRNAs相互抑制时，它们在一个前馈回路中相连。根据初始信号，这个环路可以稳定间充质或上皮分化。在肿瘤中，环境TGFβ可以触发ZEB1的上调，促进肿瘤细胞的自我增强循环，最终导致EMT和侵袭。一旦最初的信号中断，环路可能会诱导上皮表型的逆转。这可能解释了单个肿瘤和转移瘤中常见的强烈表型异质性。EMT，上皮-间质转化；MET，间充质-上皮转化；miRNA，microRNA；转化生长因子；UTR，非翻译区；ZEB1，锌指电子盒绑定同源盒1。

讨论

通过对各种人类肿瘤细胞进行miRNA表达阵列筛选，我们检测到一些被EMT诱导物ZEB1抑制的miRNA。最显著的影响是miR-200家族成员。ZEB1通过结合其假定启动子中至少两个高度保守的位点，直接抑制与人类12号染色体紧密相连的两个成员miR-141和200c的转录。与我们工作过程中公布的数据相一致(赫托等, 2007；格雷戈里等, 2008；公园等, 2008)检测到的miRNAs可诱导间充质细胞向上皮细胞转化（MET），并抑制未分化癌细胞的EMT、迁移和侵袭。我们进一步确定了可能的靶基因，它们是已知的EMT和恶性肿瘤进展的启动子。miR-200c的一个靶点是ZEB1本身，这表明在侵袭癌细胞时存在EMT增强的前馈回路。miR141的下调可能会进一步稳定这个调节环，因为其假定靶点之一是TGFβ2。越来越多的证据表明，ZEB1对恶性肿瘤进展的各种过程具有关键作用(佩纳多等, 2007)并促进转移(斯帕德纳等, 2008). 鉴于ZEB1和其他EMT诱导剂（如Snail）的重要作用(奥利米达等, 2007)，扭转(杨等, 2004)我们的数据表明，ZEB1通过抑制特定miRNAs促进EMT稳定前馈回路，为这些过程的分子机制提供了功能证据。

我们的工作解决了与临床相关的问题，即假定的肿瘤抑制miRNAs如何在癌症进展中失活。事实上，ZEB1结合位点和miR-200c基因和miR-141型从斑马鱼到人类，脊椎动物中的基因高度保守，这表明肿瘤细胞使用了长期以来建立的miRNA表达调控机制。此外，人类染色体1p36上miR-200家族的第二个miRNA簇也在上游序列中包含高度保守的ZEB1结合位点，这表明整个miR-200基因家族可以被ZEB1抑制(补充图3E在线）。此外，在胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌等各种重要肿瘤实体的肿瘤细胞系中检测到ZEB1对这两种miRNAs的强烈转录抑制及其假定的抑瘤作用。高侵袭性基底型乳腺癌中两种miRNAs均缺失，这一事实表明了其临床相关性，与管腔型和导管型浸润性乳腺癌相比，该型乳腺癌分化较差，雌激素和孕酮受体不表达，临床预后较差(森佩雷等, 2007).

这两种miRNAs都影响不同分子的表达，这些分子都以相同的促侵袭方式起作用，TGFβ2、ZEB1、cofilin和瘦素受体就是这样。这两种miRNA的差异功能可以协同作用，因为它们是共表达的，可能是通过共同启动子的共同激活。有趣的事实是，这两种miRNAs都抑制其自身抑制途径的成员：miR-200c靶向ZEB1，miR-141靶向TGFβ2。因此，ZEB1成为一个关键的调节器，因为它在癌症中的异常表达可能通过下调其自身抑制剂miR-141和miR-200c来启动自我增强前馈循环(图4F). 此外，如果初始信号中断（例如，肿瘤环境TGFβ），这样的环路也可能重新加强miRNAs的表达，从而重新诱导上皮表型。这可能解释了单个肿瘤和转移瘤中常见的强烈表型异质性。最近，线路接口单元等(2008)表明ZEB1在器官发育的各个阶段对TGFβ介导的EMT至关重要。ZEB1的这一重要作用指出，预测的调节环也可能在发育和器官发生中分离间充质和上皮组织的生理作用。

总之，我们认为ZEB1通过减少mRNAs和miRNAs的转录，是肿瘤进展的关键促进剂。因此，ZEB1是miRNA-介导前馈环的一个中心分子调节器，可以重新加强EMT。

方法

miRNA表达微阵列筛选。总RNA的50μg部分，包括从4×10分离的小RNA⁷使用Trizol试剂的细胞（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）被运送到Capital Bio（中国北京）。使用CapitalBio哺乳动物miRNA阵列V2.0进行表达筛选，该阵列包含743个人类、大鼠和小鼠非冗余miRNA探针。微阵列数据已存放在ArrayExpress上(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)登录代码为E-TABM-461。

DNA构建。对于hsa-miR-200c启动子报告质粒核苷酸−683到−67，对于间隔报告质粒核苷酸+66到+403（相对于miR-200c茎环的第一个核苷酸）被克隆到pGL3basic（德国曼海姆普罗米加）。对于3′UTR报告质粒，在pMIR-REPORT载体（Ambion，Austin，TX，USA）中荧光素酶基因下游扩增并克隆了人类ZEB1互补DNA的核苷酸+3399至+3953和人类TGFβ2 cDNA的核苷酸+1427至+1695。

细胞培养和标准分析。所有细胞系均购自ATCC（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）。如前所述，进行标准细胞培养、瞬时转染、报告试验、电迁移率变化试验、免疫印迹、瞬时短干扰RNA（siRNA）介导的敲除和定量实时反转录-PCR(布拉布莱茨等, 1999,2004；赫卢贝克等, 2001). TGFβ/TNFα刺激3×10⁴每孔细胞接种在12孔板中，在第1天转染，并用2 ng/ml TGFβ和10 ng/ml TNFα刺激5天。

特定分析。 miRNA调节：共5×10⁴将每个孔的细胞接种在12孔板中。24小时后，用30 pmol寡核苷酸转染细胞，用于miR-141、miR-200c或对照miRNA-16（Ambion，Austin，TX，USA），使用Oligowetamine™试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA。细胞培养数天后再继续使用。如前所述，使用Chemicon Cell invasion Assay Kit（Chemicon International，Millipore，Schwalbach，Germany），使用20000个瞬时（miRNA或siRNA）转染细胞评估细胞侵袭。

细胞迁移分析：如前所述，用miRNAs和对照物转染细胞（Spaderna等, 2006). 在达到汇合点后，用移液管尖端划伤细胞，观察50小时内的迁移电位。

miRNA的实时定量PCR：使用米尔Vana™PARIS™套件（美国德克萨斯州奥斯汀Ambion）。使用FFPE总核酸分离试剂盒（Ambion，Austin，TX，USA）对从爱尔兰根大学病理学系档案中检索到的福尔马林固定石蜡包埋乳腺癌样品进行显微切割后提取总RNA。使用TaqMan进行特定定量实时PCR实验^®在罗氏LightCycler 480上对miR-141、miR-200c和对照miRNA-16（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行微RNA分析。

ChIP分析：根据制造商的说明应用ChIP IT套件（Active Motif，Carlsbad，CA，USA）。使用3μg的对照兔抗血清或抗ZEB1抗血清进行免疫沉淀。

有关本研究中使用的寡核苷酸序列、质粒和抗体，请参阅补充信息在线数据。

补充信息位于EMBO报告联机(http://www.emboreports.org).

补充材料

致谢

脚注

工具书类